CN103044508A - 从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从红霉素发酵液中分离大环内酯类抗生素的结晶硫氰酸红霉素提取方法，属红霉素分离结晶领域。该分离提取方法使用超滤膜过滤，滤液通过纳滤浓缩，浓缩液中的红霉素在碱性条件下转至预溶剂中，分去水相，溶液脱色过滤后加入主溶剂，再加入硫氰酸盐进行结晶，结晶过程中变速流加醋酸溶液，分离结晶液、淋洗、干燥。本发明结晶所得产品中，红霉素A含量高，杂质红霉素B和C含量低，分离提取过程中红霉素破坏少，结晶所得红霉素A收率高。

Description

从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，具体涉及一种从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，特别是采用超滤膜分离发酵液，使用混合溶剂提取结晶硫氰酸红霉素的方法。

背景技术

红霉素是一类大环内酯类抗生素，主要包括红霉素A、红霉素B、红霉素C、红霉素D、红霉素E和红霉素F等6种组份，其中以红霉素A的抗菌活力最强。红霉素通常采用微生物发酵的方法进行生产，发酵液中的红霉素主要以盐的形式存在，目前主要有两种工艺提取发酵液中的红霉素，如下所示：

工艺1：发酵液微滤；滤液树脂除杂；纳滤浓缩结晶；重结晶。

工艺2：发酵液板框过滤；溶媒萃取；萃取液除杂；萃取液结晶。

传统的红霉素发酵液过滤使用微滤膜或板框，过滤精度低，滤液含有大量蛋白和色素，需使用树脂进行净化处理，工艺复杂，生产废水量大。

硫氰酸红霉素结晶，主要使用的溶剂为醋酸丁酯或含有醋酸丁酯的混合溶媒，得到的硫氰酸红霉素中红霉素A含量在80%以下，杂质红霉素B+C大于3.0%，结晶过程总收率小于85%。公开号CN102408462A的发明专利，虽采用丙酮溶解，但溶解后水与丙酮互溶，色素和杂质无法分离，并在酸性条件加水结晶，酸性加剧红霉素破坏，红霉素A收率较低。CN101724000A提到可以采用二氯甲烷和丙酮混合溶剂溶解，降温结晶红霉素，而本发明采用微溶于水的溶剂先溶解，溶解后水相杂质易于分离，再加入主溶剂丙酮，调整溶剂极性后，再结晶硫氰酸红霉素。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中采用微滤膜+树脂或板框+萃取的提取工艺带来的上述问题，提供一种从红霉素发酵液中分离和结晶硫氰酸红霉素的方法。该方法中，红霉素发酵液使用超滤膜过滤、纳滤浓缩结晶提取工艺，使工艺简化，生产环节更加环保，硫氰酸红霉素粗品用预溶剂在碱性条件下溶解，再加入主溶剂调节溶剂极性，所选混合溶剂对红霉素A的选择性好，结晶所得硫氰酸红霉素质量稳定，红霉素A含量达到85%(除特殊说明外，本说明书中浓度单位均为W/W%)，杂质红霉素B+C小于1.5%，结晶过程红霉素A的收率高于90%。

硫氰酸红霉素的结晶过程具体包含以下几步：

1）红霉素发酵液使用10~30%的碱液调节pH7.5~8.5，过滤过程压力控制在0.1~0.3MPa，通过超滤膜过滤，加水透析，超滤膜为孔径5~50nm的有机板式膜，截留分子量为1万以上的蛋白和杂质。

2）滤液进行纳滤浓缩，浓缩采用截留分子量700以上的纳滤膜，纳滤膜采用有机卷式膜，纳滤过程压力为3.5~4.5MPa，pH值控制为6.0~8.0，浓缩液中红霉素浓度1~3g/100ml。

