CN103074229A - 聚乙二醇作为喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇作为喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用方法；属于细菌保藏技术领域。将聚乙二醇溶液与喜温硫杆菌菌悬液混合，得到混合液用于冷冻保存；所述的聚乙二醇的分子量为2000、12000或20000，聚乙二醇在混合液中的浓度为10%～50%（w/v）。在液氮保藏喜温硫杆菌时，保护剂聚乙二醇的保藏效果明显优于甘油，因此，在液氮保藏喜温硫杆菌菌株时，添加聚乙二醇作为保护剂可以有效提高喜温硫杆菌的存活率。

Description

聚乙二醇作为喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用方法
技术领域
本发明属于细菌保藏技术领域，具体涉及聚乙二醇作为喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用方法。
背景技术
喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)中唯一的适度嗜热菌，嗜酸好氧，是一种化能自养的革兰氏阴性菌，以元素硫(S0)或金属硫化矿(S2-)为能量来源，以空气中的CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养物质合成菌体细胞，广泛分布于金属硫化矿及煤矿矿坑的酸性水中。自1994年由HALLBERG和LINDSTROM分离、鉴定以来，随着人们对其浸矿作用的不断认识，该菌在硫化矿生物浸出，特别是在金属硫化精矿高温生物浸矿反应器中的应用越来越广泛。国内外研究人员一直有对该菌进行研究和选育工作，然而，在获得具有优良性状的菌株之后，菌种资源的保藏工作是必不可少的。研究结果表明：频繁传代保藏会使微生物发生突变，活性降低，出现退化现象。
目前液氮保藏是公认的一种长期保持微生物菌种的最安全、可靠的方法，其中保护剂的选择与使用对于微生物菌株冷液氮保藏的存活率有较大的影响。保护剂可改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止因冷冻干燥和复水对细胞造成的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。选择得当的保护剂是提高微生物液氮保藏存活率、延长菌种保藏期的关键因素。甘油是液氮保藏微生物最常用的保护剂，该保护剂可以有效地保护大部分的微生物。但是在液氮保藏喜温硫杆菌过程中，该保护剂却不能为其提供有效的保护，因为复苏后喜温硫杆菌的存活率约为40.1%。因此，需要一种能用来有效保护喜温硫杆菌的冷冻保护剂来液氮保藏喜温硫杆菌，从而提高其存活率。
发明内容
本发明的目的在于针对一般的冷冻保护剂不能有效地冷冻保护喜温硫杆菌，从而提供一种将聚乙二醇作为新型的喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用。
本发明所采取的技术方案是：
聚乙二醇作为喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用方法，将聚乙二醇溶液与喜温硫杆菌菌悬液混合，得到混合液用于冷冻保存；所述的聚乙二醇的分子量为2000、12000或20000，聚乙二醇在混合液中的浓度为10%～50%（w/v）；
所述的聚乙二醇的分子量优选为2000，聚乙二醇在混合液中的浓度优选为10-40%（w/v）；进一步优选浓度为30%（w/v）。
具体操作如下：
将待保藏的菌种制成菌悬液，按1:1的体积比加入到聚乙二醇溶液中，混匀，然后分装加入冷冻管中；
将冷冻管放入4°C平衡两小时，-20°C预冻两个小时，后将冷冻管移至-70°C的低温冰箱中两小时，最后将冷冻管放入-150°C～-196°C的液氮罐中保藏。
本发明的冷冻保护剂聚乙二醇,在液氮保藏喜温硫杆菌时，使得喜温硫杆菌的存活率比传统的冷冻保护剂甘油提高了2～3倍。因此，在液氮保藏喜温硫杆菌菌株时，添加聚乙二醇作为保护剂可以有效提高喜温嗜酸硫杆菌的存活率。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，具体描述本发明，但本发明不仅限于此。
本发明中的聚乙二醇购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
以下实施例中，喜温硫杆菌菌株（S1，D1，S2）由中南大学生物冶金教育部重点实验室提供。
实施例1
将三株经过鉴定的喜温硫杆菌菌株（S1，D1，S2）分别培养至对数生长中期，过滤去除硫粉，在10000r/min条件下离心20min收集菌体，用稀硫酸(pH=2.0)清洗菌体2次，弃去上清液，将菌泥用无菌水悬浮。
冷冻管的制备：将获得的菌悬液（浓度为2×1010个/mL）分别按1:1的体积比加入到不同的保护剂溶液中，混匀，然后分装加入冷冻保藏管中。保护剂的浓度如下表1所示：
表1：保护剂浓度的配制
无菌的保护剂浓度 20% 40% 60% 80% 100%
保护剂体积 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
菌悬液体积 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
混匀后保护剂浓度 10% 20% 30% 40% 50%
然后将冷冻保藏管放入4°C平衡两小时，-20°C预冻两个小时，后将冷冻保藏管移至-70°C的低温冰箱中两小时，后将冷冻保藏管放入-150°C～-196°C的液氮罐中保藏。保藏一段时间后，从液氮罐中取出，迅速放入37°C的水浴中，10min完全解冻后，12000rpm离心3min,去除保护剂，加入1mlpH为2.5无菌的蒸馏水用枪吸打重悬，再次12000rpm离心3min,弃上清，洗涤2～3次。混匀后连续稀释计数，计算其存活率。结果如下表2、表3、表4所示:
表2：添加不同浓度的冷冻保护剂对喜温硫杆菌S1液氮保藏存活率的影响
Figure BDA00002623928500041
表3：添加不同浓度的冷冻保护剂对喜温硫杆菌S2液氮保藏存活率的影响
表4：添加不同浓度的冷冻保护剂对喜温硫杆菌D1液氮保藏存活率的影响
Figure BDA00002623928500043
表5：添加常用的冷冻保护剂甘油对三株喜温硫杆菌液氮保藏存活率的影响
Figure BDA00002623928500051
由表2～4可知，保护剂聚乙二醇可以在液氮保藏喜温硫杆菌过程中为其提供很好的保护作用，尤其是浓度为30%的聚乙二醇2000效果最佳，三株喜温硫杆菌菌株（S1，D1，S2）的存活率分别高达90.71%，98%,87.59%。其平均存活率高达92.1%。
由表5可知，甘油作为一种常用的冷冻保护剂在液氮保藏喜温硫杆菌时，效果不是很好，平均存活率只有40.1%。
可见在液氮保藏喜温硫杆菌时，保护剂聚乙二醇的保藏效果明显优于甘油，因此，在液氮保藏喜温硫杆菌菌株时，添加聚乙二醇作为保护剂可以有效提高喜温硫杆菌的存活率。

