CN104911101A - 一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属微流控芯片技术领域，具体为一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。本发明将滤纸切成条状或需要的形状，用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有溶液连接孔的塑料片，夹于两片玻璃片间后用夹具加压；然后，将该装置置于一温度为110-180℃的烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片间，可得具有纸纤维填充通道的纸芯微流控芯片，含有纸芯通道的宽度为0.5-3毫米；然后，将高碘酸溶液注入通道，使纸芯中纤维素氧化生成醛基，清洗后注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通过共价键进行固定，得蛋白酶解微流控芯片。该反应器具有加工简便、酶解时间短、样品用量少等优点。

Description

一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法

技术领域

本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。

背景技术

自从1990年瑞士Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer[1]首次提出微型全分析系统（μ-TAS）以来，微流控芯片以其体积小、液流可控、分离效率高、试剂和样品用量少、分析速度快、操作易自动化、低耗以及集成度高等等优点引起了国内外分析化学和生物医药等领域专家的广泛关注，在其方法学研究迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研究、临床诊断、药物分析、食品安全、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景[2-4]，是发展生物医药等领域高通量、多组分和低成本检测技术的理想平台。目前制约其广泛应用的瓶颈之一就是其较高的价格和较低的产量。

微流控芯片以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学研究为目前主要应用对象，是当前芯片实验室领域发展的重点。微流控芯片是把生物、医学、化学、食品、药品和环境监测等分析过程中的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几个平方厘米大的芯片上，自动完成分析全过程，具有广泛的适用性。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大应用潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等多学科交叉的崭新研究领域。

微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测中小体积样品的酶法和免疫法分析，其最重要用途之一蛋白质的酶解和分析[5]。蛋白质酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤，待测样品中的蛋白通过凝胶电泳分离后用蛋白水解酶水解成肽，然后用质谱测定其分子量得肽质量图谱，经检索有关蛋白质数据库后完成蛋白鉴定。传统的溶液酶解耗时（12小时以上），加上蛋白水解酶自身酶解产生的肽也会干扰目标蛋白的鉴定，所以溶液酶解时蛋白和酶的比例通常要求在20~40:1 [5]，以降低游离蛋白酶自身酶解的干扰，但由于使用蛋白酶浓度较低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。解决上述溶液酶解问题的主要途径就是使用固定化酶技术，通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋[6, 7]技术固定在微流控芯片通道内表面。存在的问题是由于酶不是通过共价键固定，容易流失，影响酶解效果。此外，使用的微流控芯片采用微机电加工技术制作，成本较高。研制低成本的微流控芯片酶反应器具有重要的实际意义。

本发明将滤纸切成条状或需要的形状，通过热压封装在两片热塑性透明塑料片之间得纸芯微流控芯片，具有纸纤维填充通道。纸芯不仅是热压印时形成通道的模板，也是通道中的多孔填充材料，可用于蛋白酶等生物大分子的固定。经检索国内外有关数据库，未发现纸芯微流控芯片的报道。由于纸芯中的纤维素中的糖链含有邻二羟基和羟甲基，通过化学处理可引入多种基团，可用于蛋白酶等生物大分子的固定。

本发明采用高碘酸氧化法氧化纸芯微流控芯片中的纤维素得含有醛基的氧化纤维素，胰蛋白酶等蛋白酶水解酶通过氨基与通道中氧化纸纤维上的醛基形成共价键从而获得固定。由于酶通过共价键固定，其自身酶解被抑制，故可以使用较大的酶量，使酶解效率大幅提高。该反应器可将蛋白质的酶解时间从传统的溶液酶解的12小时以上大幅度降低到18秒以内，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。本发明可为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段，提出的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器具有制作简便、酶解时间短、样品用量少、价格低廉和稳定性好的优点。

参考文献

[1]    Manz A, Graber N, Widmer HM. Sens. Actuators B 1990, 1, 244~248.