3）浓缩液可以通过两种方式实现红霉素转至预溶剂中。浓缩液流加10~20%硫氰酸盐溶液，结晶粗红霉素硫氰酸盐；或流加5~10%氨水结晶粗红霉素碱。将红霉素盐或碱在碱性条件下溶于预溶剂中，溶解液中红霉素A含量控制在5~25%。或者将浓缩液在碱性条件下萃取到预溶剂中，萃取pH9.8~11.5，温度30~39.5℃，萃取液中红霉素A含量控制在5~25%。该有机溶剂为醋酸戊酯、醋酸丁酯、二氯甲烷其中之一。采用醋酸戊酯溶解时红霉素A浓度5~25%，采用醋酸丁酯溶解时红霉素A浓度5~25%，采用二氯甲烷溶解时红霉素A浓度20~25%。

4）分去水相，加入0.5~2.0%活性炭，搅拌脱色，过滤。

5）脱色液中加入主溶剂丙酮，加入丙酮的量为预溶剂体积的0.5~4倍，所得溶液中丙酮浓度为30~80%(V/V%，以下提到丙酮浓度单位相同)，改变溶剂极性，控制溶剂极性在4.5~5.3间，溶剂极性是结晶高组份硫氰酸红霉素的关键点。

6）结晶：向加入了主溶剂的脱色液中加入15%硫氰酸盐溶液，采用变速流加15%(V/V%，以下提到醋酸浓度单位相同)醋酸溶液，终点pH为5.0~6.5，温度为5~30℃，醋酸流加时间为60~300min。

7）分离硫氰酸红霉素结晶液，纯化水淋洗，干燥。

本发明的有益效果为：

1）  本发明采用超滤膜过滤、纳滤浓缩结晶提取工艺，省去了滤液树脂除杂、萃取等步骤，使工艺简化，由于避免了萃取溶媒的使用，使生产环节更加环保。

2）  本发明采用有机板式膜作为超滤膜，可更高效地过滤红霉素发酵液，减少滤液中的杂质，提高纳滤膜的通量，并延长设备使用寿命。

3）  本发明采用预溶剂在碱性条件下溶解硫氰酸红霉素粗品，或通过碱性萃取浓缩液中的红霉素，再加入主溶剂调节溶剂极性，碱性条件避免了酸性对红霉素A的破坏，提高红霉素A的收率，高丙酮比例的混合溶剂对红霉素A的选择性高，提高产品中红霉素A的含量，并降低杂质含量。

4）  本发明在采用预溶剂溶解硫氰酸红霉素粗品之后，或通过碱性萃取浓缩液中的红霉素，在加入主溶剂之前，设置了加入活性炭并搅拌过滤、脱色的步骤，该步骤进一步纯化了硫氰酸红霉素溶解液，最终获得的结晶产品中硫氰酸红霉素A的色泽好，透光度高。

5） 在硫氰酸红霉素A的结晶过程中，通过变速流加15%的醋酸溶液，控制原则先慢后快，使得硫氰酸红霉素在溶液中处于介稳区，得到理想的硫氰酸红霉素晶体。

本发明将通过下面的实施例进行说明。但是，应当理解本发明并不限于这里所述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善,因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制,其意图涵盖所有包括在附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案或等同方案。

具体实施方式

实施例1 

取50L红霉素发酵液，在pH8.0、压力0.2MPa的条件下，采用孔径5~50nm的有机板式膜进行过滤，过程中蠕动泵流加纯水透析；所得滤液110L进行卷式纳滤膜浓缩，截留分子量为700以上的膜，浓缩过程滤液pH控制在6.5~7.5，压力控制为4.0MPa，所得浓缩液浓度为2.23g/100ml；浓缩液流加15%硫氰酸盐溶液结晶。取100g红霉素结晶粗盐溶于500ml醋酸戊酯中，调pH11.8，溶解液红A浓度12.48%，混合溶剂极性4.8，分离得到上层醋酸戊酯溶液，加入1%活性炭过滤，向此溶液中加入1000ml的丙酮，溶液中丙酮体积百分比为66.7%，加入15%硫氰酸钠溶液55ml，流加15%醋酸溶液，时间控制210min，温度10℃，终点pH5.5，分离得到硫氰酸红霉素，纯化水淋洗。干燥后所得硫氰酸红霉素中红霉素A含量为85.1%，杂质红霉素B+C为1.3%，含水量2.5%以下，结晶过程红霉素A的收率91.2%。

