CN103013824A - 基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属微流控芯片技术领域，具体为一种基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。石墨粉通过化学氧化和超声分散得氧化石墨烯水溶液，与正硅烷乙酯水解制得的硅溶胶混合后，注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，一定时间后移出修饰溶液并干燥得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片。然后，在通道内注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯上的羧基活化，接着注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本发明制备的微流控芯片蛋白酶解反应器具有酶解时间短、样品用量少和价格低廉等优点。

Description

基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。
背景技术
石墨烯（graphene）是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的一种碳质新材料，是构建其他碳素材料（如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨）的基本单元。自从2004 年英国Manchester大学的Geim等人发现单层石墨烯以来[1]，石墨烯受到了全世界科学家的广泛关注。石墨烯具有优异的电学、热学和力学性能，可望在高性能纳电子器件、电池、电化学电容、复合材料、场发射材料、气体传感器及能量存储等领域获得广泛应用[2]。由于其独特的二维结构和优异的晶体学质量，石墨烯蕴含了丰富而新奇的物理现象，具有重要的理论研究价值。过去几年中，石墨烯已经成为了备受瞩目的国际前沿和研究热点。目前，制备石墨烯的方法有机械剥离法、化学气相沉积法、石墨化学氧化剥离法等，其中第三种方法是目前制备氧化石墨烯和石墨烯最常用也是最经济的方法。将石墨用高锰酸钾等强氧化剂氧化，然后通过超声剥离得氧化石墨烯，其基本结构是表面带有羧基、羟基、羰基和环氧基的碳的单原子层，其含有丰富的含氧官能团[3]，在水中分散良好，容易与其它水溶性材料复合。由于氧化石墨烯含丰富的官能团，可通过化学修饰的方法制备石墨烯衍生物，甚至可与酶和蛋白等生物大分子共价键结合，在构建微流控芯片生化微反应器方面具有得天独厚的优势，目前，尚未见有关报道。
自从瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer [4]首次提出微型全分析系统（μ-TAS）以来，微流控芯片就以其高效、快速、试剂用量少、低耗以及集成度高等优点引起了国内有关专家的广泛关注，在其方法学研究迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研究、临床诊断、药物分析、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景[5-7]。
微流控芯片以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几个平方厘米大的芯片上， 自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大应用潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等多学科交叉的崭新研究领域。
微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测小体积样品的酶法和免疫法分析和检测。其中一个很重要的用途是用于蛋白质的酶解和分析。蛋白质酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤，待测样品中的蛋白通过电泳分离后用蛋白水解酶水解成肽，然后用质谱测定其分子量得肽质量图谱，经检索有关数据库后完成蛋白鉴定。传统的溶液酶解灵敏度低且耗时（12小时以上），加上蛋白水解酶自身酶解产生的肽也会干扰目标蛋白的鉴定，所以溶液酶解时蛋白和酶的比例通常要求在20-40:1，以降低游离蛋白酶自身酶解的干扰，但由于蛋白酶浓度低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。
解决上述问题的主要途径就是使用固定化酶技术，通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋[8,9]技术固定在微流控芯片通道内表面。存在的问题是由于酶不是通过共价键固定，容易流失，影响酶解效果。
参考文献
[1] Novoselov KS, Geim AK, Morozov SV, et al. Science 2004, 306, 666-669.
[2] Martin P. Chem. Re., 2009, 9, 211-223.
[3] Compton OC, Nguyen ST. Small 2010, 6, 711-723.
[4] Manz A, Graber N, Widmer HM. Sens. Actuators B 1990, 1, 244-248.
[5] Dittrich, PS, Tachikawa K, Manz A. Anal. Chem. 2006, 78, 3887-3908. 
[6] Auroux PA, Iossifidis D, Reyes DR, and Manz A. Anal. Chem. 2002, 74, 2637-2652.
[7] Verpoorte E. Electrophoesis 2002, 23, 677-712.
[8] Qu HY, Wang H., Huang Y, et al. Anal. Chem. 2004, 76, 6426-6433.
[9] Wu HL, Tian YP, Liu BH, et al. J. Proteome Res. 2004, 3, 1201-1209.
