CN103041283A - 一种外用治疗宫颈hpv感染的中药组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种外用治疗宫颈HPV感染的中药组合物及其制备方法,其原料药主要由紫草、黄柏、莪术、银花、苦参、百部、白芨、冰片组成,制备方法为:莪术水蒸气蒸馏提取,挥发油与冰片用β-环糊精包合;药渣与银花、白芨加水煎煮,与蒸馏液合并,过滤,浓缩得提取物1;取紫草、黄柏、苦参、百部乙醇回流提取,过滤浓缩得提取物2;合并上述提取物1、2;将合并提取物与包合物合并,加入药学上可接受的辅料制成临床接受的外用剂型,本发明治疗宫颈HPV感染疗效确切、明显,且克服了以前散剂服药的不便,临床应用相对方便,副作用小。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物及其制备方法,特别涉及一种治疗宫颈人乳头瘤病毒感染的中药组合物及其制备方法。
背景技术
宫颈癌(cervical cancer,CC)为女性高发的肿瘤,目前发病率仅次于乳腺癌,1992年WHO宣布人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是宫颈发生癌变的首要因素,1995年国际癌症协会认为HPV是CC的主要病因。流行病学研究表明HPV感染可以引起宫颈癌前病变,即宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia,CIN),经过缓慢的过程进展为CC。一个涉及22个国家的大样本研究表明在99.7%CC患者组织样本中检测到了HPV,目前研究显示在自然人群中,HPV感染率从低于1%到高达50%,在性活跃人群中20%~80%以上的人有HPV感染史。有报道健康妇女中HPV感染率为10%~20%,在宫颈部HPV感染率较高,从3.5%~53%,且各国各地区有所不同,如泰国为16%,意大利为26.9%,哥伦比亚为33.7%,希腊为36.3%等;HPV呈现全球性感染传播的趋势,加之CC的发病率逐年上升,寻找能够对抗病毒的药物和有效的治疗方法防治宫颈疾病迫在眉睫。目前HPV导致宫颈病变的具体机制的研究已经取得一定成果,但尚不完全清楚
目前尚没有发现疗效肯定的对抗HPV病毒的药物,只是阿昔洛韦等常规抗病毒药物,还有重组人干扰素制剂,如安达芬栓,舒润栓等,祖国医学以其特有的辨证论治理论,在宫颈病变方面运用中药内服外治等方法有良好疗效,椿乳凝胶临床试验结果分析得到,治疗组的宫颈糜烂痊愈率为18.52%,显效率达到34.69%,总有效率有32.10%,与对照组相比组间有显著性差异,观察中医证候的疗效优于对照组,疗效肯定。
发明内容
本发明的目的在于公开一种外用治疗HPV感染中药组合物。
本发明的另一个目的在于公开一种外用治疗HPV感染的中药组合物的制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:
A方案:
一种治疗宫颈HPV感染的中药组合物,其原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草15-70重量份 黄柏15-70重量份 莪术15-70重量份
银花10-50重量份 苦参15-70重量份 百部15-70重量份
白芨1-30重量份 冰片1-30重量份。
优选的,所述中药组合物原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草20-50重量份 黄柏20-50重量份 莪术20-50重量份
银花14-45重量份 苦参20-50重量份 百部20-50重量份
白芨5-20重量份 冰片5-20重量份。
优选的,所述中药组合物原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草30-45重量份 黄柏30-45重量份 莪术30-45重量份
银花20-35重量份 苦参30-45重量份 百部30-45重量份
白芨7-15重量份 冰片7-15重量份。
优选的,所述中药组合物原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草40重量份 黄柏40重量份 莪术40重量份
银花30重量份 苦参40重量份 百部40重量份
白芨10重量份 冰片10重量份。
B方案:
一种治疗宫颈HPV感染中药组合物,其原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草15-70重量份 黄柏15-70重量份 莪术15-70重量份
银花10-50重量份 苦参15-70重量份 百部15-70重量份
儿茶10-50重量份 白芨1-30重量份 冰片1-30重量份。
优选的,所述中药组合物原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草20-50重量份 黄柏20-50重量份 莪术20-50重量份
