CN102998278A - 可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法，解决了现有中药成分复杂，难以实现在线快速检测的问题，利用近红外光谱分析技术，通过校正模型建立、校正模型验证、校正模型应用等步骤实现对金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的快速在线检测，不破坏产品外包装、精度高、可靠性好。

Description

可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法

技术领域

本发明涉及一种中药成份的含量测定，具体的说是可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法。

背景技术

由马应龙药业集团股份有限公司独家生产的复方中药散剂金玄痔科熏洗散是由玄明粉、马齿苋、金银花、枯矾、荆芥精制而成的纯中药制剂，为国家中药保护品种（保护品种编号：ZYB2072010078）。其含有绿原酸及枯矾等重要成份，为了保证产品功效，对成品散剂中制备全过程从原辅料采购、验收入库、生产全过程中间产品控制、成品检验测定一直必须进行质量控制环节，目前金玄痔科熏洗散主要成分的传统和法定检测方法较多，这些方法操作繁琐、耗时，严重制约生产效率和过程控制质量，不能满足生产过程中快速实时监测产品含量的要求，因此，迫切需要开发一种快速分析方法，对金玄痔科熏洗散生产全过程进行实时监控，以便及时发现和解决问题，保证产品的质量。

另一方面，金玄痔科熏洗散本身组份多（主要已知成份就达5种）、工艺复杂，散剂中各组分成份在下述情况都可能会发生变化：1、不同批次的产品中各组分含量因提取、制备过程因素影响可能会发生变化，从而对产品的质量控制具有指导意义；2、当对产品存放一段时间后，各组分含量也可能会变化，从而对药品有效期的设定具有重要影响。因此，为保证药品质量，有必要采用建立更先进，更有效，更灵敏专属的方法既可以鉴别产品主要组分含量的有无、又可以在不破坏产品外包装的情况下有效反映产品各组分的含量，有效提高金玄痔科熏洗散的质量。但是未见任何有关于对金玄痔科熏洗散中各组分采用各种快速检测方法在不破坏外包装情况下实现快速鉴别和含量检测方法的报道。

近红外区域是人们最早发现的非可见光区域。但由于物质在该谱区的倍频和合频吸收信号弱，谱带重叠，解析复杂，受当时的技术水平限制，近红外光谱一直未作很好的应用。目前由于近红外光在常规光纤中具有良好的传输特性，使近红外光谱在在线分析领域得到了很好的应用，并取得良好的社会效益和经济效益，从此近红外光谱技术进入一个快速发展的新时期。但是作为常规检查目前还未药品生产质量管理过程中实现很好的推广。

近红外光谱分析技术的特点如下：

与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术具有诸多优点，它能在几分钟内，仅通过对被测样品完成一次近红外光谱的采集测量，即可完成其多项性能指标的测定（最多可达十余项指标）。光谱测量时不需要对分析样品进行前处理；分析过程中不消耗其它材料或破坏样品；分析重现性好、成本低。

但近红外光谱分析也存在固有的缺点：1、它的测试灵敏度比较低，相对误差比较大；2、因为它是一种间接测量手段，因此测量精度永远难以达到该参考方法的测量精度；3、近红外光谱的测量范围，只适合对含氢基团的组分或与这些组分相关的属性进行测定，而且组分的含量一般应大于0.1%才能用近红外进行测定。这是目前近红外光谱法难以应用于分析复方中药散剂中各组分含量的主要原因。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种方法简单、在线检测准确性好、精度高、成本低的，可实现多项性能指标的测定。

本发明由以下步骤实现：

（1）校正模型建立：采集金玄痔科熏洗散作为建模样品，采用理化检查和/或高效液相色谱法测定分别测定分枯矾和/或绿原酸的含量和性质，然后扫描该样品的近红外光谱，采用近红外光谱设备自带的定量或定性软件完成相应的枯矾和/或绿原酸模型的建立；

（2）校正模型验证：取金玄痔科熏洗散样品，在于步骤（1）相同条件下测定其近红外吸收光谱，根据步骤（1）建立的模型计算样品中枯矾和/或绿原酸含量的含量预测值，并与经理化检查和/或高效液相色谱法测定测定的含量值进行比较，以验证模型的准确性；

（3）校正模型应用：采用近红外光谱设备扫描得到待测样品的近红外光谱图，将特征光谱信息输入建立的校正模型，实现对金玄痔科熏洗散样品中的枯矾和/或绿原酸含量的在线检测。

