CN103053427A - 山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，包括（A）催芽；（B）选材；（C）清洗：将步骤（B）整理好的芽用洗衣粉液清洗后，用纱布包裹后，利用自来水持续冲洗2小时，再用1%浓度的消洗灵溶液浸泡30分钟，最后用无菌吸潮纸基本吸干水分；（D）灭菌：将经步骤（C）制得的山葵芽茎尖利用70%体积浓度的酒精浸泡28～32秒，然后利用0.2%升汞进行消毒处理，最后用无菌水清洗5次；（E）初代培育。本发明通过山葵种子催芽，切取茎尖培养，获得了85%的无菌成苗率，并经过后续扩大试验的验证，这是山葵外植体初代培养的一个极大突破。

Description

山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法
技术领域
本发明涉及农业领域中的幼苗培育方法，具体是指山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法。
背景技术
我国山葵产业发展中，墨入病（也称黑心病）是山葵种植最重要的病害，严重时可引起山葵种植的完全失败。已有的研究发现，墨入病是山葵的专有病害，对其他作物不产生危害，也不对人体健康造成不利影响。墨入病是由山葵茎点霉菌( Phoma wasabiae Yokogi )侵入山葵植株体内并主要经维管束传导侵染，严重影响山葵品质和产量，甚至造成山葵绝收。墨入病可以为害山葵的根茎、须根、叶片、叶柄。经日本、台湾、大陆多年的研究，至今未找到根治或有效防治山葵墨入病的药物。所以，对其防治是以预防为主要措施，其中，培育和种植不带墨入病菌的健壮种苗是重中之重。
种苗培育已成为山葵大面积发展的一个主要制约因素。在传统生产上山葵多采用种子繁殖和分株繁殖。山葵是异花授粉植物，因受高山寒冷气候及多雨的影响，媒介昆虫密度低，种子稔实率低，采收后储藏管理及打破休眠处理等技术繁琐困难，一般农户掌握难度较大。同时，山葵种子播种后，发芽率通常只有30%左右，出苗极不整齐，难以大规模培育规格一致的健康壮苗，不能满足山葵大面积种植的需要。山葵种子中，约30%感染有内生性的墨入病病菌，其育成的种苗也带有致病菌并易造成植株间相互传染，严重影响山葵根茎质量。
在实生健康种苗严重不足的情况下，不少生产者采用分株苗进行种植，这带来了更为严重的问题，往往造成墨入病极其严重，山葵根茎绝收，只能采收少量的叶柄叶片，基本没有经济效益。在地种植一年半至两年的山葵植株体内，80%以上都感染了墨入病菌，只是肉眼不一定能辨认。利用成熟植株上的蘖生侧芽分株作为种苗，墨入病极其严重，种植失败是必然的结果。
目前还没有针对性的去除墨入病的种植方法。
发明内容
本发明的目的在于提供山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，培育出壮实、无菌的山葵苗，推广山葵的实际栽培。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，包括以下步骤：
（A）催芽：选择需要进行培养的山葵品种，将种子保持18℃～22℃，湿度为90%，促其发芽；
（B）选材：当山葵种子发芽长度为1～2cm时，切取茎尖，长度为0.3～0.4cm；
（C）清洗：将步骤（B）整理好的芽用洗衣粉液清洗后，用纱布包裹后，利用自来水持续冲洗2小时，再用1%浓度的消洗灵溶液浸泡30分钟，最后用无菌吸潮纸基本吸干水分；
（D）灭菌：将经步骤（C）制得的山葵芽茎尖利用70%体积浓度的酒精浸泡28～32秒，然后利用0.2%升汞进行消毒处理，最后用无菌水清洗5次；
（E）初代培育：将灭菌后的茎尖利用培养基培育成无菌的山葵幼苗。
本发明采用山葵的饱满、健康种子作为培育基础，在源头上大大降低了胚芽被污染的可能性，在室内的稳定培养环境下，山葵种子的发芽率极高，而且其发芽的时间、生长的长度较为均匀，便于选取统一的茎尖，为培育提供了良好的基础；在选取茎尖时，将选取的长度定位0.3～0.4cm，而传统的茎尖培育方法中通常采用的茎尖长度为0.5～0.8cm，在试验中，发明人做了对比试验，统计结果如下：
Figure 291180DEST_PATH_IMAGE001
由于茎尖其长度较大，包含了较多了伸长区和成熟区，长度过大时其灭菌效果不佳，而当茎尖长度小于0.2 cm时，切削的长度难以掌握，因此本发明采用的茎尖只采用分生区和部分伸长区，有利于茎尖的生长，可以提高成活率，也便于选材；本方法的清洗步骤也与传统方法有一定的区别，利用纱布将芽包裹后由自来水冲洗，纱布能够约束芽尖，同时起到保护芽尖的作用，而且纱布的透水性能良好，能够有效保证冲洗的效果；步骤（D）的灭菌步骤与现有技术中的种子灭菌有有巨大区别，在现有技术中，采用酒精浸泡灭菌的方式中，种子的浸泡时间通常是1～3分钟，而本申请的发明人发现现有技术中的浸泡时间对于山葵的灭菌不利，当山葵种子浸泡时间超过1分钟时，种子的死亡率急剧升高，因此，为了得到最佳的灭菌效果，经过上万次的反复试验后，得到了浸泡时间为28～32秒的最佳数据，当少于28秒时，灭菌率只有70%以下，当大于32秒 ，种子开始出现死亡；本发明的技术方案经过多次试验和论证，相对于现有技术而言，克服了目前的茎尖培养不能直接用于山葵繁殖的技术瓶颈，有利于山葵的健康种苗繁殖，适宜大规模的工厂化生产。