银花14-45重量份 苦参20-50重量份 百部20-50重量份
儿茶15-45重量份 白芨5-20重量份 冰片5-20重量份。
优选的,所述中药组合物原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草30-45重量份 黄柏30-45重量份 莪术30-45重量份
银花20-35重量份 苦参30-45重量份 百部30-45重量份
儿茶20-35重量份 白芨7-15重量份 冰片7-15重量份。
优选的,所述中药组合物原料药主要由如下中药组成(按重量份计):
紫草40重量份 黄柏40重量份 莪术40重量份
银花30重量份 苦参40重量份 百部40重量份
儿茶30重量份 白芨10重量份 冰片10重量份。
一种治疗HPV感染中药组合物(A方案组方)的制备方法,所述制备方法可以采用/不限于如下方法:
步骤1:莪术水蒸气蒸馏提取,得挥发油、蒸馏液及药渣,挥发油与冰片用β-环糊精包合,得包合物;
步骤2:步骤1药渣与银花、白芨加水煎煮,并与步骤1蒸馏液合并,过滤,浓缩得提取物1;
步骤3:取紫草、黄柏、苦参、百部乙醇回流提取,过滤浓缩得提取物2;
步骤4:合并上述提取物1、2;
步骤5:将上述步骤4的合并提取物与步骤1的包合物合并,得本发明中药组合物;
优选的,步骤1中取莪术加5-10重量倍水,浸泡0.5-2小时,水蒸气蒸馏提取5-10小时,得莪术挥发油;莪术挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存;莪术蒸馏后的水溶液另器保存;
优选的,步骤2中莪术药渣与银花、白芨加5-10重量倍量水煎煮1-3次,每次0.5-2小时,合并煎液,并与莪术蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,为提取物1,备用;
优选的,步骤3中取紫草、黄柏、苦参、百部加入70-90%乙醇回流提取2次,第一次1-3小时,8-12倍量,第二次用5-10倍量提取0.5-2小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,为提取物2,备用;
优选的,步骤4中的合并提取物用喷雾干燥,得干膏粉;
步骤5制备的中药组合物可加入药学上可接受的常规外用剂型辅料,按照常规外用剂型制备方法,制成临床接受的外用剂型,所述外用剂型包括洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂等。
一种治疗HPV感染中药组合物(B方案)的制备方法,所述制备方法还可以采用/不限于如下方法:
步骤1:莪术水蒸气蒸馏提取,得挥发油、蒸馏液及药渣,挥发油与冰片用β-环糊精包合,得包合物;
步骤2:步骤1药渣与银花、白芨加水煎煮,并与步骤1蒸馏液合并,过滤,浓缩得提取物1;
步骤3:取紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶乙醇回流提取,过滤浓缩得提取物2;
步骤4:合并上述提取物1、2;
步骤5:将上述步骤4的合并提取物与步骤1的包合物合并,得本发明中药组合物;
优选的,步骤1中取莪术加5-10重量倍量水,浸泡0.5-2小时,水蒸气蒸馏提取5-10小时,得莪术挥发油;莪术挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存;莪术蒸馏后的水溶液另器保存;
优选的,步骤2中莪术药渣与银花、白芨加5-10重量倍量水煎煮1-3次,每次0.5-2小时,合并煎液,并与莪术蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,为提取物1,备用;
优选的,步骤3中取紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶加入70-90%乙醇回流提取2次,第一次1-3小时,8-12倍量,第二次用5-10倍量提取0.5-2小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,为提取物2,备用;
优选的,步骤4中的合并提取物用喷雾干燥,得干膏粉;
上述步骤5制备的的中药组合物中加入药学上可接受的常规外用剂型辅料,按照常规外用剂型制备方法,制成临床接受的外用剂型,所述外用剂型包括洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂等。
本发明所述的外用剂型优选为凝胶剂。
