发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种丹参、三七复方的纳米混悬剂,该纳米混悬剂中的有效成分能透过体内生物屏障,显著提高药物的生物利用度,充分发挥治疗作用。
本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种治疗中风的丹参、三七复方的纳米混悬剂,该纳米混悬剂由有效成分和辅料组成,其特征在于,
所述的有效成分的用量为0.28~2.65w%,且由丹酚酸B8~27w%、丹参酮IIA5~15w%和三七总皂苷58~84w%组成;其中所述的三七总皂苷中含有,三七皂苷R15~27w%,人参皂苷Rg120~50w%,人参皂苷Rb120~40w%;
所述的辅料的用量为97.35~99.72w%,且由复合乳化剂0.47~0.8w%、聚乳酸-羟基乙酸共聚物0.6~2.85w%、聚乙烯醇1.1~1.9w%和水94.5~97.8w%组成;
所述的纳米混悬剂采用W/O/W复乳法制成,所述的W/O/W复乳中,油相由丹酚酸B、丹参酮IIA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和复合乳化剂混合组成,内水相由三七总皂苷溶于水形成,外水相由聚乙烯醇溶于水形成;所述的复合乳化剂由质量比为油酸聚乙二醇甘油酯︰司盘-80=5︰1~1︰2的油酸聚乙二醇甘油酯和司盘-80组成。
本发明所述的纳米混悬剂中,所述的复合乳化剂最佳方案由质量比为油酸聚乙二醇甘油酯︰司盘-80=1︰1的油酸聚乙二醇甘油酯和司盘-80组成。
上述纳米混悬剂的制备方法包括以下步骤:
(A)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中混均制得油相;将三七皂总苷溶于水制得内水相;将聚乙烯醇溶于水制得外水相;其中所述的有机溶剂由二氯甲烷60~90v%和乙酸乙酯10~40v%组成;
(B)先将所述的内水相加入油相制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相制成W/O/W型复乳,然后挥去有机溶剂,即得。
为了更利于所述纳米混悬剂的制备,上述制备方法的改进方案还包括稀释的步骤,即所述的步骤(B)在挥去有机溶剂前先将所得的W/O/W型复乳转移至另配的质量浓度为1%的聚乙烯醇水溶液中稀释。
为了去除所述纳米混悬剂中析出的脂溶性成分,提高药物的安全性,上述纳米混悬剂的制备方法的进一步改进方案还包括离心纯化步骤,即,所述的步骤(B)在挥去有机溶剂后,1000~10000r/min离心分层,取上层即得所述纳米混悬剂。
本发明所述的纳米混悬剂可按常规的方法采用微孔滤膜过滤除菌后制成注射液,也可以按常规的方法进行冷冻干燥制成粉针剂。
本发明所述纳米混悬剂所含的丹参酮IIA、丹酚酸B、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等多种药物成分,理化性质各不相同。其中,丹参酮IIA为水难溶性成分,置于油相有利于药物分散在油中并被外水相保护;丹酚酸B虽为水溶性成分,实验发现若将其置于内水相,药物将很快扩散进入外水相,包封率低,故将其放入油相,在所述乙酸乙酯和二氯甲烷比例中,丹酚酸B能较好分散,且不易扩散进入外水相,包封率高;三七皂苷类为水溶性成分,将其置于内水相有利于其分散在内水相中而被油相保护,从而形成的纳米混悬剂将性质各异的各类药物成分装载,不仅能充分发挥复方多成分的配伍协同作用,而且能促进药物穿过体内生物屏障(血脑屏障),提高其局部生物利用度,具有显著的治疗优越性。
此外,本发明所述的复合乳化剂特异性地选择油酸聚乙二醇甘油酯与司盘-80复配,显著提高了包封率,从而更进一步改善了药物的生物利用度。
具体实施方式