发明内容
本发明的目的在于提出一种能够大幅降低酶解时间并提高蛋白酶解效率的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。
本发明提出的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，具体步骤为：
（1）通过光刻和化学湿法刻蚀的方法，加工出用于复制带有分离通道的微流控芯片基片的硅阳模；
（2）将少量热引发剂偶氮二异丁腈和少量光引发剂安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80-90℃水浴中加热15-20分钟，使其预聚成甘油状清亮铸模溶液，将此含光引发剂的铸模溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片盖在预聚的铸模溶液上并压紧，然后用紫外光通过有机玻璃片照射预聚的铸模溶液，引发本体聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；将硅阳模用玻璃板代替，制作得微流控芯片盖片；将所述基片和所述盖片发生原位聚合的一面通过热压键合，制作得有机玻璃微流控芯片成品；
（3）将石墨粉分散在浓硫酸中并用冰浴冷却，然后加入硝酸钾和高锰酸钾进行氧化，再加入双氧水后用稀盐酸洗涤得氧化石墨，然后将氧化石墨分散到水溶液中，用超声波进行剥离，得氧化石墨烯水溶液；将正硅烷乙酯与乙醇和稀盐酸混合水解，得硅溶胶；将硅溶胶与氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修饰溶液；
（4）将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微通道，2-4小时后正硅酸乙酯充分渗入微通道的表层；用水冲去通道内多余的正硅酸乙酯，注入稀盐酸水解1-3小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，然后移出修饰溶液，并干燥，得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片；
（5）在通道内注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。
本发明的步骤（2）中，所述有机玻璃微流控芯片通道的深度为20-50微米，底部宽度20-60微米，上部宽度50-200微米。
本发明的步骤（2）中，有机玻璃盖片对应于微流控芯片基片上通道的末端的位置钻有直径为1-3毫米的圆形小孔，用于进样和收集蛋白酶解产物。
本发明的步骤（2）中，所述热压键合的热压温度为105-110℃，施加在两片玻璃板上的微流控芯片上的热压压力为0.5-5公斤/平方厘米，热压时间为10-20分钟。 
本发明的步骤（3）中，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为1-10毫克/毫升，硅溶胶溶液的浓度为10-100毫克/毫升。
本发明的步骤（5）中，水溶液中1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的浓度分别为0.5-5 毫克/毫升和0.25-2.5毫克/毫升，蛋白水解酶的浓度为0.5-5 毫克/毫升。
本发明提出的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片制备方法，进一步详述如下:
采用计算机辅助设计软件设计芯片结构，典型的设计如图1所示，由单十字交叉微通道2和7以及溶液连接孔1、5、6和酶解液收集孔4构成，采用高分辨率(如3600 dpi)激光照排系统在透明薄膜上打印成掩膜，微通道部分为黑色线条，宽度为20-100微米，其它部分为透明。在经氧化处理的硅片（p型, 厚500微米, 直径4英寸，晶向<100>，表面二氧化硅氧化层厚800纳米）通过旋转涂膜技术涂覆一层正性光刻胶（Shipley S1813光刻胶，Shipley, Marlborough, MA，美国），旋涂条件为2000-4000 rpm，时间为40-80秒。然后在100-120 ℃烘烤处理40-80秒以提高光刻胶的附着并除出残留的溶剂（暴光前烘），然后盖上掩膜（含设计的微流结构），使用Karl Suss MA6/BA6 光刻机(Karl Suss, Germany)进行接触式紫外线曝光30-50秒后，浸入20% Microposit 351 显影剂(Shipley)60-100秒，以洗去暴光部分的光刻胶层，然后于140-160 ℃烘箱中烘20-40分钟使微通道和溶液连接孔部分未曝光的光刻胶硬化，然后以光刻胶和SiO2-层为掩膜材料用60 ℃的40% KOH水溶液刻蚀裸露的硅片至深度为30-50微米，除去光刻胶后即制成硅片阳模。
在甲基丙烯酸甲酯单体中加入少量热引发剂偶氮二异丁腈(甲基丙烯酸甲酯单体质量的0.1-0.2%)和少量光引发剂安息香(甲基丙烯酸甲酯单体质量的0.1-0.2%),在50℃水浴加热并摇动使其溶解，然后于80-90 ℃水浴中加热15-20分钟,使单体预聚成甘油状清亮铸模溶液，沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片直接盖在预聚溶液上并压紧，使预聚溶液充满有机玻璃片与硅阳模间的缝隙，要求微流通道结构全部在有机玻璃片的下方，然后将工件水平放置。用20 W紫外灯（365 nm，距离4-5 厘米）通过有机玻璃片照射预聚溶液20-30分钟引发表面原位聚合，聚合温度15-35oC。当模具从微流控芯片基片脱去后，硅阳模凸出的微结构可以高保真的被复制为微流控芯片基片表面的微通道。将上述硅阳模用玻璃板代替可制作微流控芯片盖片。将脱模后的微流控芯片基片通道末端钻孔（溶液连接孔1、5、6和酶解液收集孔4见图1，孔径1-3毫米）用于连接溶液。将基片和盖片用水冲洗，吹干后立即将微流控芯片基片带有开口通道的一面与一片相同大小的有机玻璃盖片夹于两片玻璃片后，通过热压键合得有机玻璃微流控芯片。热压封装温度为105-110℃，施加在两片玻璃板上的压力为0.5-5公斤/平方厘米，热压时间为10-15分钟。