本发明中药组合物中紫草为君药,具有清热解毒,凉血活血的作用;莪术、银花、苦参四药为臣药,扶助紫草加强清热解毒、燥湿杀虫之力;莪术破血行气止痛,药理作用能直接杀伤肿瘤、并诱发和促进机体对肿瘤的免疫排斥反应;银花为清热解毒良药,善解血毒,现代研究具有抑菌、抗病毒、抗炎、解毒、调节免疫等作用;苦参清热燥湿杀虫;佐药为:百部、白芨、冰片;百部杀虫止痒,体外试验可抗多种致病菌及蚊蝇虱虫等;白芨敛疮生肌,佐助创面愈合;冰片通诸窍、散郁火、祛翳明目、消肿止痛防腐,体外有抑菌作用;儿茶为使药,能够收敛生肌祛湿,善治溃疡不敛、湿疹、外伤出血等;全方共奏清热解毒、祛湿杀虫、消肿止痒、敛疮生肌之功,用于HPV感染、宫颈癌前病变属湿热下注证者,症见带下量多、色黄或赤白相兼或带下夹血、质稠、味臭、阴痒、小便频、尿赤、大便粘腻不爽、舌红苔黄腻、脉滑等症。
本发明组合物的保护范围不应该仅仅理解为上述组方的组成及配比,根据上述述组方原理的加减替换的等同改变均应落入本发明的保护范围。
本发明药物组合物通过基础实验、临床研究,治疗宫颈HPV感染疗效确切、明显,临床应用相对方便,副作用小。实验例1药效学实验研究
1.1细胞培养
CaSki细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养基中,H8细胞在含2%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2饱和湿度环境下培养。
1.2药物浓度选择
取本发明实施例1制备的药品溶解于44ml无血清的DMEM培养基中,其所含浓度为3.95×104mg/L,待溶液澄清后,孔径为22μm的滤器过滤除菌,分装后4℃避光保存备用。根据预试验结果,实验组最终加入的药品浓度分别19.77mg/L,39.55mg/L,79.09mg/L,对照组则加入等量的培养基。
1.3细胞形态观察
活细胞照相:将对数生长期的细胞接种于6孔板培养板,每孔10×104个细胞,在各实验组的6孔培养板中每孔放置一片盖玻片,形成附有细胞的盖片,d2细胞贴壁后更换为含药培养基,培养3d后,在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。
1.4四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度的本药品药液对CaSki和H8细胞生长抑制情况。
将细胞接种于六板96孔细胞培养板,每孔3000个细胞,d2更换为含药培养基,所含药品浓度分别为19.77mg/L,39.55mg/L,79.09mg/L,并设正常对照,每个浓度平行5孔,37℃,5%CO2饱和湿度下培养24h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)20μl,继续培养4h,弃去上清液,每孔加入二甲基亚砜150μl,37℃培养20min,酶标仪测定OD值,波长492nm,连续6d,并制作生长曲线。
1.5细胞周期检测
在六孔培养板中以含不同浓度药物的培养基培养5d,每个药物浓度平行3孔,收集细胞,制备单细胞悬液,PBS清洗2次,预冷70%醇固定,4℃保存待检。经0.01%RNA酶处理胞浆RNA、50mg/L碘化丙锭(propidium iodide,PI)DNA染色30min后,经300筛目过滤除去成团细胞,应用COULTER(r)EPICS(r)XL流式细胞仪检测细胞周期中不同时相的细胞百分比和细胞凋亡率。每份标本测定5000个细胞。根据DNA含量区分细胞所处细胞周期时相。
1.6mRNA表达检测
收集培养d5的细胞,TRIZOL处理后提取RNA,逆转录为cDNA,扩增HPV16E6、E7,同时扩增β-actin作为内参照,HPV16E6、E7引物(616bp):上游5’-TGACTTTGCTTTTCGGGATT-3’,下游5’-GAGAACAGATGGGGCACAC-3’。β-actin(552bp)引物序列:上游:5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3’,下游:5’-CATGGTGGTGCCGCCGCCAGACAG-3’。扩增参数为:94℃预变性5min;94℃变性45s,50℃复性45s,72℃延伸1min,扩增30个循环;72℃延伸加时5min;PCR产物4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果,电压40V。应用Scion Image4.0(NIH)软件进行电泳条带图像灰度值的半定量分析。待测基因电泳条带灰度比值=待测条带灰度值/同一份标本内参照β-actin条带灰度值。每个加药样本至少检测3次。
2.1本发明对CaSki和H8细胞的生长抑制作用
MTT检测发现不同浓度本发明药物组合物对宫颈永生化细胞H8以及宫颈癌细胞CaSki生长均有抑作用,见图1和图2。
2.2本发明药物组合物作用下细胞周期和凋亡率
