CN103007262B - 一种防龋dna疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于口腔预防医学技术领域，本发明提供了一种防龋DNA疫苗，从变形链球菌UA159基因组中提取壁连相关蛋白A（wapA）蛋白全长基因并克隆至真核表达载体pVAX1中。为了提高其免疫能力，本发明还将该疫苗以壳聚糖为载体制备成壳聚糖纳米复合物。本发明还提供了该防龋DNA疫苗的制备方法以及应用。本发明的防龋DNA疫苗安全性高，能表达天然抗原，免疫应答持久，有效防龋。

Description

一种防龋DNA疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于口腔预防医学技术领域，具体涉及一种防龋DNA疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

龋病的发病率仅次于流感，严重影响人类健康和生存质量。由于我国人口众多、医疗资源有限，龋病的发病率远远高于发达国家，研制易于普及的龋病疫苗以防治龋病、降低龋病发病率对于保障国民健康显得尤为重要。

变形链球菌（Streptococcusmutans下称变链菌）能够与牙面紧密粘附并定植于牙面，产生酸性代谢产物，引起牙齿脱矿最终导致龋齿，是人类主要的致龋菌。葡糖基转移酶（glucosyltranferaesGTFs）和表面蛋白（surfaceproteinantigenPAc）,葡聚糖结合蛋白（glucan-bindproteins,GBPs）及变形链球菌壁相关蛋白A（wall-associatedproteinAgene，wapA）是变形链球菌的重要抗原物质。这些抗原成分参与介导细菌的粘附，在免疫学方面有重要意义。现在所研究变链菌的防龋疫苗多利用这几种抗原物质，将这几种基因编码的DNA疫苗载入体内，可诱导血液、唾液中相应IgG、sIgA抗体的产生，有效控制龋病的发生和发展。有HongQian和MyLienDao的研究表明wapA与细菌聚集相关（HongQianandMyLienDao.InactivationoftheStreptococcusmutansWall-AssociatedProteinAGene(wapA)ResultsinaDecreaseinSucroseDependentAdherenceandAggregation.InfectImmun,1993.61(12):5021-5028）。LinZhu和JensKreth等通过实验证明wapA在细菌非蔗糖依赖性的聚集中扮演了重要角色，Real-timeRT-PCR显示蔗糖对wapA的基因有抑制作用，蔗糖浓度降低后，wapA开始大量表达（ZhuL,KrethJ,CrossSE,etal.Functionalcharacterizationofcell-wall-associatedproteinWapAinStreptococcusmutans.Microbiology,2006,152（8）：23952404）。ThomasK.Han等经过一系列的体外实验认为WapA起了双重粘附作用，介导了葡聚糖和细胞外基质蛋白（尤其是Ⅰ型胶原）的粘附（HanTK,ZhangC,DaoML.Identificationandcharacterizationofcollagen-bindingactivityinStreptococcusmutanswall-associatedprotein:Apossibleimplicationindentalrootcariesandendocarditis.BiochemBiophysResCommun.2006,343(3):787-792）。

目前尚无文献报道将wapA用于制备DNA疫苗，并应用于防龋的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防龋DNA疫苗，本发明的另一目的是提供该防龋DNA疫苗的其制备方法与应用。

本发明提供了一种防龋DNA疫苗，是由变形链球菌UA159的wapA蛋白全长基因和真核表达载体pVAX1质粒构成，由于单纯的DNA疫苗进入人体后很快会被核酸酶降解，很难进入细胞，为了进一步提高DNA疫苗的免疫能力，本发明将该DNA疫苗以壳聚糖作为载体制备成壳聚糖纳米复合物，以期刺激机体免疫应答，产生抗wapA抗体，阻断变形链球菌的粘附和菌斑形成，从而应用于抗龋齿。