将6克石墨与90-150毫升浓硫酸混合，得有金属光泽的粘稠液体，用冰水冷却后，加入硝酸钾 3-6克，在用冰水冷却的情况下，分次加入10-25克高锰酸钾，混合物在35℃加热30分钟，成粘稠的黑褐色糊状液体，然后加水200-400毫升，立刻有大量气体放出，继续在98℃加热40分钟，加水到800-900毫升后加双氧水 15-30毫升，用滤布抽滤分离出氧化石墨，并用5%的稀盐酸通过抽滤洗涤，用水进一步洗涤并干燥得氧化石墨。准确称取一定量氧化石墨分散在水中，通过超声波进行剥离得氧化石墨烯水溶液，浓度为1-10毫克/毫升。取1.8毫升正硅烷乙酯与2.8毫升无水乙醇和0.92毫升0.25 摩尔/升稀盐酸混合水解2小时后，用无水乙醇稀释到5-50毫升，得浓度为10-100毫克/毫升的硅溶胶，与氧化石墨烯水溶液等体积混合得微流控芯片通道修饰溶液。
将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微流通道，使其在通道内停留2-4小时，使正硅酸乙酯充分渗入微流通道的表层。通道内多余的正硅酸乙酯用水冲去后，将0.05-0.2摩尔/升的稀盐酸注入微流通道1-3小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化经处理的有机玻璃微流控芯片通道内，1-10分钟后移出修饰溶液并干燥得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片。
然后，在硅凝胶氧化石墨烯复合膜修饰通道内注入含0.5-5 毫克/毫升1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.25-2.5毫克/毫升N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入0.5-5 毫克/毫升胰蛋白酶等蛋白酶溶液，在室温下反应3-5小时，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。
本发明通过化学氧化和超声分散由石墨粉制得氧化石墨烯水溶液，与由正硅烷乙酯水解制得的硅溶胶混合后注入表面经硅凝胶化经处理的有机玻璃微流控芯片通道内，一定时间后移出修饰溶液并干燥得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片。胰蛋白酶等蛋白酶水解酶通过氨基与通道表面氧化石墨烯的羧基形成共价键从而获得固定，得蛋白酶解微流控芯片。由于酶通过共价键固定，其自身酶解被抑制，故可以使用较大的酶量，使酶解效率大幅提高。该反应器可将蛋白质的酶解时间从传统的溶液酶解的12小时以上大幅度降低到10秒以内，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段。本发明提出的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片具有制作简便、价格低廉和稳定性高的优点，可采用注射涂布的技术批量加工。通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发其它更多用途的微流控芯片酶反应器。
本发明中使用的微流控芯片酶解反应器可采用注射涂布工艺批量加工，具有工艺简单和价格低廉的特点，在蛋白质研究、临床诊断、环境监测、生命科学研究和食品分析等领域有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明使用单十字交叉有机玻璃微流控芯片示意图。
图2为本发明中微流控芯片通道表面硅凝胶氧化石墨烯复合膜固定胰蛋白酶示意图。
图3为本发明中（a）氧化石墨烯和（b）固定有胰蛋白酶的硅凝胶氧化石墨烯复合膜扫描电子显微镜照片。
图4为本发明中基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片实物照片。
图5为本发明中蛋白微流控芯片酶解装置示意图。
图6为使用本发明制备的微流控芯片酶反应器酶解牛血红蛋白（a）和马心细胞色素 c（b）产物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。流速2.0 微升/分钟，酶解时间<10 秒，蛋白质溶液浓度200 纳克/微升 （溶于20 毫摩尔/升碳酸氢铵水溶液（pH 8.1）中），所有匹配的肽段用“*”标出。
图中标号：1、5和6为样品溶液孔，2为微流控芯片主通道，3为微流控芯片，4为酶解液收集孔，7为进样微通道，8为注射泵，9为待酶解的蛋白质样品溶液，10为硅橡胶连接管，11为蛋白酶解液收集孔，12为微流控芯片酶反应器，13为质谱点样板，14为蛋白样品酶解后获得含肽段的酶解液基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图示意图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步描述本发明：
实施例1、基于固定有胰蛋白酶的硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片