下述实施例1~3所用丹酚酸B和丹参酮IIA购自深圳美荷生物有限公司,其中,所述丹酚酸B的纯度≥95%,所述丹参酮IIA的纯度≥98%。下述实施例1所用三七总皂苷购自成都曼思特生物科技有限公司,生产批号为080823,其中含,三七皂苷R126.1%,人参皂苷Rg136.5%,人参皂苷Rb131.8%;下述实施例2所用三七总皂苷购自昆明骏兴科技开发有限公司,生产批号为091017,其中含,三七皂苷R15.2%,人参皂苷Rg120.1%,人参皂苷Rb139.6%;下述实施例3所用三七总皂苷购自四川杰象药材原料有限公司,生产批号为100311,其中含,三七皂苷R110.1%,人参皂苷Rg149.6%,人参皂苷Rb120.2%。
例1
1、处方
(1)有效成分:取丹酚酸B18mg,丹参酮IIA10mg,三七总皂苷40mg。
(2)辅料:油酸聚乙二醇甘油酯50mg,司盘-8050mg,PLGA(LA/GA=50:50)125mg,PVA4-88229mg,水20ml。
2、制备方法
(1)制备复合乳化剂
取油酸聚乙二醇甘油酯和司盘-80涡旋混匀,即可。
(2)纳米混悬剂
(2.1)将制备的复合乳化剂加入由二氯甲烷0.7ml和乙酸乙酯0.3ml组成的有机溶剂中,涡旋混匀;
(2.2)另取PVA169mg溶于16.9ml水中,制成质量浓度为1%的PVA水溶液;
(2.3)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中超声作用混均制得油相;将三七皂总苷溶于0.1ml水制得内水相;将PVA60mg溶于3ml水制得外水相;
(2.4)先将所述的内水相加入油相,超声作用制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相,超声作用制成W/O/W型复乳,然后,将所制得的W/O/W型复乳转移至步骤(2.2)另配的PVA水溶液中稀释,挥去有机溶剂后,8000r/min离心分层,取上层即得纳米混悬剂。
例2
1、处方
(1)有效成分:取丹酚酸B5mg,丹参酮IIA5mg,三七总皂苷50mg。
(2)辅料:油酸聚乙二醇甘油酯83mg,司盘-8017mg,PLGA(LA/GA=75:25)150mg,PVA5-88380mg,水20ml。
2、制备方法
(1)制备复合乳化剂
取油酸聚乙二醇甘油酯和司盘-80涡旋混匀,即可。
(2)纳米混悬剂
(2.1)将制备的复合乳化剂加入由二氯甲烷0.9ml和乙酸乙酯0.1ml组成的有机溶剂中,涡旋混匀;
(2.2)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中超声作用混均制得油相;将三七皂总苷溶于0.5ml水制得内水相;将PVA380mg溶于19.5ml水制得外水相;
(2.3)先将所述的内水相加入油相,超声作用制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相,超声作用制成W/O/W型复乳,挥去有机溶剂后,2000r/min离心分层,取上层即得纳米混悬剂。
例3
1、处方
(1)有效成分:取丹酚酸B40mg,丹参酮IIA20mg,三七总皂苷280mg。
(2)辅料:油酸聚乙二醇甘油酯35mg,司盘-8065mg,PLGA(LA/GA=80:20)360mg,PVA17-88226mg,水12ml。
2、制备方法
(1)制备复合乳化剂
取油酸聚乙二醇甘油酯和司盘-80涡旋混匀,即可。
(2)纳米混悬剂
(2.1)将制备的复合乳化剂加入由二氯甲烷0.6ml和乙酸乙酯0.4ml组成的有机溶剂中,涡旋混匀;
(2.2)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中超声作用混均制得油相;将三七皂总苷溶于0.7ml水制得内水相;将PVA226mg溶于11.3ml水制得外水相;
