CN1029976C - 还原甲硫氨酸亚砜残基的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将肽和蛋白质中的甲硫氨酸亚砜残基还原成甲硫氨酸残基的方法，该方法的特征在于：将所述的肽或蛋白质置于基本上无水的三氟乙酸反应介质中，该介质含有约0.1M至约3M的有机硫化物、约0.01M至约3M的卤酸，所述的卤酸选自盐酸、氢溴酸和氢碘酸。
Description
甲硫氨酸的亚砜氧化产物是自然界及合成肽化学中常见的衍生物。由于所述产物较易形成，使它成为通常存在于大多数由天然源分离出的含有甲硫氨酸的肽中的杂质。
最为可取的是，采用经过提纯的肽，以避免易形成亚砜的贮藏条件〔Toennies，G.，和Callan，T.P.（1939）J.Biol.Chem.129，481〕。一经氧化，降低了的母体硫醚的亲核性使氨基酸变得对其他的改性不敏感。这是其应用于肽合成〔Iselin，B.（1961）Helv.Chim.Acta 44，61〕和蛋白质改性研究〔Tashjian，A.Ont jes，D.，和Munson，P.L.（1964）Biochem.3，1175〕的基础。除了在合成时需要进行可逆保护外，一经提纯，甲硫氨酸的氧化倾向，使众多研究人员选用其他氨基酸代替之〔Kempe，T.Chow，F.，Peterson，S.M.，Baker，P.Hays，W.，Opperman，G.L′Italein，J.J.，Long，G.和Paulson，B.（1986）Biotechnology 4，565;Krstenansky，J.L.，Trivedi，D.，Johnson，D.，和Hruby，V.（1986）J.Am.Chem.Soc.108，1696;Schalch，D.，Reisman，D.，Emler，C.，Humbel，R.Li，C.H.Peters，M.，和Lau，E.（1984）Endocrinology 115，2490〕。
对含有甲硫氨酸亚砜的肽进行选择性和非破坏性还原是肽化学中经常遇到的难题〔Kessler，W.，和Iselin，B（1966）Helv.Chim.Acta 49，1330〕。最常用的方法是：于高温下，采用高浓度的还原剂，例如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇来完成还原作用〔Houghten，R.A.，和Li，C.H.（1979）Anal.Biochem.98，36〕。该反应的速度缓慢，整个过程通常产生不完全的还原。另一种可供选择的还原方法是：分别在下述溶液中，
用甲硫醚或苯硫基甲烷，促进氧交换。所述溶液是HCl水溶液〔Savige，W.E.，和Fontana，A.（1977）Adv.in Enzymology 47，453;Shechter，Y（1986）J.Boil.Chem.261，66〕，无水HF〔Tam.J.P.，Heath，W.F.，和Merrifield.R.B.（1983）J.Am.Chem.Soc.105，6442〕，1M的三氟甲磺酸-TFA〔Fujii，N.，Kuno，S.，Otaka，A.，Funakoshi，S.，Takagi，K.，和Yajami，H.（1985）Chem.Pharm.Bull.，Jpn.33，4587〕。在这些情况下，还原反应较易进行，并能保持不同程度的二硫化物的完整性。然而，值得注意的是，暴露在具有上述性质的一类强酸下可能产生的副作用。
在相当一段时间里已认识到，卤酸可用来催化，将氧从亚砜上转移而成硫醚〔Scorrano.G.（1973）Acc.Chem.Res.6，132〕。Savige和Fontana（见上文）首先明确地描述了采用12N HCl和甲硫醚来还原游离的（即不是蛋白质部分）甲硫氨酸亚砜的方法;还介绍了该方法应用于氧化的溶菌酶衍生物的成功实例，其中所产生的副反应最小。他们得出结论：“该反应的条件相当严格，需要采用高浓度的HCl。”最近，Shechter（见上文）报道，采用甲硫醚和不定浓度的HCl，对蛋白质中的甲硫氨酸亚砜进行类似的还原。他推断：“当HCl的浓度为4.4-10.7M时，反应继续进行，直至完成;而当HCl的浓度较低（即1.0M）时，还原反应极大地减慢。”在上述两项研究中，均未对次要的改性进行高性能分析。
一般认为，甲硫氨酸亚砜在无水HF或1M的三氟甲磺酸-TFA中发生还原的机理不同于其在HCl水溶液中进行还原的机理。据信，在这些无水强酸中，还原程度随着混合物的酸度而变化，并不依赖于酸性阴离子的亲核性。已报道的有效还原反应，使不希望有的改性降到了最低水平。然而，由于溶剂的苛性，要求特别处理的预防措施，这样，其用途就受到了严格的限制。