本发明药物组合物作用于H8细胞,G1期细胞增加,G2期略细胞减少,但是均无统计学差异(P>0.05),本发明药物组合物作用于CaSki细胞,G1期细胞增加(P<0.05),G2期细胞减少(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),使细胞阻滞于G1期,本发明药物组合物作用于H8细胞,加药组凋亡率略增加,但无统计学差异(P>0.05)(见表1),本发明药物组合物作用于CaSki细胞,加药组虽无明显的凋亡峰,但有统计学差异(P<0.05)(见表2)
表1本发明药物组合物作用下H8细胞周期分布和细胞凋亡率
表2本发明药物组合物作用下CaSki细胞分布和细胞凋亡率
注:*与对照组比较P<0.05
2.3本发明药物组合物对HPVE6E7基因表达的影响
本实验中在本发明组合物作用下,两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P<0.01),并呈剂量依赖关系(P<0.01)(见表3)。
表3RT-PCR产物电泳条带灰度值
以不同浓度的含本发明实施例1制备的制剂培养基体外培养宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8,相差显微镜下观察活细胞形态学变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法以及流式细胞术技术检测不同浓度本发明药物组合物对细胞增殖的影响;应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测人乳头状瘤病毒HPV16亚型E6E7的表达。
结果:不同浓度的本发明药物组合物可以抑制细胞的增殖;在药物作用下,CaSki细胞G1期细胞增加(P<0.05),G2、S期细胞减少(P<0.05),CaSki细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),而对H8细胞周期和凋亡率影响不明显;两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P<0.01)。
3结论:
本发明药物组合物在体外抑制宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8增殖,其机制可能是通过抑制HPV16E6E7表达而抑制肿瘤细胞生长。
实验例2临床研究
1、病例搜集
2010年12月-2011年8月在东直门医院妇科门诊就诊的被证实HPV感染的临床诊断为CINII以下的患者45例,中医证型符合湿热下注型。另设30例阴性对照(诊断相同,不用药而随诊者)
2、诊断标准:
西医诊断标准:主要依据病理组织学诊断为金标准,多种病理诊断并存以其病变重者为准,TCT结合HC-II检测确定高危型HPV感染。
中医证候诊断标准:参照张玉珍主编的《中医妇科学》带下病之证候、症状诊断,湿热下注型主要症状:带下量多,色黄或呈脓性,或者带下量多、色黄或赤白相兼或带下夹血、质稠、味臭、阴痒、小便频、尿赤、大便粘腻不爽、舌红苔黄腻、脉滑或滑数等症。
临床症状评分标准:参照国家药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》加以改良分项评分。
3、病例纳入标准
(1)符合以上诊断标准的18-50岁有性生活女性;
(2)自愿接受中药治疗能够按时回访,按要求完成临床治疗观察者;
(3)无其他急慢性合并症;
(4)入选前半年未接受激素类药物或放化疗治疗者;
(5)肝肾功能正常无严重药物过敏史者。
4、病例排除标准
(1)妊娠期、哺乳期妇女或者入组后查出怀孕者;
(2)入组后终止治疗或要求退出者;
(3)未完成疗程或不按照规定用药者;
(4)治疗期间查患其他疾病需要治疗而可能影响本研究治疗者;
(5)治疗观察期间病变进展经确诊为CINIII、原位癌、浸润癌者。
5、研究方法
中药“本发明实施例1制剂”,于月经干净开始上药。
治疗组:上药方法:专门负责的医生为入组患者上药,无菌窥器暴露宫颈,无菌碘伏棉球擦拭去除阴道壁分泌物及宫颈粘液,而后取本发明实施例1制备的药物组合物约3g,均匀涂于宫颈表面并覆盖宫颈外口,隔日一次,10次为一个疗程,连续用药两个疗程,月经期停止用药。两疗程结束月经干净复查各项指标。
对照组:是不用药的空白组。
6、观察指标
治疗前后临床症状,体征改变情况(症状体征评分)。
阴道镜下宫颈局部的图像变化(阴道镜Reid评分)。
HPV病毒载量变化(HC-2检测13种高危型HPV载量)。
7、疗效判定标准
(1)临床症状、体征疗效评定标准(参照国家药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》改良后评分)
痊愈:临床症状、体征积分比≥90%;
显效:70%≤临床症状、体征积分比<90%;
有效:30%≤临床症状、体征积分比<70;
无效:临床症状、体征积分比<30;
积分比=(治疗前总积分一治疗后总积分)/治疗前总积分×100%.