(2.3)先将所述的内水相加入油相,超声作用制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相,超声作用制成W/O/W型复乳,挥去有机溶剂后,即得纳米混悬剂。
例4(乳化剂对包封率影响的研究)
1、实验样品
实验组1为实施例1所制得的纳米混悬剂。
实验组2为实施例2所制得的纳米混悬剂。
实验组3为实施例3所制得的纳米混悬剂。
对照组1为下述方法所制得的纳米混悬剂:
1.1、处方
(1)有效成分:取丹酚酸B18mg,丹参酮IIA10mg,三七总皂苷40mg。
(2)辅料:油酸甘油酯50mg,司盘-8050mg,PLGA(LA/GA=50:50)125mg,PVA4-88229mg,水20ml。
1.2、制备方法
(1)制备复合乳化剂
取油酸甘油酯和司盘-80涡旋混匀,即可。
(2)纳米混悬剂
(2.1)将制备的复合乳化剂加入由二氯甲烷0.7ml和乙酸乙酯0.3ml组成的有机溶剂中,涡旋混匀;
(2.2)另取PVA169mg溶于16.9ml水中,制成质量浓度为1%的PVA水溶液;
(2.3)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中超声作用混均制得油相;将三七皂总苷溶于0.1ml水制得内水相;将PVA60mg溶于3ml水制得外水相;
(2.4)先将所述的内水相加入油相,超声作用制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相,超声作用制成W/O/W型复乳,然后,将所制得的W/O/W型复乳转移至步骤(2.2)另配的PVA水溶液中稀释,挥去有机溶剂后,8000r/min离心分层,取上层即得纳米混悬剂。
对照组2为下述方法所制得的纳米混悬剂:
1.1、处方
(1)有效成分:取丹酚酸B5mg,丹参酮IIA5mg,三七总皂苷50mg。
(2)辅料:油酸聚乙二醇甘油酯100mg,PLGA(LA/GA=75:25)150mg,PVA5-88380mg,水20ml。
1.2、制备方法
(2.1)将油酸聚乙二醇甘油酯加入由二氯甲烷0.9ml和乙酸乙酯0.1ml组成的有机溶剂中,涡旋混匀;
(2.2)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中超声作用混均制得油相;将三七皂总苷溶于0.5ml水制得内水相;将PVA380mg溶于19.5ml水制得外水相;
(2.3)先将所述的内水相加入油相,超声作用制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相,超声作用制成W/O/W型复乳,挥去有机溶剂后,2000r/min离心分层,取上层即得纳米混悬剂。
对照组3为下述方法所制得的纳米混悬剂:
1.1、处方
(1)有效成分:取丹酚酸B40mg,丹参酮IIA20mg,三七总皂苷280mg。
(2)辅料:司盘-80100mg,PLGA(LA/GA=80:20)360mg,PVA17-88226mg,水12ml。
1.2、制备方法
(2.1)将司盘-80加入由二氯甲烷0.6ml和乙酸乙酯0.4ml组成的有机溶剂中,涡旋混匀;
(2.2)分别,将丹酚酸B、丹参酮IIA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入到用有机溶剂溶解的复合乳化剂中超声作用混均制得油相;将三七皂总苷溶于0.7ml水制得内水相;将PVA226mg溶于11.3ml水制得外水相;
(2.3)先将所述的内水相加入油相,超声作用制成W/O型初乳,再将初乳加入外水相,超声作用制成W/O/W型复乳,挥去有机溶剂后,即得纳米混悬剂。
2、实验方法
分别取上述三个实验组和三个对照组的纳米混悬剂,采用反透析法按下述步骤测定包封率:
(1)将纳米混悬剂用等量0.2%SDS的生理盐水稀释作为重建液;