本发明提供了一种防龋DNA疫苗，该疫苗中的DNA是由变形链球菌UA159的wapA蛋白全长基因和真核表达载体pVAX1质粒构成。

所述的一种防龋DNA疫苗，该疫苗中的DNA序列如SEQIDNO:1所示。

本发明的另一方面，提供了上述的防龋DNA疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

（1）wapA蛋白全长表达基因的克隆；

以UA159基因组为模板扩增获得wapA蛋白全长基因后，根据wapA蛋白全长表达序列（GENBANK号：NC_004350.2）及pVAX1/lacz质粒序列设计并合成如下引物：

pVAX1-wapA-F：CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT

（如SEQIDNO:2所示）；

pVAX1-wapA-R：CATGGGCCCTTAACGACGTGTTCTATAGA

（如SEQIDNO:3所示）；

（2）pVAX1-wapA重组质粒的构建；

将（1）中获得的wapA基因片段插入到pVAX1（pVAX1/lacz）质粒中，构建pVAX1-wapA重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞DH-5α，重组质粒酶切鉴定正确后送测序，序列如SEQIDNO:1所示

（3）DNA疫苗壳聚糖纳米复合物的制备；

壳聚糖（CS）溶解在NaAc缓冲液（PH=6.0），与含有Na₂S0₄的pVAX1-wapA质粒溶液分别预先加热到50～55℃，10min，等体积迅速混合，涡旋1min，室温放置30min，即得DNA疫苗壳聚糖纳米复合物。

所述的壳聚糖纳米复合物DNA疫苗的配方具体如下：

质粒pVAX1-wapA364μl（含有质粒100μg）

壳聚糖0.5mg/ml，364μl

Na₂SO₄15mmol/L。

本发明的第三方面，提供了上述的防龋DNA疫苗在制备免疫防龋药物中的应用。所述的防龋是指防止非蔗糖依赖型龋齿的形成。

本发明将防龋靶标wapA应用于防龋DNA疫苗的制备之中，利用wapA蛋白在非蔗糖依赖型龋齿形成中的重要作用，扩大了DNA疫苗在防龋免疫中的应用范围。同时，本发明将利用壳聚糖纳米粒无毒、安全、有效的穿细胞能力，制备DNA疫苗壳聚糖纳米复合物，从而提高DNA疫苗的免疫效率。本发明安全性高，能表达天然抗原，免疫应答持久，有效防龋。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。

附图说明

图1是以变形链球菌UA159菌株基因组为模板克隆wapA全长基因电泳鉴定图；

1PCR扩增产物，在1400bp有wapA条带

2marker2000。

图2是pVAX1-wapA和pVAX1限制性内切酶酶切电泳鉴定图；

1pVAX1-wapA经kpnI酶单酶切得到4.3Kb片段

2pVAX1经kpnI和EcoRI双酶切得到3.1Kb片段

3pVAX1-wapA经kpnI和EcoRI双酶切得到3.0Kb和1.4Kb两个片段

410Kmarker。

图3是重组质粒pVAX1-wapA结构示意图；

图4是凝胶阻滞实验电泳鉴定图；

其中1为pVAX1-wapA，2为marker，3，4为DNA疫苗壳聚糖纳米复合物。图5是壳聚糖纳米复合物在人胚肾293A细胞转染能力实验电泳鉴定图；

1-7:使用引物pVAX1-wapA-F如SEQIDNO:2所示；

pVAX1-wapA-R如SEQIDNO:3所示；

9-10：使用引物wapRTf如SEQIDNO:4所示

wapRTr如SEQIDNO:5所示

1：去离子水

2：转染Blank

3:转染pVAX1/lipo

4：转染pVAX1-wapa

5：转染pVAX1-wapa/cs

6：转染pcdna-wapa/lipo

7：pVAX1-wapa

8：marker2000

9：去离子水

10：pVAX1-wapa

11：marker2000。

图6是小鼠血清IgG抗体浓度(血清样品1:600,000稀释)检测结果示意图；

A组pVAX1-wapA/CS纳米复合物

B组pVAX1对照组

C组CS溶液对照组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pVAX1/lacz（购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录）；构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用的宿主菌为DH5α（购自GIBCO公司）；插入的外源基因为：UA159变形链球菌的WapA基因。

实施例1：防龋DNA疫苗——pVAX1-wapA的构建

一、变形链球菌的培养

将冻存的变形链球菌UA159菌株（上海交通大学医学院附属第九人民医院赠送，参见文献：黄正蔚、刘正、马瑞、唐子圣、朱彩莲，变形链球菌电击转化条件的优化研究，《中国微生态学杂志2007年第5期2页404-405页）划线培养与BHI平板培养基（商品化平板培养基，购自上海恒远生物科技有限公司）上，培养条件为37℃厌氧培养（80%N₂10%CO₂10%H₂）。挑取平板上长出的单克隆接种至TY培养基（1%tryptone0.8%yeastextractpH5.0）中，密闭条件下于37℃振荡培养。收集菌液用于后续试验。