[2]    Dittrich, PS, Tachikawa K, Manz A. Anal. Chem. 2006, 78, 3887~3908.

[3]    Auroux PA, Iossifidis D, Reyes DR, et al. Anal. Chem. 2002, 74, 2637~2652.

[4]    Verpoorte E. Electrophoesis 2002, 23, 677~712.

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[6]    Qu HY, Wang H., Huang Y, et al. Anal. Chem. 2004, 76, 6426~6433.

[7]    Wu HL, Tian YP, Liu BH, et al. J. Proteome Res. 2004, 3, 1201~1209.。

发明内容

本发明的目的在于提出一种能够批量低成本生产，且可提高蛋白酶解效率的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。

本发明提出的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，具体步骤为：

（1）将滤纸切成宽度为0.5-3毫米的长条状或其他需要的形状，用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有溶液连接孔的透明塑料片，夹于两片玻璃片间后用夹具加压；然后，连同夹具一起置于一温度为110-180℃的烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片间，得具有纸纤维填充通道的纸芯微流控芯片,纸纤维填充通道宽度为0.5-3毫米；溶液连接孔位于纸纤维填充通道的末端；

（2）将高碘酸溶液注入纸纤维填充通道，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基，用乙二醇水溶液清洗后，注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，酶分子中的游离氨基与氧化纤维素中的醛基反应形成席夫（Schiff）碱，从而实现蛋白酶的共价键固定，得蛋白酶解微流控芯片。

本发明中，步骤(1)中所述的滤纸可通过割字机、刀片、打花器和纸张模切机进行切割。切割的滤纸形状可为需要长度的长条状，也可为单十字交叉状、栅栏状、多角形状、螺旋状等其他形状。

本发明中，步骤(1)中所述的透明塑料片材质可为有机玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚氯乙烯等热塑性塑料。

本发明的步骤(1)中热压封装温度为110-180℃，热压封装时间为5-15分钟。

本发明的步骤(1)中使用的滤纸为厚度为100-300微米的定性或定量滤纸。

本发明的步骤(1)中，可使用长尾票价、金属文具夹和其他能产生压力的夹具对夹有纸芯的两片塑料片施加压力，使用的压力为1-15公斤/平方厘米。

本发明步骤(1)中，所述的纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道的末端位置的溶液连接孔为直径1~3毫米的圆形小孔。

本发明步骤(2)中，所述蛋白酶可为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶。

本发明步骤(2)中，所述高碘酸溶液的浓度为0.01-0.5 mol/L，蛋白酶的浓度为0.5-10毫克/毫升。

本发明步骤(2)中，所述高碘酸溶液氧化纸纤维填充通道的时间为10-60分钟，温度为10-40℃。

本发明步骤(2)中，所述蛋白酶溶液与通道内的氧化纤维素的反应时间为10-60分钟，温度为0-20℃。

本发明提出的一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，进一步详述如下:

将厚度为0.1-2毫米的热塑性透明塑料板裁成需要制备的芯片尺寸的小片2或4，一般长30-100毫米，宽10-20毫米。塑料片材质可为有机玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚氯乙烯等热塑性塑料。将厚度为100-300微米的定性或定量滤纸通过割字机、刀片、打花器或纸张模切机切成宽度为0.5-3毫米的条状，或其他需要的形状，如单十字交叉、栅栏、多角形、螺旋等。如图1所示，滤纸条或其他需要形状的滤纸片1可用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片2（下塑料片）上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有直径为1~3毫米的溶液连接孔的透明塑料片4（上塑料片），夹于玻璃片3和6间后用夹具施加外压5。然后，将该装置置于一温度为110-180℃的烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片2和4间，可得具有纸纤维填充通道7的纸芯微流控芯片,含有纸芯的通道7的宽度为0.5-3毫米。纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7的末端与溶液连接孔9连接。可使用长尾票价、金属文具夹和其他能产生压力的夹具对夹有纸芯的两片塑料片2和4施加压力，封装使用的压力为1-15公斤/平方厘米。本发明的制备的芯片可为单通道（图2A）、多通道（图2B）、单十字交叉(图4A)、栅栏式(图4B)、多角形和螺旋纸芯微流控芯片。