(2)取透析袋,分别取重建液25mL置于透析袋外,制备浓度为0.2%的SDS生理盐水2mL置于透析袋内,平衡12小时,取透析袋内溶液过滤后,高效液相进样测定游离药物浓度C游离;
(3)另取1mL重建液,加适量乙腈溶解,再用适量甲醇稀释定容至5mL,高效液相进样测定重建液中药物总浓度C总;
(4)采用下式计算包封率:
3、实验结果
将实验方法中所获得的各样品的包封率(以其中成分最低包封率计)见表1。
表1乳化剂对包封率影响
实验组2 |
25.13 |
实验组3 |
23.59 |
对照组1 |
11.23 |
对照组2 |
16.89 |
对照组3 |
8.53 |
4、结论
由表1可见,三个实验组的包封率均高于对照组,结果显示本发明特异性地选择油酸聚乙二醇甘油酯与司盘-80复配获得的复合乳化剂的包封率既高于单一油酸聚乙二醇甘油酯和单一司盘-80的乳化剂,也高于与油酸聚乙二醇甘油酯同类的油酸甘油酯,这说明本发明所述的复合乳化剂对提高所得纳米混悬剂的包封率作出了积极的贡献。
例5(形态考察)
取实施例1所制备的纳米混悬剂适量,将其均匀分散在样品台上,喷金后用透射电镜放大观察干态纳米粒的球形及分散性,结果见图1。由图1可见,本发明所述纳米混悬剂中的纳米粒表面光滑,形态圆整,分散性良好,粒径分布均匀,可避免在药物释放过程中出现突释,使释药过程相对平稳。
例6(粒径测定)
取实施例1所制备的纳米混悬剂适量加水稀释50倍,用纳米粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径及粒径分布,结果见图2。由图2可见,本发明所述纳米混悬剂中的纳米粒的粒径分布呈较窄的单峰,且呈正态分布,多分散指数(polydispersity indices,PDI)为0.007,平均粒径为154nm。
例7(Zeta电位测定)
取实施例1所制备的纳米混悬剂适量加水稀释50倍,用Zeta电位仪测定其Zeta电位,结果纳米粒的Zeta电位为﹣44mV。纳米粒的高电荷性有利于剂型的稳定,因为表面电荷产生的库伦斥力能克服纳米粒之间的范德华吸引力,防止胶体沉降和老化,而一般胶体注射剂的理想稳定值的绝对值>30mV。实验表明本发明制备的纳米混悬剂具有较高的稳定性。
例8(生物利用度对比实验)
1、实验样品
本例中,实验组1-3和对照组1-3所用实验样品与上述实施例4中实验组和对照组所用实验样品对应相同,并在注射给药前采用0.45μm微孔滤膜过滤;对照组4所用实验样品是按公开号为CN101084997的专利申请制备出该申请所述冷冻干粉针剂,加注射用蒸馏水溶解即得。
2、实验方法
取体质量250-300g豚鼠,随机分成7组,即:鼓室注射实验组1、鼓室注射实验组2、鼓室注射实验组3、鼓室注射对照组1、鼓室注射对照组2、鼓室注射对照组3、鼓室注射对照组4,每组3只。腹腔注射乌拉坦溶液将豚鼠麻醉,每组注射0.2ml,给药后于0.17,0.5,1,2,3,4,6,8,10,12,18,24,36h分别取血、脑脊液和脑组织。
样品的采集和处理:从第四脑室抽取脑脊液;从心脏取血,全血置肝素化塑料离心管中,离心分离得到血浆;脑组织精密称定质量,加适量生理盐水匀浆。将所得脑脊液加适量甲醇,涡旋混匀,离心后取上清液进高效液相测定;取脑组织匀浆液加3倍量甲醇,涡旋混匀,离心后取上清液于氮气流下挥干,残渣用适量甲醇复溶,离心后取上清液进高效液相测定。取血浆加入10%盐酸适量,混匀,再加入乙酸乙酯适量,涡旋混匀,离心后取上层有机相,将下层再按前述方法重新萃取一次,合并两次萃取的有机相,于氮气流下挥干,残渣用甲醇复溶,离心后取上清液进高效液相测定。采用DAS3.1.1版药动学统计软件以非房室模型测定五种有效成分经静脉和鼓室给药后在脑脊液、脑组织和血浆中的AUC(药时曲线下面积)。
3、实验结果