所述步骤（E）中培养基及培养条件为：1/2MS培养基，蔗糖30克/升，6-BA0.4mg/L，琼脂6克/升，PH值为5.8，培养室温度18℃，光强度1500-2000LUX。进一步讲，传统的茎尖培养中，并未对PH值有过分析，发明人根据山葵的植物特性进行分析，发现在组织繁育的过程中，培养基的PH值会对增殖系数起到决定性作用，不同PH值条件下转接初代培养所得无菌苗单芽，增殖系数呈曲线分布，发明人将PH值对增值系数的影响绘制成表格，列表分析如下：
Figure 146003DEST_PATH_IMAGE002
从上表分析可以得知：PH值对山葵的组织培养增殖系数具有决定性的影响，当PH为5.7-5.8时，其增殖系数达到较高水平，特别是当PH值为5.8时，其增值系数达到最高值，因此，本发明的PH值采用5.8时，对于山葵的增殖繁育系数最为有利；当PH值远离5.8时，其增殖系数大幅降低。
所述步骤（A）中，还包括对种子消毒处理，采用0.2%升汞进行消毒处理的时间为8～10分钟。进一步讲，为了提高灭菌率，在进行催芽之前就要进行消毒处理，采用0.2%升汞进行消毒处理时间为8～10分钟，对于灭菌时间的选取，发明人做了对比试验，统计结果如下：
Figure 47445DEST_PATH_IMAGE003
从上表可以看出，当消毒处理时间为10分钟时，其效果最佳，为了保证发芽率，可以适当采取8～10分钟为佳。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1本发明山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，采用山葵的饱满、健康种子作为培育基础，在源头上大大降低了胚芽被污染的可能性，在室内的稳定培养环境下，山葵种子的发芽率极高，而且其发芽的时间、生长的长度较为均匀，便于选取统一的茎尖，为培育提供了良好的基础，通过山葵种子催芽，切取茎尖培养，获得了85%的无菌成苗率，并经过后续扩大试验的验证，这是山葵外植体初代培养的一个极大突破；
2本发明山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，茎尖的最佳消毒浸泡时间为28～32秒，当少于28秒时，灭菌率只有70%以下，当大于32秒 ，种子开始出现死亡；本发明的技术方案经过多次试验和论证，相对于现有技术而言，克服了目前的茎尖培养不能直接用于山葵繁殖的技术瓶颈，有利于山葵的健康种苗繁殖，适宜大规模的工厂化生产；
3本发明山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，克服了传统方法采用山葵种子无菌播种，一是灭菌不易彻底，污染率很高的问题；二是种子的萌发率较低，造成很多无效劳动，难以及时、大量地培育出初代无菌苗的问题，实现了山葵种植繁育的工厂化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一
（A）催芽：选择山葵台农2号种子500粒，要求种子饱满、无病虫害，首先利用0.2%升汞进行消毒处理，处理的时间为8～10分钟，将种子保持18℃～22℃，湿度为90%，促其发芽；
（B）当山葵种子发芽长度为1～2cm时，切取茎尖，长度为0.3～0.4cm；
（C）清洗：将整理好的芽用洗衣粉液清洗后，用纱布包裹后，利用自来水持续冲洗2小时，再用1%浓度的消洗灵溶液浸泡30分钟，最后用无菌吸潮纸基本吸干水分；
（D）灭菌：将经步骤（C）制得的山葵芽茎尖利用70%体积浓度的酒精浸泡28～32秒，然后利用0.2%升汞进行消毒处理，最后用无菌水清洗5次；
（E）初代培育：将灭菌后的茎尖利用培养基培育成无菌的山葵幼苗，培养基及培养条件为：1/2MS培养基，蔗糖30克/升，6-BA0.4mg/L，琼脂6克/升，PH值为5.8，培养室温度18℃，光强度1500-2000LUX。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（A）催芽：选择需要进行培养的山葵品种，将种子保持18℃～22℃，湿度为90%，促其发芽；
（B）选材：当山葵种子发芽长度为1～2cm时，切取茎尖，长度为0.3～0.4cm；
（C）清洗：将步骤（B）整理好的芽用洗衣粉液清洗后，用纱布包裹后，利用自来水持续冲洗2小时，再用1%浓度的消洗灵溶液浸泡30分钟，最后用无菌吸潮纸基本吸干水分；
（D）灭菌：将经步骤（C）制得的山葵芽茎尖利用70%体积浓度的酒精浸泡28～32秒，然后利用0.2%升汞进行消毒处理，最后用无菌水清洗5次；
（E）初代培育：将灭菌后的茎尖利用培养基培育成无菌的山葵幼苗。
2.根据权利要求1所述的山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，其特征在于：所述步骤（E）中培养基及培养条件为：1/2MS培养基，蔗糖30克/升，6-BA0.4mg/L，琼脂6克/升，PH值为5.8，培养室温度18℃，光强度1500-2000LUX。
3.根据权利要求1或2所述的山葵种子催芽茎尖灭菌初代培养方法，其特征在于：所述步骤（A）中，还包括对种子消毒处理，采用0.2%升汞进行消毒处理的时间为8～10分钟。
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