8、临床指标判定标准
痊愈:HPV载量<1.0pg/ml;显效:HPV载量下降≥60%;
有效:HPV载量下降≥30%;无效:HPV载量下降<30%或上升。
9、结果见表4、表5
表4临床症状体征积分疗效判定表
根据表4可知,针对患者症状体征,治疗组治疗总有效率达到93.33%,痊愈率55.6%,而对照组有效率为23.33%,痊愈率为0,两组比较,差异极显著,治疗组明显优于对照组(p<0.01)。说明该药能明显改善患者临床症状体征。
表5病毒载量疗效判定表
根据表5可见,针对患者病毒负荷载量而讲,治疗组总有效率为88.9%,痊愈率51.1%,而对照组有效率为53.33%,痊愈率为13.3%;两组比较差异显著,治疗组明显优于对照组(p<0.05)。说明本发明药物组合物能够有效降低病毒感染者病毒负荷量。
10、结论
本发明药物组合物能有效改善湿热下注型宫颈高危型HPV感染患者的临床症状和体征。
本发明药物组合物能明显降低HPV病毒负荷载量,有效率达到88.9%,转阴率51.1%。
实验例3组织端粒酶活性及其hTERT组分变化实验
1临床选取自愿入组患者,病理诊断确诊为宫颈病变CIN I患者28名、CIN II患者25名、CIN III患者25名,及临床确诊为宫颈炎患者29例。取本发明实施例1制备的药物组合物约3g,均匀涂于宫颈表面并覆盖宫颈外口,隔日一次,10次为一个疗程,连续用药两个疗程,月经期停止用药。两疗程结束。分别于疗前疗后对宫颈活检组织进行端粒酶活性以及端粒酶其中的主要蛋白成分hTERT mRNA进行定量检测,分析比较疗前疗后组织端粒酶活性及其hTERT组分的变化情况。
2实验操作
2.1用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定法(TRAP-ELISA)测定组织端粒酶活性。
端粒酶提取:40-100mg冷冻(-70%摄氏度)组织或104-106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mMhepes-KOH(PH7.5),1.5mMMgCl2,10mM KCI,1mM DTT]洗1次,10000g4摄氏度离心1分钟,沉淀加200μl冷裂解液[10mMtris-HCI(PH7.5),1mM MgCl2,1mMEGTA,0.1mM PMSF,5mM β-巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油],冰浴中匀浆,450rpm,25分钟,16000g,4摄氏度离心20分钟,移取上清液160μl,部分样品用于蛋白定量,其余的迅速冷冻,-70摄氏度下保存。TRAP扩增:50μl TRAP体系包含20mMtris-HCI(PH8.3),1.5mM MgCI,63mM KCI,0.005%Tween-20,1mMEGTA,50μMdNTP,0.1μg tS,1μg T4基因32蛋白,0.1mg/ml牛血清白蛋白,1-2μl CHAP S细胞提取液(含6μg)蛋白,0.2-0.4μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP(10μCi/μl,3000Ci/mmol)这一反应体系可以同时满足端粒酶Tap聚合酶的活性需要,23摄氏度10分钟合成端粒酶延伸产物后,94摄氏度3秒灭活端粒酶,加入0.1μgcX和2U Taq酶,94摄氏度30秒,50摄氏度30秒,72摄氏度1.5分钟扩增27个循环,72摄氏度延伸10分钟后终止反应。扩增片段的检测:使用ELISA法,TS引物5′端标以生物素,将上述产物5μl加入含变性液的0.5ml EP管中变性10分钟,加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片段特异结合的探针杂交液225μl,杂交后吸取100μl与生物素结合,避光37摄氏度孵育2小时,洗涤3次,加入酶标抗体100μl,37摄氏度下作用30分钟,再次洗涤3次后加入IMB底物,37度孵育30分钟,加入终止液,30分钟后酶标仪检测其A值。以不加CX或TS引物做对照,排除引物二聚体或PCR污染。以阳性细胞沉淀(106细胞)的裂解提取液为阳性对照进行TRAP分析可以排除由于试剂质量不好造成的假阴性。
2.2RT-PCR方法检测端粒酶hTERTmRNA。
取标本组织制成单细胞悬液用TRIzol试剂提取细胞总RNA。取1ug细胞总RNA利用逆转录试剂盒提供的标准条件进行逆转录反应合成的cDNA用作PCR反应的模板。设计引物,内参照选取GAPDH。PCR反应体系为30μl,其含10×bufier3ul,1.5mmol/lMgCl2,0.2mmol/ldNTP,1U Taq酶,上下游引物各0.5umol/l。PCR扩增条件为94摄氏度30秒,55摄氏度30秒,72摄氏度1分钟,35个循环,然后72摄氏度延伸10分钟。取5ulPCR反应产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳,DNA Marker选用pBR322DNA/AIuI,紫外灯下观察结果并拍照。
3实验数据统计处理
3.1宫颈组织端粒酶在疗前疗后检测结果显示,疗前CINI的阳性率为53.57%,疗后阳性率为28.57%;疗前CINII的阳性率为72.00%,疗后阳性率为40.00%;疗前CIN III的阳性率为76.00%,疗后阳性率为40.00%;疗前疗后端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。具体见表6。