所述步骤（1）中，枯矾的测定方法为：取金玄痔科熏洗散0.75g，精密称定，置坩埚中，在400～500℃炽灼至完全灰化，放冷至室温，加水50ml分次溶解并移入250ml锥形瓶中，加pH4.8的醋酸-醋酸铵缓冲液20ml，再精密加入0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠滴定液25ml，加热微沸10分钟，放冷至室温；加二甲酚橙指示液1～2ml，用0.05mol/L的锌滴定液滴定至溶液由淡黄色转为浅红色，并将滴定结果用空白试验校正，即得到枯矾在金玄痔科熏洗散中的含量，其中每1ml的乙二胺四醋酸二钠滴定液相当于12.90mg的KAl(SO₄)₂。

含量结果=乙二胺四醋酸二钠滴定液ml数×12.90mg

所述绿原酸使用高效液相色谱法作为检测方法：

（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸为体积比为10:90:0.2的流动相；检测波长325nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；

（2）对照品溶液的制备：称取绿原酸对照品，加甲醇：水（体积比1：1）制成每1ml甲醇含40μg绿原酸的溶液，并在10℃以下保存备用；

（3）供试品溶液的制备：取金玄痔科熏洗散1.0g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加甲醇：水（体积比1：1）45ml，超声处理30分钟，放冷至室温，加50%甲醇稀释至50ml刻度，摇匀，滤过后备用；

（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定绿原酸的含量。

所述近红外光谱扫描范围为12000～3800 cm^-1，光谱分辨率为8 cm^-1，扫描次数为32或64 次，得到近红外光图谱。

发明人研究发现，由于金玄痔科熏洗散中的枯矾和/或绿原酸中的氢基含量大于0.1%百分质量，因此非常适用于近红外光分析。本发明扫描样本12000～3800cm^-1的近红外光谱图，同时采用传统方法测定样本各成分的含量，并将测量结果作为参考值。接着应用化学计量学技术建立起样品光谱与成分含量之间的多元校正模型。当检测未知成分含量的金玄痔科熏洗散时，只需按照同样方法测得其近红外光谱，利用已建立的校正模型便可以快速地得到相应成分的含量信息，实现金玄痔科熏洗散中的枯矾和/或绿原酸的快速在线检测。

有益效果

（1）．通过对检验方法和条件的控制和选择，对供试检验样品可以在不破坏包装和样品的情况下进行在线检测，可同时或单独检测枯矾和绿原酸，进一步解决了中药成分繁杂难分离不易检测的问题。。

（2）．样品峰纯度高，基于方法学研究基本要求理论板数及分离度要求，且准确性好，精确度高，重复性实验结果RSD仅为3.0%。

（3）．通过对不同批次中药散剂中枯矾和/或绿原酸含量的测定，可以反应不同批次间各组分的含量变化，对调整工艺、原料配方优化等研究具有重要意义；通过对中药散剂置放不同时间后枯矾和/或绿原酸含量的测定，从而可以对其有效期的确定具有重要参考价值。

（4）．本发明适用于金玄痔科熏洗散生产过程中的以下各方面的枯矾和/或绿原酸的含量检测：金玄痔科熏洗散各原辅料、物料入库的快速鉴别定性、定量验收；中间产品过程控制及定性、定量检测，快速确定金玄痔科熏洗散产品中间体的组成与结构；金玄痔科熏洗散中间体物料的混合均匀性验证及在线过程控制；成品的定性、定量检测。

（5）．本发明提供的基于近红外光谱技术测定金玄痔科熏洗散的枯矾和/或绿原酸含量检测的方法操作简单、快速、准确性高。与传统的检测方法相比，大大缩短了分析测量时间，不需要配制反应试剂，不需要进行检验样品配制或预处理，节省了大量的人力物力，特征光谱与各成分含量线性关系良好，使金玄痔科熏洗散的质量得到有效保障。