将含有0.01-0.5 mol/L高碘酸的100mmol/L乙酸盐缓冲溶液（pH 4.0）溶液通过溶液连接孔9注入纸纤维填充通道7，在室温下反应10-60分钟，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基，用0.2 mol/L乙二醇水溶液清洗后，注入0.5-10毫克/毫升蛋白酶溶液，在0-20℃反应10-60分钟。酶分子中的游离氨基与氧化纤维素中的醛基反应形成席夫（Schiff）碱，从而实现蛋白酶的共价键固定（反应式见图5），得蛋白酶解微流控芯片。蛋白酶可为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白组学和蛋白质分析中常用的蛋白水解酶，其中最常用的是胰蛋白酶。

将本发明制备的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器14通过硅橡胶连接管12与注射泵10相连接，构成纸芯微流控芯片蛋白酶解系统（见图6），蛋白质样品溶液11用20毫摩尔/升碳酸氢铵水溶液（pH 8.1）制备，通过注射泵10注入纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器14，流速为5-50微升/分钟。流出的酶解液收集在小离心管中。质谱分析时，样品点在质谱点样板15上，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，可得蛋白样品酶解液的肽质量图谱16，经检索有关蛋白质数据库后完成蛋白鉴定。

本发明首次提出了一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法，通过热压封装纸芯的方法制备纸芯微流控芯片，在纸纤维填充通道中通过共价键固定蛋白酶后得蛋白酶解反应器。由于纸纤维填充通道为多孔材料，表面积大，可提高蛋白酶的固定量。纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器提高了酶试剂的使用效率，节约了蛋白酶，不仅降低了蛋白酶解的成本，也大幅提高了蛋白酶解的效率。本发明中提出的纸芯微流控芯片制备方法，不需要使用昂贵的微机电加工技术和设备，具有快速简便、设备简单和成本低廉的优点，在微流控芯片的批量低成本生产方面有良好的应用前景。本发明中制备的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器，在蛋白质研究、临床诊断、环境监测、生命科学研究和食品分析等领域有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明中热压封装法制备纸芯微流控芯片流程示意图。其中，（A）将滤纸条或其他需要形状的滤纸片1，用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片2上；（B）盖上另外一片同样尺寸的钻有溶液连接孔的透明塑料片4；（C）夹于两片玻璃片3和6间后用夹具施加外压5；（D）该装置于烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片2和4间；（E）移去玻璃片3和6后得具有纸纤维填充通道7的纸芯微流控芯片8。

图2为采用本发明中热压封装技术制备的（A）单通道和（B）11通道纸芯微流控芯片的实物照片以及（C）通道末端连接有纸纤维填充通道7的溶液连接孔9的显微镜照片。

图3为本发明制备的纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7断面的显微镜照片的显微镜照片。其中，（A）为放大10倍，（B）为放大50倍。

图4为（A）采用本发明中热压封装技术制备的（A）单十字交叉和（B）栅栏式纸芯微流控芯片的实物照片。

图5为本发明中纸芯微流控芯片中纸纤维高碘酸氧化形成氧化纤维素及其胰蛋白酶与氧化纤维素固定化反应实现共价键固定的反应式。

图6为图5为本发明中蛋白微流控芯片酶解系统示意图。

图7为使用本发明制备的纸芯微流控芯片酶反应器酶解牛血清白蛋白（A）和溶菌酶（B）产物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。流速10微升/分钟，酶解时间<18 秒，蛋白质溶液浓度200 纳克/微升（溶于20 毫摩尔/升碳酸氢铵水溶液（pH 8.1）中），所有匹配的肽段用“*”标出。