本实施例中，发酵液通过有机板式超滤膜和微滤膜实验数据为例，可以得到超滤所得滤液质量和最终产品质量方面都有一定优势。

膜种类	有机板式超滤膜	微滤膜
			体通量L/hr.m2	50	50
滤液透光度	90.9%	76%
			终产品中红霉素A含量	85.1%	82.2%
终产品中红霉素B+C含量	1.3%	1.7%
			终产品红霉素A收率	90.2%	88.3%

实施例2

取50L红霉素发酵液，在pH8.2、压力0.22MPa的条件下，采用孔径5~50nm的有机板式膜进行过滤，过程中蠕动泵流加纯水透析，所得滤液110L进行纳滤浓缩，截留分子量为700以上的膜，浓缩过程滤液pH控制在6.5~7.5，压力控制为3.9MPa，所得浓缩液浓度2.12g/100ml；浓缩液流加10%氨水。取100g红霉素粗碱溶于500ml醋酸丁酯中，调pH11.8，溶解液红霉素A浓度11.4%，分离得到上层醋酸丁酯溶液，加入1.5%活性炭过滤，向此溶液中加入1500ml的丙酮，溶液中丙酮体积百分比为75.0%，混合溶剂极性5.05，加入15%硫氰酸钠溶液52ml，变速流加15%醋酸溶液，时间控制180min，温度5℃，终点pH5.0，分离得到硫氰酸红霉素，纯化水淋洗。干燥后所得硫氰酸红霉素中红霉素A含量为85.5%，杂质红霉素B+C为1.0 %，含水量1.0%以下，结晶过程红霉素A的收率92.0%。

本实施例中，采用了结晶过程中变速流加醋酸溶液的方式，相比于常用的匀速流加醋酸调pH结晶的方法，晶型明显改善，硫氰酸红霉素A提高0.3~1.0%。

实施例3

取70L红霉素发酵液，在pH7.8、压力0.16MPa的条件下，采用孔径5~50nm的有机板式膜进行过滤，过程中蠕动泵流加纯水透析，所得滤液160L进行纳滤浓缩，纳滤膜为截留分子量为700以上的膜，浓缩过程滤液pH控制在6.5~7.5，压力控制为3.8MPa，所得浓缩液浓度2.22g/100ml；浓缩液流加15%硫氰酸盐溶液。取160g硫氰酸红霉素粗品溶于500ml二氯甲烷中，调pH11.8，溶解液红A浓度20.3%，分离得到下层二氯甲烷溶液，加入1.5%活性炭过滤，向此溶液中加入2000ml的丙酮，溶液中丙酮体积百分比为80%，混合溶剂极性5.0，加入15%硫氰酸钠溶液55ml，流加15%醋酸溶液，时间控制为150min，温度8℃，终点pH5.5，分离得到硫氰酸红霉素，纯化水淋洗。干燥后所得硫氰酸红霉素中红霉素A含量为85.8%，杂质红霉素B+C为1.5 %，含水量1.5%以下，结晶过程红霉素A的收率90.7%。

本实施例中，采用了硫氰酸红霉素粗品先溶解于二氯甲烷，活性炭脱色后，再加入丙酮调节溶剂极性的方法，这样的溶剂加入顺序，相比于单独加入丙酮、同时加入二氯甲烷和丙酮，所得硫氰酸红霉素质量和收率均较高。