采用计算机辅助设计软件设计芯片结构，典型的设计如图1所示，由单十字交叉微流通道2和7以及溶液连接孔1、5、6和酶解液收集孔4构成，采用高分辨率(如3600 dpi)激光照排系统在透明薄膜上打印成掩膜，微通道部分为黑色线条，宽度为40微米，其它部分为透明。在经氧化处理的硅片（p型, 厚500微米, 直径4英寸，晶向<100>，表面二氧化硅氧化层厚800纳米）通过旋转涂膜技术涂覆一层正性光刻胶（Shipley S1813光刻胶，Shipley, Marlborough, MA，美国），旋涂条件为3000 rpm，时间为60秒。然后在110 ℃烘烤处理60秒以提高光刻胶的附着并除出残留的溶剂（暴光前烘），然后盖上掩膜（含设计的微流结构），使用Karl Suss MA6/BA6 光刻机(Karl Suss, Germany)进行接触式紫外线曝光40秒后，浸入20% Microposit 351 显影剂(Shipley)60-100秒，以洗去暴光部分的光刻胶层后，于150 ℃烘箱中烘30分钟使毛细管通道和溶液连接孔部分未曝光的光刻胶硬化，然后以光刻胶和SiO2-层为掩膜材料用60 ℃的40% KOH水溶液刻蚀裸露的硅片至深度为35微米，除去光刻胶后即制成硅片阳模。
在甲基丙烯酸甲酯单体中加入少量热引发剂偶氮二异丁腈(甲基丙烯酸甲酯单体质量的0.15%)和少量光引发剂安息香(甲基丙烯酸甲酯单体质量的0.15%),在50℃水浴加热并摇动使其溶解，然后于85℃水浴中加热15-20分钟,使单体预聚成甘油状清亮铸模溶液，沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片盖在预聚溶液上并压紧，使预聚溶液充满有机玻璃片与硅阳模间的缝隙，要求微流通道结构全部在有机玻璃片的下方，然后将工件水平放置。用20 W紫外灯（波长365纳米，距离4-5 厘米）通过有机玻璃片照射预聚溶液约25分钟引发表面原位聚合，聚合温度为25 oC。当模具从微流控芯片基片脱去后，硅阳模凸出的微结构可以高保真的被复制为微流控芯片基片表面的微通道。将上述硅阳模用玻璃板代替可制作微流控芯片盖片。将脱模后的微流控芯片基片通道末端钻孔（（溶液连接孔1、5、6和酶解液收集孔4见图1，孔径2毫米）用于连接溶液。将基片和盖片用水冲洗，吹干后立即将微流控芯片基片带有开口通道的一面与一片相同大小的有机玻璃盖片夹于两片玻璃片后，通过热压键合得有机玻璃微流控芯片。热压封装温度为108℃，施加在两片玻璃板上的压力为2公斤/平方厘米，热压时间为10分钟。
将6克石墨与138毫升浓硫酸混合，得有金属光泽的粘稠液体，用冰水冷却，加入硝酸钾 3.6克后，在用冰水冷却的情况下，分次加入18克高锰酸钾，混合物在35℃加热30分钟，成粘稠的黑褐色糊状液体，然后加水276毫升，立刻有大量气体放出，继续在98℃加热40分钟，加水到840毫升后，加双氧水 18毫升，用滤布抽滤分离出氧化石墨，并用5%的稀盐酸通过抽滤洗涤，然后用水洗并干燥得氧化石墨。准确称取一定量氧化石墨分散在水中，通过超声波进行剥离得氧化石墨烯水溶液，浓度为4毫克/毫升。取1.8毫升正硅烷乙酯与2.8毫升无水乙醇和0.92毫升0.25摩尔/升的稀盐酸混合水解2小时后，用无水乙醇稀释到10毫升，得浓度约为50毫克/毫升的硅溶胶，与氧化石墨烯水溶液等体积混合得微流控芯片通道修饰溶液。
将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微流通道，使其在提通道内停留3小时，使正硅酸乙酯充分渗入微流通道的表面层。通道内多余的正硅酸乙酯用水冲去后，将0.1摩尔/升的稀盐酸注入微流通道2小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化经处理的有机玻璃微流控芯片通道内，5分钟后移出修饰溶液并干燥得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片。
在硅凝胶氧化石墨烯复合膜修饰通道内注入含2 毫克/毫升1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1毫克/毫升N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入含2毫克/毫升胰蛋白酶的50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4），在室温下反应4小时，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。本发明中微流控芯片通道表面硅凝胶氧化石墨烯复合膜表面共价键固定蛋白酶示意图见图2。本发明中氧化石墨烯和固定有胰蛋白酶的硅凝胶氧化石墨烯复合膜的扫描电子显微镜照片见图3。图4为本发明中基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片实物照片。
基于固定有胰蛋白酶硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片12通过硅橡胶管10与注射泵8连接构成流动注射蛋白酶解系统，示意图见图5。蛋白样品溶液在蛋白酶解微流控芯通道内的流速为2.0微升/分钟，根据流速估算酶解时间约为10秒。从蛋白酶解微流控芯片12流出的酶解液滴在质谱点样板13上，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪测定。其中酶解牛血红蛋白和马心细胞色素 c的产物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图见图6，可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，通过检索网上数据库，发现对于牛血红蛋白和马心细胞色素 c分别有14条和11条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸分别有138个和80个，蛋白序列覆盖度分别为95%和76%，而传统溶液酶解的牛血红蛋白的蛋白序列覆盖度为75%，表明本发明中基于固定有胰蛋白酶硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片在10秒内的酶解效果优于溶液酶解12小时的结果。