Claims (4)

1.聚乙二醇作为喜温硫杆菌冷冻保护剂的应用方法，其特征在于，将聚乙二醇溶液与喜温硫杆菌菌悬液混合，得到混合液用于冷冻保存；所述的聚乙二醇的分子量为2000、12000或20000，聚乙二醇在混合液中的浓度为10%～50%（w/v）。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量为2000，聚乙二醇在混合液中的浓度为10-40%（w/v）。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的聚乙二醇2000在混合液中的浓度为30%（w/v）。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用方法，其特征在于，
（1）将待保藏的菌种制成菌悬液，按1:1的体积比加入到聚乙二醇溶液中，混匀，然后分装加入冷冻管中；
（2）将冷冻管放入4°C平衡两小时，-20°C预冻两个小时，后将冷冻管移至-70°C的低温冰箱中两小时，最后将冷冻管放入-150°C～-196°C的液氮罐中保藏。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923908A (zh) * 2014-05-07 2014-07-16 天津市林业果树研究所 一种食用菌固定化菌种的制备及其保藏方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1305705A (zh) * 2001-01-08 2001-08-01 卢杲 一种长期保存地球所有物种基因和生物样品的方法
CN101012441A (zh) * 2006-09-28 2007-08-08 中南大学 一种分离嗜温硫氧化硫化杆菌的方法
CN102625831A (zh) * 2009-07-20 2012-08-01 通用医院公司以麻省总医院名义经营 提高低温保存细胞生活力的方法和组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1305705A (zh) * 2001-01-08 2001-08-01 卢杲 一种长期保存地球所有物种基因和生物样品的方法
CN101012441A (zh) * 2006-09-28 2007-08-08 中南大学 一种分离嗜温硫氧化硫化杆菌的方法
CN102625831A (zh) * 2009-07-20 2012-08-01 通用医院公司以麻省总医院名义经营 提高低温保存细胞生活力的方法和组合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NORIO WAKAO ET AL.: "Survival of freeze-dried thiobacillus ferrooxidans NCBI 8455 after long-term storage", 《J.GEN.APPL.MICROBIL.》, vol. 36, 31 December 1990 (1990-12-31) *
WEI-MIN ZENG 等: "Preservation of Acidithiobacillus caldus: A moderately thermophilic bacterium and the effect on subsequent bioleaching of chalcopyrite", 《HYDROMETALLURGY》, vol. 96, 25 November 2008 (2008-11-25) *
张凯: "枯草芽孢杆菌Bs-208制剂保护剂研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑D046-127》, 15 February 2008 (2008-02-15) *
张英华 等: "乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选", 《食品科技》, no. 11, 20 November 2006 (2006-11-20) *
朱东升 等: "嗜酸乳杆菌冷冻干燥过程中保护剂的筛选及液氮预冻", 《食品科学》, vol. 31, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923908A (zh) * 2014-05-07 2014-07-16 天津市林业果树研究所 一种食用菌固定化菌种的制备及其保藏方法

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