图中标号：1为滤纸条或其他需要形状的滤纸片，2为下塑料片，3为下玻璃片，4为上塑料片，5为外压，6上玻璃片，7为纸纤维填充通道，8为纸芯微流控芯片，9为溶液连接孔，10注射泵，11为待酶解的蛋白质样品溶液，12为硅橡胶连接管，13为蛋白酶解液收集孔，14为纸芯微流控芯片酶反应器，15为质谱点样板，16为蛋白样品酶解后获得含肽段的酶解液基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图示意图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图进一步描述本发明：

1、单通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法

将厚度为1毫米的有机玻璃板裁成需要制备的芯片尺寸（60毫米×16毫米×1毫米）的小片2或4。将厚度为200微米的定性滤纸通过刀片切成长度为54毫米宽度为2毫米的纸条1。如图1所示，用水润湿后贴在裁成芯片大小的有机玻璃片2上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有直径为2毫米的溶液连接孔的有机玻璃片4，夹于玻璃片3和6（76.2毫米×25毫米×1.2毫米）间后用弹簧驱动加压装置施加外压5，压力为6公斤/平方厘米。然后，将该装置置于一温度为130℃的鼓风烘箱中加热10分钟后，纸芯被封装在两片塑料片2和4间，与玻璃片3和6分离后可得具有纸纤维填充通道7的单通道纸芯微流控芯片，含有纸芯的通道7的宽度为2毫米。图2A为单通道纸芯微流控芯片的实物照片。如图2C所示，纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7的末端与溶液连接孔9连接。图3为本发明制备的纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7断面的显微镜照片的显微镜照片。可见纸纤维微流通道完整，两有机玻璃片2和4间无裂缝，封装质量良好。

将含有0.2 mol/L高碘酸的100 mmol/L乙酸盐缓冲溶液（pH 4.0）溶液通过溶液连接孔9注入单通道纸纤维填充通道7，在室温下反应30分钟，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基。通道中残留的未反应的去高碘酸需用0.2 mol/L乙二醇水溶液清洗除去。然后，通过溶液连接孔9注入0.5-10毫克/毫升的胰蛋白酶溶液，在4℃反应30分钟。酶分子中的游离氨基与氧化纤维素中的醛基反应形成席夫（Schiff）碱，从而实现胰蛋白酶的共价键固定（反应式见图5），得单通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器。蛋白酶还可为糜蛋白酶、胃蛋白酶等。

将本发明制备的单通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器14通过硅橡胶连接管12与注射泵10相连接，构成单通道纸芯微流控芯片蛋白酶解系统（见图6），牛血清白蛋白和溶菌酶等蛋白质样品溶解在20毫摩尔/升碳酸氢铵水溶液（pH 8.1）中得样品溶液11，通过注射泵10注入纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器14，流速为18微升/分钟。流出的酶解液收集在小离心管中。分析前样品点在质谱点样板15上，用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，所得蛋白样品酶解液的肽质量图谱见图7。可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，通过检索网上数据库，发现对于牛血清白蛋白和溶菌酶分别有39条和15条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸分别有337个和118个，蛋白序列覆盖度分别为55%和80%，而传统溶液酶解的牛血清白蛋白和溶菌酶的蛋白序列覆盖度分别为47%和61%，表明本发明中纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器在18秒内的酶解效果优于溶液酶解12小时的结果。