二、变形链球菌UA159菌株基因组的获得：

使用细菌基因组提取试剂盒（BacterialDNAExtractionKit(Solutiontype)，biotekecorporation）提取UA159基因组。步骤简述如下：

1、取2ml菌液，10000rpm，离心30秒。弃上清，收集菌体，尽可能的吸净上清。

2、加入200μl缓冲液RB重悬洗涤细胞，10000rpm，离心30秒，弃上清后再次将菌体重悬于200μl缓冲液RB中。

3、加入50~100μllysozyme（10mg/mlin10mMTris-HCl，pH8.0），颠倒混匀，37℃温育30-60min。10000rpm离心2min，弃上清后将菌体再次重悬于200μl缓冲液RB中。

4、加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒充分混匀，再加入20μl蛋白酶K（20mg/ml），溶液，充分混匀，70℃放置10min。

5、冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。

6、将上一步溶液及可能出现的絮状沉淀移至吸附柱AC中，（吸附柱套入收集管中）10000rpm离心30s，弃废液。

7、加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30min，弃废液。

8、加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。

9、加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。

10、吸附柱AC放回收集管中，13000rpm离心2min。

11、取出吸附柱AC，放入一干净离心管中，在吸附膜中部加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱液65-70℃预热），室温放置3-5min，12000离心1min。

三、wapA蛋白全长基因的克隆及载体构建

为了获得wapA蛋白全长表达基因，以上述基因组为模板，设计合成引物如下：

pVAX1-wapA-F：CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT

（如SEQIDNO:2所示）；

pVAX1-wapA-R：CATGGGCCCTTAACGACGTGTTCTATAGA

（如SEQIDNO:3所示）；

并按下述PCR体系及扩增条件克隆wapA基因。

PCR反应体系及扩增条件如表1和表2所示：

表1：PCR反应体系

表2：PCR反应扩增条件

循环结束后，产物经电泳（见图1）鉴定大小正确后于4℃保存，长期保存需移至-20℃或-80℃条件。

PCR产物的酶切及纯化：根据PCR产物的浓度，用KpnⅠ和EcoRⅠ（fermentas）双酶切。酶切反应体系如表3所示：

表3：PCR产物的酶切反应体系

体系配置完成后，于37℃恒温酶切2h，酶切片段以DNA片段胶回收试剂盒纯化回收，纯化产物保存于-20℃。

质粒DNA的提取：划线接种于LB固体培养基（含1‰氨苄青霉素）上，过夜挑取单克隆于含3mlLB液态培养基（含1‰氨苄青霉素）的培养管中，37℃280rpm摇床培养过夜。以Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，步骤如下：