表6宫颈组织端粒酶活性变化情况
3.2RT-PCR检测端粒酶hTERT mRNA表达,疗前宫颈炎症的阳性率为17.24%,CIN I的阳性率为35.71%,CIN II的阳性率为48.00%,CIN III的阳性率为60.00%;疗后宫颈炎症的阳性率为0,CIN I的阳性率为17.86%,CIN II的阳性率为24.00%,CIN III的阳性率为32.00%;使用Fisher确切概率检验法计算,疗前疗后端粒酶hTERT mRNA的表达水平存在显著性差异(P<0.05)。具体见表7。
表7端粒酶hTERT mRNA表达
4、结论
实验证明端粒酶hTERTmRNA表达水平及端粒酶活性在疗后明显降低。
附图说明
图1紫柏凝胶作用下CaSki细胞生长曲线;
图2紫柏凝胶作用下H8细胞生长曲线。
具体实施方式
下述实施例均可实现本发明的技术效果。
实施例1凝胶剂
紫草40g 黄柏40g 莪术40g
银花30g 苦参40g 百部40g
儿茶30g 白芨10g 冰片10g
以上九味,取莪术加8重量倍量水,浸泡1小时,水蒸气蒸馏提取8小时,得莪术挥发油;取莪术挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存;莪术蒸馏后的水溶液另器保存;莪术药渣与银花、白芨加8重量倍量水煎煮2次,每次1小时,合并煎液,并与莪术蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,备用;取紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶加80%醇回流提取2次,第一次2小时,10倍量,第二次用8倍量提取1小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,备用;合并上述所有清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入常规凝胶剂辅料,按照凝胶剂常规制备方法,得本发明凝胶剂,每次用凝胶量不超过3克,其中药物所占比例不低于25%。
实施例2膏剂
原料药为:
紫草40g 黄柏40g 莪术40g
银花30g 苦参40g 百部40g
儿茶30g 白芨10g 冰片10g
取莪术加9倍量水,浸泡1.5小时,水蒸气蒸馏提取7小时,挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存,蒸馏后的水溶液另器保存,药渣与银花、白芨加9倍量水煎煮3次,每次0.5小时,合并煎液,并与蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用。紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶5味药加入80%乙醇回流提取2次,第一次3小时,8倍量,第二次用10倍量提取0.5小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用,合并所有上述清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入外用膏剂常规辅料,按照外用膏剂常规制备方法,得本发明药物组合物膏剂。
实施例3凝胶剂
紫草40g 黄柏40g 莪术40g
银花30g 苦参40g 百部40g
白芨10g 冰片10g
取莪术加8倍量水,浸泡1小时,水蒸气蒸馏提取8小时,挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存,蒸馏后的水溶液另器保存,药渣与银花、白芨加8倍量水煎煮2次,每次1小时,合并煎液,并与蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用。紫草、黄柏、苦参、百部4味药加入80%乙醇回流提取2次,第一次2小时,10倍量,第二次用8倍量提取1小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用,合并所有上述清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入常规凝胶剂辅料,按照凝胶剂常规制备方法,得本发明凝胶剂,每次用凝胶量不超过3克,其中药物所占比例不低于25%。
实施例4膏剂
紫草50g 黄柏50g 莪术50g
银花20g 苦参20g 百部20g
白芨10g 冰片20g
取莪术加9倍量水,浸泡1.5小时,水蒸气蒸馏提取7小时,挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存,蒸馏后的水溶液另器保存,药渣与银花、白芨加9倍量水煎煮3次,每次0.5小时,合并煎液,并与蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用。紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶5味药加入80%醇回流提取2次,第一次3小时,8倍量,第二次用10倍量提取0.5小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用,合并所有上述清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入外用膏剂常规辅料,按照外用膏剂常规制备方法,得本发明药物组合物膏剂。