溶剂加入顺序	先溶于二氯甲烷，再加丙酮	直接溶解于丙酮	溶解于二氯甲烷和丙酮的混合溶剂
				终产品中红霉素A含量	84.8%	83.2%	82.1%
终产品中红霉素B+C含量	1.5 %	1.5%	2.0%
				终产品中含水量	1.5%以下	2.0%以下	2.0%
终产品红霉素A收率	88%	67%	70%
				透光度	95%	75%（未到达药典标准）	78%（未到达药典标准

实施例4

取55L红霉素发酵液，在pH7.8、压力0.16MPa的条件下，采用孔径5~50nm的有机板式膜进行过滤，过程中蠕动泵流加纯水透析，所得滤液160L进行纳滤浓缩，纳滤膜为截留分子量为700以上的膜，浓缩过程滤液pH控制在6.5~7.5，压力控制为3.8MPa，所得浓缩液浓度2.22g/100ml；所得浓缩液中加入1400ml二氯甲烷中，调pH11.5，分离得到下层二氯甲烷萃取液，萃取液红A浓度20.7%，加入1.5%活性炭过滤，向此溶液中加入3000ml丙酮，溶液中丙酮体积百分比为68.2%，混合溶剂极性4.9，加入15%硫氰酸钠溶液55ml，流加15%HAc溶液，时间控制210min，温度8℃，终点pH6.5，分离得到硫氰酸红霉素，纯化水淋洗。干燥后所得硫氰酸红霉素中红霉素A含量为85.6%，杂质红霉素B+C为1.4 %，含水量1.5%以下，结晶过程红霉素A的收率90.5%。 

Claims (10)

1.一种从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：红霉素发酵液使用超滤膜过滤，加水透析，滤液通过纳滤浓缩，浓缩液中红霉素在碱性条件下转至预溶剂中，分去水相后加入主溶剂；加入硫氰酸盐结晶，结晶过程中加入醋酸溶液。

2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：所述超滤膜是孔径为5~50nm的有机板式膜或陶瓷膜，截留分子量为1万以上的蛋白和杂质，超滤过程压力控制在0.1~0.3MPa，pH7.5~8.5。

3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：纳滤浓缩后，浓缩液中红霉素在碱性条件下转至预溶剂中的步骤通过如下方法实现，浓缩液流加10~20%的硫氰酸盐溶液结晶粗红霉素硫氰酸盐，或流加5~10%氨水结晶粗红霉素碱；将红霉素盐或碱在碱性条件下溶于预溶剂中。

4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：纳滤浓缩后，浓缩液中红霉素在碱性条件下转至预溶剂中的步骤通过如下方法实现，将浓缩液在碱性条件下萃取到预溶剂中，萃取pH9.8~11.5，温度30~39.5℃。

5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：所述预溶剂为有机溶剂，溶解液中红霉素A含量控制在5~25%(W/V%)。

6.根据权利要求5所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：所述有机溶剂可以是醋酸戊酯、醋酸丁酯、二氯甲烷，其中，用醋酸戊酯溶解时红霉素A浓度5~25%(W/V%)，用醋酸丁酯溶解时红霉素A浓度5~25%(W/V%)，用二氯甲烷溶解时红霉素A浓度20~25%(W/V%)。

7.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：加入主溶剂之前先对溶液脱色过滤，脱色过滤是加入0.5~2.0%活性炭，搅拌过滤，脱色。

8.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：主溶剂丙酮的加入量为预溶剂体积的0.5~4倍，所得溶液中丙酮浓度为30~80%(V/V%)。

9.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：结晶过程采用变速流加15%(V/V%)醋酸溶液，终点pH为5.0~6.5，温度为5~30℃，醋酸流加60~300min。

10.根据权利要求1所述的从发酵液中提取结晶硫氰酸红霉素的方法，其特征在于：纳滤浓缩过程采用截留分子量700以上的纳滤膜，纳滤膜可采用有机卷式膜，纳滤过程压力控制在3.5~4.5MPa，pH为6.0~8.0，浓缩液中红霉素浓度1~3g/100ml。