2、11通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法

将厚度为1毫米的聚苯乙烯板裁成需要制备的芯片尺寸（60毫米×16毫米×1毫米）的小片2或4。然后，将厚度为200微米的定性滤纸通过刀片切成11条长度为10毫米宽度为2毫米的纸条1。如图1所示，用水润湿后贴在裁成芯片大小的聚苯乙烯片2上，如图2B所示，要求11条滤纸条与聚苯乙烯片短边平行，相邻两个滤纸条间距为5毫米。滤纸条晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有直径为2毫米的溶液连接孔的聚苯乙烯片4，如图2B所示。要求溶液连接孔在聚苯乙烯片4长边两侧，溶液连接孔需与滤纸条末端连接。然后，将夹有11条滤纸条的两片聚苯乙烯片夹于玻璃片2和4（76.2毫米×25毫米×1.2毫米）间后用弹簧驱动加压装置施加外压5，压力为6公斤/平方厘米。然后，将该装置置于一温度为120℃的鼓风烘箱中加热10分钟后，11条纸芯被封装在两片塑料片2和4间，与玻璃片3和6分离后可得具有11条纸纤维填充通道7的11通道纸芯微流控芯片。采用与单通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器太阳的方法在纸纤维填充通道中固定胰蛋白酶，可得11通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器，可用于蛋白的多通道同时酶解。以满足蛋白质分析中样本量大、需要高通量的蛋白酶解反应器的需求。此外，这11条通道中可分别固定不同的酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶等，以获得基于不同蛋白水解酶的样品蛋白酶解液的肽质量指纹图谱，为蛋白的结构分析提供进一步的信息。

3、单十字交叉和栅栏式纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法

为了应对多个样品和批量蛋白样品的酶解，还可加工单十字交叉和栅栏式纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器，方便样品的引入。通过割字机或纸张模切机将厚度为200微米的定性滤纸切割成图4所示的单十字交叉和栅栏的图形。单十字交叉纸芯微流控芯片纸芯由一条长通道（54毫米×2毫米）和一条短通道（10毫米×2毫米）构成，在短通道的中点相互交叉。栅栏式纸芯微流控芯片纸芯由一条长通道（54毫米×2毫米）和11条短通道（10毫米×2毫米）构成，长通道和11条短通道在短通道的中点相互交叉，要求11条滤纸条与有机玻璃片短边平行，相邻两个短通道间距为5毫米。将厚度为1毫米的有机玻璃板裁成需要制备的芯片尺寸（60毫米×16毫米×1毫米）的小片2或4。下塑料片2无孔，而对应的同尺寸的上塑料片在所有的纸纤维填充通道的末端都钻有溶液连接孔与填有纸芯的通道相连。芯片的封装和蛋白酶的固定同实施例1。

Claims (9)

1. 一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）将滤纸切成宽度为0.5-3毫米的各种需要的形状，用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有溶液连接孔的透明塑料片，夹于两片玻璃片间后用夹具加压；然后，连同夹具一起置于一温度为110-180℃的烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片间，得具有纸纤维填充通道的纸芯微流控芯片,纸纤维填充通道宽度为0.5-3毫米；溶液连接孔位于纸纤维填充通道的末端；

（2）将高碘酸溶液注入纸纤维填充通道，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基，用乙二醇水溶液清洗后，注入蛋白酶溶液，酶分子中的游离氨基与氧化纤维素中的醛基反应形成席夫碱，从而实现蛋白酶的共价键固定，得蛋白酶解微流控芯片；

其中，滤纸切成的形状为长条状、单十字交叉状、栅栏状、多角形状或螺旋状。

2. 根据权利要求1所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的透明塑料片材质为有机玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚氯乙烯。

3. 根据权利要求1所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的的滤纸为厚度为100-300微米的定性或定量滤纸。

4. 根据权利要求1所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的夹具加压的压力为1-15公斤/平方厘米。

5. 根据权利要求1所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的纸纤维填充通道的末端位置的溶液连接孔为直径1~3毫米的圆形小孔。

6. 根据权利要求1-5之一所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶或胃蛋白酶。

7. 根据权利要求6所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述高碘酸溶液的浓度为0.01-0.5 mol/L，蛋白酶的浓度为0.5-10毫克/毫升。

8. 根据权利要求7所述的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述高碘酸溶液氧化纸纤维填充通道的时间为10-60分钟，温度为10-40℃；所述蛋白酶溶液与通道内的氧化纤维素的反应时间为10-60分钟，温度为0-20℃。

9. 由权利要求1-8之一所述制备方法制备得到的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器。