1、取1-4ml在LB培养基中得培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清；

2、加250μlBufferS1重悬沉淀；

3、加250μlBufferS2，温和并充分的上下翻转4-6次混匀使菌体充分裂解，至形成通亮的溶液

4、加350μlBufferS3，温和并充分上下翻转混合6-8次。12000g离心10min。

5、将上清移至制备管（置于2ml离心管中），12000g离心1min，弃滤液；

6、将制备管放回离心管，加500μlBufferW1,12000g离心1min弃滤液；

7、将制备管放回离心管，加700μlBufferW2,12000g离心1min弃滤液；

8、重复一次步骤7；

9、将制备管放回离心管，12000g离心1min；

10、将制备管移入新的离心管中，在制备管膜中央加60-80μl去离子水，室温静置1min。12000g离心1min。

提取所得质粒电泳鉴定后保存于-20℃。

质粒的酶切及纯化：根据PCR产物的浓度，用KpnⅠ和EcoRⅠ（fermentas）双酶切。酶切反应体系如表4所示：

表4：质粒的酶切反应体系

体系配置完成后，于37℃恒温酶切2h，酶切片段以DNA片段胶回收试剂盒纯化回收，纯化产物保存于-20℃。

重组质粒的构建：将PCR酶切纯化产物与质粒酶切纯化产物按表5配置连接体系：

表5：PCR酶切产物与质粒酶切产物连接体系

16℃连接过夜。

连接产物的转化：具体步骤如下：

1、连接体系轻轻混合后于16℃连接过夜；

2、10μl连接产物与50μlDH5α感受态细胞混合于1.5ml无菌离心管管中，冰浴30min；

3、迅速将离心管移至42℃水浴90s；

4、移至冰上，冰浴2min

5、冰浴结束后，向离心管中加入950μl已37℃预热的LB液态培养基（无抗生素），37℃200rpm摇床培养1h；

6、培养液于4000g离心2min，弃去900μl上清；

7、轻柔吹打使菌体重悬于剩余的100μl培养基中；

8、将菌体悬液涂平板（氨苄青霉素抗性），37℃培养过夜。

9、挑取单克隆接种至含相应抗生素的含有3mlLB液体培养基的培养管中，37培养过夜；

10、提取质粒，双酶切鉴定（步骤与体系同前）。

11、双酶切鉴定结果（见图2）为阳性（含插入片段，大小与wapA一致）的质粒送测序(英潍捷基（上海）贸易有限公司)。

根据测序结果及载体序列，绘制DNA疫苗图谱（见图3）及全序列如SEQIDNO:1所示。

实施例2：DNA疫苗壳聚糖纳米复合物的制备

为了提高DNA疫苗的免疫能力，以Na₂SO₄为絮凝剂，通过自组装法制备DNA疫苗壳聚糖纳米复合物。

组装步骤为：壳聚糖（CS）溶解在NaAc缓冲液，与含有Na₂S0₄的DNA疫苗溶液分别预先加热到50～55℃，10min，等体积迅速混合，涡旋1min，室温放置30min，即得DNA疫苗壳聚糖纳米复合物，具体配方条件见表6。取纳米粒悬液100μl，用去离子水补足1ml后用ZetasiserNanoZS激光粒度分析仪（英国Malvern公司）测定纳米粒的平均粒径、粒径分布及Zeta电位。结果表明那米粒大小均一，粒径分布范围窄，结果如表7。取纳米粒悬液和未包装的DNA疫苗进行琼脂糖凝胶电泳分析（如图4），结果发现形成纳米复合物的质粒迁移被完全阻滞，表明纳米粒实际zeta电位和包封率与测定结果一致。

表6：DNA疫苗壳聚糖纳米复合物的配方

表7：DNA疫苗壳聚糖纳米复合物粒径

实施例3：pVAX1-wapA和DNA疫苗壳聚糖纳米复合物真核表达能力检测试验流程如下：

1、293Acell以1×10⁶cells/well的密度铺6孔板，过夜待细胞贴壁。

2、转染293cells：

a、制备pVAX1-wapA/cs，壳聚糖溶液；

b、pVAX1、pVAX1-wapA4μg和lipo10μl分别与250μl无血清培养基轻柔混合，静置5min；

c、将混有质粒和lipo的无血清培养基轻柔混合，室温静置15-20min，总操作时间不超过25min；pVAX1-wapA/cs（含pVAX1-wapA4μg、壳聚糖溶液、pVAX1-wapA4μg与500μl无血清培养基轻柔混合；

d、将混合液加入6孔板中，6h后换含血清的培养液；

e、48h后TRIzol法提取总RNA，步骤如下：①直接在6孔细胞培养板中加入1ml/孔的TRIzol裂解细胞，移液器吸打数次后移至1.5mlRNasefree离心管中。②室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。③各离心管加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。④4℃，12000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层（RNA主要在水相中）。⑤将水相移至新离心管，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟。⑥4℃，12000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现的胶状沉淀即为RNA。移去上清。⑦用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。至少加1ml75℅乙醇。4℃，7500×g离心5分钟，弃上清。⑧将RNA样品晾干（不要彻底干燥，会影响溶解能力），加适量DEPC水溶解，-80℃保存。