实施例2、基于固定有靡蛋白酶硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片
此外，采用本发明的方法，还制备了基于固定有靡蛋白酶硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片。除酶固定步骤外，其他同实施例1。具体方法为：在硅凝胶氧化石墨烯复合膜修饰通道内注入含2 毫克/毫升1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1毫克/毫升N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入含2毫克/毫升靡蛋白酶的50毫摩尔/升的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4），在室温下反应4小时，使蛋白酶通过共价键进行固定，得固定有靡蛋白酶硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片。
通过更换固定的酶的种类（如葡萄糖氧化酶或脲酶），还可在此基础上开发新型微流控芯片酶反应器，如血糖和尿素测定用微流控芯片酶反应器等。

Claims (6)

1. 一种基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）通过光刻和化学湿法刻蚀的方法，加工出用于复制带有分离通道的微流控芯片基片的硅阳模；
（2）将热引发剂偶氮二异丁腈和光引发剂安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，于80-90℃水浴中加热15-20分钟，使其预聚成甘油状清亮铸模溶液；将此含光引发剂的铸模溶液沿微流控芯片硅阳模凸出的分离通道浇在硅阳模上并成条状，将一片有机玻璃片盖在预聚的铸模溶液上并压紧，然后用紫外光通过有机玻璃片照射预聚的铸模溶液，引发本体聚合，制作得含有微流通道的微流控芯片基片；将硅阳模用玻璃板代替，制作得微流控芯片盖片；将所述基片和所述盖片发生原位聚合的一面通过热压键合，制作得有机玻璃微流控芯片成品；  
（3）将石墨粉分散在浓硫酸中并用冰浴冷却，然后加入硝酸钾和高锰酸钾进行氧化，再加入双氧水后用稀盐酸洗涤得氧化石墨，然后将氧化石墨分散到水溶液中，用超声波进行剥离，得氧化石墨烯水溶液；将正硅烷乙酯与乙醇和稀盐酸混合水解，得硅溶胶；将硅溶胶与氧化石墨烯水溶液混合，得微流控芯片通道修饰溶液；
（4）将正硅酸乙酯注入有机玻璃微流控芯片微通道，2-4小时后正硅酸乙酯充分渗入微通道的表层；用水冲去通道内多余的正硅酸乙酯，注入稀盐酸水解1-3小时，得通道表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片，然后将硅溶胶和石墨烯水溶液混合制得的修饰溶液注入表面经硅凝胶化处理的有机玻璃微流控芯片通道内，然后移出修饰溶液，并干燥，得修饰有硅凝胶氧化石墨烯复合膜的微流控芯片；
（5）在通道内注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接着注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片；
步骤（2）中，所述有机玻璃微流控芯片通道的深度为20-50微米，底部宽度20-60微米，上部宽度50-200微米。
2. 根据权利要求1所述的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，有机玻璃盖片上对应于微流控芯片基片上通道的末端的位置钻有直径为1-3毫米的圆形小孔，用于进样和收集蛋白酶解产物。
3. 根据权利要求1所述的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述热压键合的热压温度为105-110℃，施加在两片玻璃板上的微流控芯片上的热压压力为0.5-5公斤/平方厘米，热压时间为10-20分钟。
4. 根据权利要求1所述的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述修饰溶液中，氧化石墨烯水溶液的浓度为1-10毫克/毫升，硅溶胶溶液的浓度为10-100毫克/毫升。
5. 根据权利要求1所述的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，水溶液中1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的浓度分别为0.5-5 毫克/毫升和0.25-2.5毫克/毫升，蛋白水解酶的浓度为0.5-5 毫克/毫升。
6. 由权利要求1-5之一制备方法所制备得到的基于硅凝胶氧化石墨烯复合膜的蛋白酶解微流控芯片。
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