附图说明

1.图1为样品集近红外原始谱图（ThermoFisher）。

2.图2为金玄痔科熏洗散中枯矾一阶导数+（7302.01-4207.24）原始谱图（ThermoFisher）。

3.图3为金玄痔科熏洗散中绿原酸+（7481.13-4196.05cm-1）原始谱图（ThermoFisher）。

4.图4为金玄痔科熏洗散中枯矾定量模型相关图（ThermoFisher）。

5.图5为金玄痔科熏洗散中绿原酸定量模型相关图（ThermoFisher）。

6.图6为样品集近红外原始谱图（Bruker）。

7.图7为金玄痔科熏洗散中枯矾的定量模型图（Bruker）。

8.图8为金玄痔科熏洗散中绿原酸的定量模型图（Bruker）。

具体实施方式

1.实施例1：Thermofisher近红外测定实例

2.1测试样品

金玄痔科熏洗散(马应龙药业集团股份有限公司生产)样品呈现粘稠膏状，置于塑料袋中利用透反射积分球专用模块测试。标准样品为46个。

2.2近红外光谱的采集

使用仪器：Thermofisher公司AntarisII傅立叶近红外分析仪；

采样附件：粘稠液体采样附件

分辨率：8.0cm-1；

光谱扫描范围：10000-3800cm-1；

扫描次数：32次；

扫描时间：约16s

2.3近红外分析结果

1）样品原始谱图见图1。

2）化学计量学软件：TQ Analyst专业版。

3）定量算法：选择目前NIR分析中最常用的偏最小二乘回归（PLS）

4）选取的建模光谱波段：

a) 枯矾 一阶导数+（7302.01-4207.24），具体如图2。

b) 绿原酸 原始谱图+（7481.13-4196.05cm-1），具体如图3。

5）定量模型的相关图如图4和图5。

a) 图4为枯矾NIR 计算值与参考标准值之间的相关图，“o”表示参与建模样品。从图中可以看出，枯矾计算值与参考标准值之间的相关系数为0.6542，校正均方差RMSEC 为2.61。

测定未知含量的金玄痔科熏洗散样品近红外谱图，利用建立的模型计算出枯矾的近红外测试值，并与化学计量值比较，枯矾的化学检测方法如下：

取本品约0.75g，精密称定，置坩埚中，在400～500℃炽灼至完全灰化，放冷至室温，加水50ml分次溶解并移入250ml锥形瓶中，加醋酸-醋酸铵缓冲液（pH4.8）20ml，再精密加入乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）25ml，加热微沸10分钟，放冷至室温。加二甲酚橙指示液1～2ml，用锌滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由淡黄色转为浅红色，并将滴定结果用空白试验校正，即得。每1ml的乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）相当于12.90mg的KAl(SO₄)₂。

两种检测方法的结果详见下表：

b)图5为绿原酸NIR 计算值与参考标准值之间的相关图，“o”表示参与建模样品。从图中可以看出，绿原酸计算值与参考标准值之间的相关系数为0.7664，校正均方差RMSEC 为0.194。测定未知含量的金玄痔科熏洗散样品近红外谱图，利用建立的模型计算出绿原酸的近红外测试值，并与化学计量值比较，绿原酸的化学检测方法如下：

使用液相色谱作为检测方法。

色谱条件与系统适用性试验   以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(体积比：10:90:0.2)为流动相；检测波长325nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备  精密称取绿原酸对照品，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

供试品溶液的制备  取本品1.0g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加50%甲醇45ml，超声处理30分钟，放冷至室温，加甲醇：水（体积比：1：1）稀释至50ml刻度，摇匀10分钟，0.45um精密滤过，即得。

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

两种检测方法的结果详见下表：

2.4结果总结和讨论：

枯矾和绿原酸模型的相关系数均良好。

2.5在线检测：采用上述近红外光谱设备直接扫描得到带有外包装的金玄痔科熏洗散成品得到相应的近红外光谱图，将特征光谱信息输入建立的校正模型，获得金玄痔科熏洗散成品中枯矾和绿原酸的含量值为3.21。

2.实施例2：Bruker近红外测定实例

3.1测试样品

金玄痔科熏洗散样品呈现粘稠膏状，置于塑料袋中利用透反射积分球专用模块测试。标准样品为56个。

3.2实验仪器：

Bruker 公司生产的MATRIX-F 型傅里叶变换近红外光谱仪，配有固体漫反射探头，OPUS 软件和定量、定性分析软件包。

3.3测试方法：

光谱扫描范围(12000～4000cm^-1)，光谱分辨率(8cm^-1)，扫描次数(64次)，得到吸光度光谱。

3.4评价参数

1）决定系数R² 表示近红外预测值与化学值之间拟合程度的统计信息，其表达式如下：

$R^2=(1-\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(y_i-\stackrel{\‾}{y_i})}^2}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(y_i-y_m)}^2})\×100\%$

其中

为第i 个样品的近红外预测值；

y_i 为第i 个样品的化学值(真值)；

y_m 为样品真值的平均值；n为样品数。

2）均方差RMSCEV 体现了建模样品的化学值与近红外预测值之间误差的统计情况，其表达式如下：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{{\mathrm{\Σ}(y_i-\stackrel{\‾}{y_i})}^2}{n}}$

其中

为第i 个样品的近红外预测值；

y_i 为第i 个样品的化学值(真值)；n 为样品

3）维数Rank 表示建模过程中为消除无用信息及节省运算时间，对原始的光谱数据和含量数据进行有效的主成分提取，在化学计量学中被称为“主因子数”。

4）近红外模型是通过多元回归方程建立的，不同于其他光谱、色谱分析中所建立的工作曲线(一元回归方程)，仅通过决定系数R2 是难以充分评价模型好坏的。因此，均方差RMSECV在评价模型优劣方面更为重要。