实施例5凝胶剂
紫草65g 黄柏20g 莪术70g
银花40g 苦参20g 百部30g
儿茶30g 白芨15g 冰片20g
取莪术加8倍量水,浸泡1小时,水蒸气蒸馏提取8小时,挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存,蒸馏后的水溶液另器保存,药渣与银花、白芨加8倍量水煎煮2次,每次1小时,合并煎液,并与蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用。紫草、黄柏、苦参、百部4味药加入80%乙醇回流提取2次,第一次2小时,10倍量,第二次用8倍量提取1小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用,合并所有上述清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入常规凝胶剂辅料,按照凝胶剂常规制备方法,得本发明凝胶剂,每次用凝胶量不超过3克,其中药物所占比例不低于25%。
实施例6凝胶剂
原料药为:
紫草70g 黄柏20g 莪术60g
银花20g 苦参40g 百部70g
儿茶30g 白芨15g 冰片10g
取莪术加8重量倍量水,浸泡1小时,水蒸气蒸馏提取8小时,得莪术挥发油;取莪术挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存;莪术蒸馏后的水溶液另器保存;莪术药渣与银花、白芨加8重量倍量水煎煮2次,每次1小时,合并煎液,并与莪术蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,备用;取紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶加入80%乙醇回流提取2次,第一次2小时,10倍量,第二次用8倍量提取1小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)的清膏,另器收集,备用;合并上述所有清膏,加入β-环糊精制成的包合物混合均匀,加入海藻酸钠,经常规制备方法制得凝胶剂。
实施例7凝胶剂
紫草70g 黄柏30g 莪术40g
银花25g 苦参45g 百部30g
白芨15g 冰片10g
取莪术加7倍量水,浸泡2小时,水蒸气蒸馏提取9小时,挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存,蒸馏后的水溶液另器保存,药渣与银花、白芨加8倍量水煎煮3次,每次1小时,合并煎液,并与蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用。紫草、黄柏、苦参、百部4味药加入80%乙醇回流提取2次,第一次2小时,9倍量,第二次用8倍量提取2小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用,合并所有上述清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入常规凝胶剂辅料,按照凝胶剂常规制备方法,得本发明凝胶剂,每次用凝胶量不超过3克,其中药物所占比例不低于25%。
实施例4膏剂
紫草20g 黄柏70g 莪术50g
银花20g 苦参20g 百部20g
白芨10g 冰片15g
取莪术加8倍量水,浸泡1小时,水蒸气蒸馏提取7小时,挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存,蒸馏后的水溶液另器保存,药渣与银花、白芨加10倍量水煎煮2次,每次0.5小时,合并煎液,并与蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用。紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶5味药加入80%乙醇回流提取2次,第一次3小时,8倍量,第二次用10倍量提取0.5小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.10~1.15(60~65℃)清膏,另器收集,备用,合并所有上述清膏,喷雾干燥,得干膏粉;干膏粉与β-环糊精制成的包合物混匀均匀,加入外用膏剂常规辅料,按照外用膏剂常规制备方法,得膏剂。
Claims (10)
1.一种治疗宫颈HPV感染的中药组合物,其特征在于该中药组合物主要由如下原料药组成:
紫草15-70重量份 黄柏15-70重量份 莪术15-70重量份
银花10-50重量份 苦参15-70重量份 百部15-70重量份
白芨1-30重量份 冰片1-30重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物,其特征在于该中药组合物主要由如下原料药组成:
紫草20-50重量份 黄柏20-50重量份 莪术20-50重量份
银花14-45重量份 苦参20-50重量份 百部20-50重量份
白芨5-20重量份 冰片5-20重量份;
或
紫草30-45重量份 黄柏30-45重量份 莪术30-45重量份
银花20-35重量份 苦参30-45重量份 百部30-45重量份
白芨7-15重量份 冰片7-15重量份;
或
紫草40重量份 黄柏40重量份 莪术40重量份
银花30重量份 苦参40重量份 百部40重量份
白芨10重量份 冰片10重量份。