实验结果见表2~8。由表可知,各组纳米混悬剂和冻干粉针剂经鼓室注射后,实验组1、2、3和对照组1、2、3的脑部AUC均高于对照组4,说明包封丹酚酸B、丹参酮IIA和三七总皂苷有利于提高药物的脑部生物利用度;且实验组AUC高于对照组,说明选择复合乳化剂及包封效果越好时越能增加药物在脑内的分布,提高其局部生物利用度。
4、结论
包封丹酚酸B、丹参酮IIA和三七总皂苷有利于提高脑部的局部生物利用度,发明所述的复合乳化剂也对提高脑部生物利用度做出了积极的贡献。
表2鼓室注射实验组1各组织中的AUC
表3鼓室注射实验组2各组织中的AUC
表4鼓室注射实验组3各组织中的AUC
表5鼓室注射对照组1各组织中的AUC
表6鼓室注射对照组2各组织中的AUC
表7鼓室注射对照组3各组织中的AUC
表8鼓室注射对照组4各组织中的AUC
例9(药效学研究)
1、受试动物及其分组
取体质量250-300g豚鼠,随机分成6组,即:假手术组、模型组、静脉注射粉针剂组、静脉注射纳米混悬剂组、鼓室注射粉针剂组以及鼓室注射纳米混悬剂组。
2、受试药物
静脉注射纳米混悬剂组和鼓室注射纳米混悬剂组:取实施例1所制得的纳米混悬剂,0.45μm微孔滤膜过滤。
静脉注射粉针剂组和鼓室注射粉针剂组:所用实验样品是按公开号为CN101084997的专利申请制备出该申请所述冷冻干粉针剂,加注射用蒸馏水溶解即得。
2、药效实验
(1)建立动物模型的方法
采用双侧颈总动脉阻断合并硝普钠降压法制备豚鼠脑缺血再灌注损伤模型。豚鼠腹腔注射乌拉坦麻醉后,仰卧位固定于试验台上,颈部除毛,75%酒精消毒颈部皮肤。下颈正中呈倒“T”切开,分离两侧颈总动脉,显微动脉夹夹闭两侧颈总动脉同时注射硝普钠(2.2mg/kg),缺血2h后取下显微动脉夹,缝合伤口,再灌注24h,完成造模。在缺血及再灌注期间用40w台灯照射使豚鼠体温保持在37℃左右。除假手术组外,其它各组的实验豚鼠均按上述方法建立脑缺血/再灌注损伤的模型。
(2)实验方法及结果
假手术组:麻醉及手术过程与模型组相同,但不阻断颈总动脉、不注射硝普钠,只分离颈总动脉;静脉注射粉针剂组和鼓室注射粉针剂组:再灌注24h且同时分别静脉和鼓室注射冻干粉针剂(每组注射0.2ml);静脉注射纳米混悬剂组和鼓室注射纳米混悬剂组:再灌注的同时分别静脉和鼓室注射纳米混悬剂(每组注射0.2ml)。灌注24h后处死豚鼠,心脏取血。将采取的血样在温室下放置30min,待血液凝固后离心取上清液即血清,-20℃保存待测;打开豚鼠颅骨,迅速分离出脑组织,用生理盐水冲洗后称重。加生理盐水制得10%的脑组织匀浆,离心后取上清液,-20℃保存待测。测定血清和脑组织中超氧化物酶(SOD),丙二醛(MDA)和一氧化氮合成酶(NOS)的水平。
脑缺血再灌注损伤的发病机制包括兴奋性中毒、氧化应激、细胞内钙离子超载和细胞凋亡等,目前的研究证实氧化应激起关键性的作用。大脑氧化应激的重要指标为超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮合酶(NOS),它们可从受伤的脑细胞中释放进入血液,因此,其在血清和脑组织中的水平是评价大脑缺血再灌注损伤的可信指标。
结果发现,纳米混悬剂能使豚鼠脑和血清中SOD升高(p<0.01)(p是一个统计学概念,当p<0.01时,代表两者有显著性差异),NOS(p<0.01)和MDA(p<0.01)降低(表9、10),说明纳米混悬剂能够显著改善脑缺血再灌注引起的损伤;而且实验结果还表明,纳米混悬剂的作用较粉针剂更显著(p<0.01),说明纳米混悬剂能有效促进药物进入脑部,提高药物疗效。
表9不同实验组的血清中SOD、NOS和MDA值(n=6)
注:模型组与假手术组比较*P<0.01,静脉注射纳米混悬剂组与静脉注射粉针剂组比较
#P<0.01,鼓室注射纳米混悬剂组与鼓室注射粉针剂组比较
表10不同实验组的脑匀浆中SOD、NOS和MDA值(n=6)
注:模型组与假手术组比较*P<0.01,静脉注射纳米混悬剂组与静脉注射粉针剂组比较#P<0.01,鼓室注射纳米混悬剂组与鼓室注射粉针剂组比较