5）近红外模型是通过大量样品所建立的多元回归方程，体现了建模样品的整体统计结果；因此，在对非建模样品进行预测效果的考察时，应比较非建模样品的整体统计情况，而不是只针对某一个或某几个样品进行比较，这样难以对近红外模型做出客观、真实的评价。

3.5近红外分析结果

1）金玄痔科熏洗散近红外谱图见图6。

2）金玄痔科熏洗散中枯矾的定量模型：

采用56 个建模样品的光谱及其对应的化学分析值，使用近红外定量分析软件进行模型优化和交叉验证，其结果如图7 所示。测定未知含量的金玄痔科熏洗散样品近红外谱图，利用建立的模型计算出枯矾的近红外测试值，并与化学计量值比较（检测方法详见实例1），两种方法的检测结果详见下表：

3）金玄痔科熏洗散中绿原酸的定量模型：

采用56 个建模样品的光谱及其对应的化学分析值，使用近红外定量分析软件进行模型优化和交叉验证，其结果如图8 所示。测定未知含量的金玄痔科熏洗散样品近红外谱图，利用建立的模型计算出枯矾的近红外测试值，并与化学计量值比较（检测方法详见实例1），两种方法的检测结果详见下表：

3.6结果总结和讨论：

从模型建立的趋势可以看出，金玄痔科熏洗散的枯矾、绿原酸的近红外交叉检验值与化学分析值具有一定的拟合效果，进一步证明了本次近红外实验的可行性，即完全可以实现近红外光谱技术用于金玄痔科熏洗散组分的定量分析。

3.7在线检测：采用上述近红外光谱设备直接扫描得到带有外包装的金玄痔科熏洗散成品得到相应的近红外光谱图，将特征光谱信息输入建立的校正模型，获得金玄痔科熏洗散成品中枯矾和绿原酸的含量值为3.17。

Claims (4)

1.一种可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）校正模型建立：采集金玄痔科熏洗散作为建模样品，采用理化检查和/或高效液相色谱法测定分别测定分枯矾和/或绿原酸的含量和性质，然后扫描该样品的近红外光谱，采用近红外光谱设备自带的定量或定性软件完成相应的枯矾和/或绿原酸模型的建立；

（2）校正模型验证：取金玄痔科熏洗散样品，在于步骤（1）相同条件下测定其近红外吸收光谱，根据步骤（1）建立的模型计算样品中枯矾和/或绿原酸含量的含量预测值，并与经理化检查和/或高效液相色谱法测定测定的含量值进行比较，以验证模型的准确性；

（3）校正模型应用：采用近红外光谱设备扫描得到待测样品的近红外光谱图，将特征光谱信息输入建立的校正模型，实现对金玄痔科熏洗散样品中的枯矾和/或绿原酸含量的在线检测。

2.如权利要求1所述的可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，枯矾的测定方法为：取金玄痔科熏洗散0.75g，精密称定，置坩埚中，在400～500℃炽灼至完全灰化，放冷至室温，加水50ml分次溶解并移入250ml锥形瓶中，加pH4.8的醋酸-醋酸铵缓冲液20ml，再精密加入0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠滴定液25ml，加热微沸10分钟，放冷至室温；加二甲酚橙指示液1～2ml，用0.05mol/L的锌滴定液滴定至溶液由淡黄色转为浅红色，并将滴定结果用空白试验校正，即得到枯矾在金玄痔科熏洗散中的含量，其中每1ml的乙二胺四醋酸二钠滴定液相当于12.90mg的KAl(SO₄)₂，

含量结果=乙二胺四醋酸二钠滴定液ml数×12.90mg。

3.如权利要求1所述的可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法，其特征在于，绿原酸使用高效液相色谱法作为检测方法：

（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸为体积比为10:90:0.2的流动相；检测波长325nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；

（2）对照品溶液的制备：称取绿原酸对照品，加体积百分数甲醇：水（1：1）制成每1ml甲醇含40μg绿原酸的溶液，并在10℃以下保存备用；

（3）供试品溶液的制备：取金玄痔科熏洗散1.0g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加甲醇：水（体积比1：1）45ml，超声处理30分钟，放冷至室温，加50%甲醇稀释至50ml刻度，摇匀，滤过后备用；

（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定绿原酸的含量。

4.如权利要求1所述的可在线测定金玄痔科熏洗散中枯矾和/或绿原酸含量的方法，其特征在于，所述近红外光谱扫描范围为12000～3800 cm^-1，光谱分辨率为8 cm^-1，扫描次数为32或64 次，得到近红外光图谱。

Images