3.如权利要求1或2所述的中药组合物的制备方法,其特征该方法包括如下步骤:
步骤a:莪术水蒸气蒸馏提取,得挥发油、蒸馏液及药渣,挥发油与冰片用β-环糊精包合,得包合物;
步骤b:步骤a药渣与银花、白芨加水煎煮,并与步骤a蒸馏液合并,过滤,浓缩得提取物1;
步骤c:取紫草、黄柏、苦参、百部乙醇回流提取,过滤浓缩得提取物2;
步骤d:合并上述提取物1、2;
步骤e:将上述步骤d的合并提取物与步骤a的包合物合并,加入药学上可接受的常规外用剂型辅料,按照常规外用剂型制备方法,制成临床上接受的外用剂型。
4.如权利要求3所述的中药组合物的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
取莪术加5-10重量倍量水,浸泡0.5-2小时,水蒸气蒸馏提取5-10小时,得莪术挥发油;莪术挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存;莪术蒸馏后的水溶液另器保存;
莪术药渣与银花、白芨加5-10重量倍量水煎煮1-3次,每次0.5-2小时,合并煎液,并与莪术蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至60~65℃测相对密度为1.10~1.15的清膏,另器收集,为提取物1,备用;
取紫草、黄柏、苦参、百部加入70-90%乙醇回流提取2次,第一次1-3小时,8-12倍量,第二次用5-10倍量提取0.5-2小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至60~65℃相对密度测为1.10~1.15的清膏,另器收集,为提取物2,备用;
将提取物1和提取物2合并,喷雾干燥,得干膏粉,备用;
将上述干膏粉与包合物合并,加入药学上可接受的常规外用剂型辅料,按照常规外用剂型制备方法,制成临床上接受的洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂外用剂型。
5.如权利要求1-2任一所述的中药组合物在制备外用治疗宫颈HPV感染药物中的应用。
6.一种治疗宫颈HPV感染的中药组合物,其特征在于该中药组合物由如下原料药组成:
紫草15-70重量份 黄柏15-70重量份 莪术15-70重量份
银花10-50重量份 苦参15-70重量份 百部15-70重量份
儿茶10-50重量份 白芨1-30重量份 冰片1-30重量份。
7.如权利要求6所述的中药组合物,其特征在于该中药组合物由如下原料药组成:
紫草20-50重量份 黄柏20-50重量份 莪术20-50重量份
银花14-45重量份 苦参20-50重量份 百部20-50重量份
儿茶15-45重量份 白芨5-20重量份 冰片5-20重量份;
或
紫草30-45重量份 黄柏30-45重量份 莪术30-45重量份
银花20-35重量份 苦参30-45重量份 百部30-45重量份
儿茶20-35重量份 白芨7-15重量份 冰片7-15重量份;
或
紫草40重量份 黄柏40重量份 莪术40重量份
银花30重量份 苦参40重量份 百部40重量份
儿茶30重量份 白芨10重量份 冰片10重量份。
8.如权利要求6-7任一所述的中药组合物的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
步骤a:莪术水蒸气蒸馏提取,得挥发油、蒸馏液及药渣,挥发油与冰片用β-环糊精包合,得包合物;
步骤b:步骤a药渣与银花、白芨加水煎煮,并与步骤a蒸馏液合并,过滤,浓缩得提取物1;
步骤c:取紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶乙醇回流提取,过滤浓缩得提取物2;
步骤d:合并上述提取物1、2;
步骤e:将上述步骤d的合并提取物与步骤a的包合物合并,加入药学上可接受的常规外用剂型辅料,按照常规外用剂型制备方法,制成临床上接受的外用剂型。
9.如权利要求8所述的中药组合物的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
取莪术加5-10重量倍量水,浸泡0.5-2小时,水蒸气蒸馏提取5-10小时,得莪术挥发油;莪术挥发油与冰片用β-环糊精包合,制成包合物,另器保存;莪术蒸馏后的水溶液另器保存;
莪术药渣与银花、白芨加5-10重量倍量水煎煮1-3次,每次0.5-2小时,合并煎液,并与莪术蒸馏后的水溶液合并,过滤,滤液减压浓缩至60~65℃测相对密度为1.10~1.15的清膏,另器收集,为提取物1,备用;
取紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶加入70-90%乙醇回流提取2次,第一次1-3小时,8-12倍量,第二次用5-10倍量提取0.5-2小时,合并提取液,过滤,滤液浓缩至60~65℃测相对密度为1.10~1.15的清膏,另器收集,为提取物2,备用;
将提取物1和提取物2合并,喷雾干燥,得干膏粉,备用;
将上述干膏粉与包合物合并,加入药学上可接受的常规外用剂型辅料,按照常规外用剂型制备方法,制成临床上接受的洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂外用剂型。
10.如权利要求6-7任一所述的中药组合物在制备外用治疗宫颈HPV感染药物中的应用。
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