3、使用RTMasteMixPerfectRealTime(TaKaRa)逆转录试剂盒获得cDNA，步骤如下：

a、在RNase-free微量离心管中配置下列反应体系：

表8逆转录反应体系

b、按下述反应条件进行反转录：37℃15min，85℃5s，4℃。

4、以该cDNA为模板，分别以序列pVAX1-wapA-F，pVAX1-wapA-R为引物进行PCR鉴定，电泳结果如图5。结果发现阳性对照组（以Lipofectamine2000转染）和DNA疫苗壳聚糖纳米复合物组可检测到wapA基因的表达，而裸质粒和空白组无法检测到。结果表明DNA壳聚糖纳米复合物中质粒未变性失活，且改善DNA疫苗的穿细胞能力，从而提高其免疫能力。

实施例4：本发明DNA疫苗的免疫应答实验

为了验证pVAX1-wapA/cs的有效性，我们将雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）随机分为3组,8只/组，经股四头肌注射途径免疫，实验分组见表9：

表9实验分组

首次免疫后一周加强免疫一次。免疫前和首次免疫后1、2、3、4、5周分别收集血清样本。

双抗夹心ELISA法检测血清中IgG抗体水平，发现小鼠血清中抗体水平分析显示，免疫前A、B、C组IgG抗体水平没有明显差异（P＜0.01），首次免疫后1、2、3、4、5周A组与B、C组IgG抗体水平都有显著差异（P＜0.01），A组血清中IgG抗体水平明显高于B、C组（图6），A组相比B组IgG抗体水平升高表明pVAX1-wapA/cs通过肌肉注射，促进pVAX1-wapA进入细胞，并表达的wapA蛋白，成功诱导小鼠免疫系统产生相应的IgG抗体。A组相比C组IgG抗体水平升高排除了IgG抗体升高是由于壳聚糖的作用。实验结果证实了该DNA疫苗首次免疫一周后即可成功刺激小鼠产生免疫反应体内经肌肉注射途径可以有效诱导机体产生免疫应答，相应抗体的产生。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(A)wapA蛋白全长基因克隆；

(B)pVAX1-wapA重组质粒的构建；

(C)载pVAX1-wapA的壳聚糖纳米复合物DNA疫苗的构建：

壳聚糖溶解在NaAc缓冲液，pH＝6.0，与含有Na₂SO₄的pVAX1-wapA溶液分别预先加热到50～55℃，10min，等体积迅速混合，涡旋1min，室温放置30min，即得；

上述疫苗中的DNA是由变形链球菌UA159的wapA蛋白全长基因和真核表达载体pVAX1质粒构成；其中的DNA序列如SEQIDNO:1所示；上述DNA疫苗以壳聚糖作为载体制备成壳聚糖纳米复合物。

2.根据权利要求1所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，其中的步骤(A)具体为：

(a)变形链球菌的培养：将变形链球菌UA159菌株划线培养于BHI平板培养基上，以期获得单克隆菌株，培养条件为80％氮气、10％二氧化碳、10％氢气、37℃厌氧培养；挑取单克隆接种至TY培养基中，TY培养基为1％蛋白胨、0.8％酵母浸粉、pH5.0，37℃密闭振荡培养；

(b)提取基因组：以细菌基因组提取试剂盒，提取UA159基因组；

(c)wapA蛋白全长基因克隆：

设计并合成如下引物，以变形链球菌UA159基因组为模板扩增获得wapA蛋白全长基因：

pVAX1-wapA-F如SEQIDNO:2所示；

pVAX1-wapA-R如SEQIDNO:3所示。

3.根据权利要求1所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，其中的步骤(B)具体为：

将步骤(A)获得的wapA基因片段插入到pVAX1质粒中，构建pVAX1-wapA重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞DH-5α，提取纯化的重组质粒pVAX1-wapA作为DNA疫苗。

4.根据权利要求1所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述的DNA疫苗壳聚糖纳米复合物，组成和配比如下：

质粒pVAX1-wapA364μl，其中含有质粒100μg，

壳聚糖0.5mg/ml，364μl

Na₂SO₄15mmol/L。

5.如权利要求1、2、3或4所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法制备得到的防龋DNA疫苗。

6.一种如权利要求5所述的防龋DNA疫苗在制备免疫防龋药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的防龋DNA疫苗在制备免疫防龋药物中的应用，其特征在于，所述的防龋是指防止非蔗糖依赖型龋齿的形成。