本发明旨在提供一种简易且具有高度选择性的方法，用以处理含有
甲硫氨酸亚砜残基的蛋白质和肽，以便有选择地将所述残基还原成甲硫氨酸残基。具体地说，本发明方法是：采用比先有技术方法中采用的更为温和的反应条件，进行还原反应。
因此，本发明的目的在于提供一种这样的方法，即：对含有一个或多个甲硫氨酸亚砜残基的肽和蛋白质进行处理，以便将所述残基还原成甲硫氨酸残基。该方法包括：将所述肽或蛋白质置于基本上无水的三氟乙酸反应介质中，所述反应介质含有约0.01M至约3M的有机硫化物、约0.01M至约3M的卤酸，所述卤酸选自盐酸、氢溴酸和氢碘酸。
如上所述，本发明涉及一种选择性地将含有甲硫氨酸亚砜残基的蛋白质和肽还原成其含甲硫氨酸残基对应物的方法。该方法主要可用于从成熟的、具有生物活性的产物的氧化前体产生成熟的、具有生物活性的产物。所述氧化前体常常是由于合成产生蛋白质或肽时所采用的条件而形成的。在任一反应步骤的过程中，包括对希望得到的蛋白质或肽进行合成和提纯的过程，使用甲硫氨酸残基氧化成亚砜形式的条件是会出现的。如果没有可行的方法，用于将甲硫氨酸残基恢复成其还原态，就很难获得大量具有适当尺寸的理想产物，至少在大规模生产成熟产物时是如此。
本发明的方法于溶剂三氟乙酸中实施。虽然不是绝对必需的，但最好在基本无水的条件下实施本发明方法，因此要采用基本上无水的三氟乙酸。采用“基本上无水的”三氟乙酸，并不意味着需要采取切实的措施，以排除存在的微量水份，而仅意味着应避免加水。
将待还原的蛋白质或肽与有机硫化物和卤酸一起加到三氟乙酸中。可按任何次序加入所述试剂。但较理想的是，先将蛋白质或肽溶解于三氟乙酸中，此后，加入有机硫化物，接着加入卤酸。
加到三氟乙酸中的蛋白质或肽的量一般应使浓度达到约0.01mg至约100mg/ml，较理想的是约0.1mg至约20mg/ml，更理想的是约1mg至约
10mg/ml。
在三氟乙酸中，使蛋白质或肽同有机硫化物和某种卤酸反应。除了活性硫醚部分外，可采用众多的有机硫化物，唯一的要求是：这些有机硫化物在本发明方法的条件下应该是惰性的。典型的硫醚的实例包括甲硫醚、乙硫醚、乙基甲基硫醚、苯硫醚、二硫苏糖醇、半胱氨酸等。优选的硫醚是二烷基硫醚，其中每个烷基基团含1至3个碳原子。本发明方法中采用的最优选硫醚是甲硫醚。
将有机硫化物加到反应混合物中，以产生约0.01M至约3M的浓度。较理想的浓度为约0.1M至约1M，更理想的浓度为约0.5M至约1M。
其余的必需试剂是卤酸。卤酸选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸。较好的卤酸是盐酸。反应混合物中卤酸的含量一般为约0.01M至约3M。较理想的是，卤酸含量为约0.1M至约1M。在上述含量范围内，若被处理的蛋白质或肽含一个或多个二硫键，则最好在所述范围的下限实施本发明的方法;若不存在二硫化物，则可在所述范围的上限实施本发明的方法。
虽然，如上所述，最好在无水条件下实施所述方法，但由于加入了卤酸，通常会在反应混合物中掺入一定量的水份。因为所用卤酸的总量很少，并且它可通过以高浓度酸形式而掺入，所以，实际上仅有少量水被加到混合物中。按本发明的方法，这种加入量是完全可以允许的。
可在较宽的温度范围内，例如一般为约4℃至约45℃，实施本发明方法。最理想的是在室温（约20℃至约25℃）下进行反应。
还原反应的发生通常相当迅速。虽然反应可持续很长时间，如6小时，但短至5分钟也可完成反应。通常，反应进行时间为约30分钟至约90分钟。
一旦还原反应结束，可采用众多公知的回收技术中的任何一种，收集所期望的产物。
以下实施例用于说明本发明的方法，并不是对发明范围的限制。
实施例1
对H-Phe-Met（O）-Gly-Pro-Glu-Thr-NH2（FM（O）GPET-NH2）的处理
将肽FM（O）GPET-NH（2.15mg）溶解于1.72ml无水三氟乙酸（TFA）中。将肽溶液分成每份80μl的十七份等分液，取其中一份等分液作为对照物。该对照物不含甲硫醚（DMS）或盐酸（HCl）。将不同量的DMS加到其余的16份肽溶液中，使浓度达到0.01M至1M再加入浓盐酸，使HCl浓度达到0.01N至1N。开始时剧烈地搅拌溶液，然后于室温下使溶液保持静止状60分钟。加入900μl 0.1%的TFA水溶液，从而终止反应。
采用Altex Ultrasphere ODS逆相柱（46×25cm），经高效液体色谱法（HPLC）测定化学改性的程度。在0.1% TFA水溶液中，于45℃下，通过以线性梯度增加的乙腈达到洗脱，进行色谱法分离。根据214nm处的峰面积测定法进行定量。经过TFA/DMS/HCl处理的FM（O）GPET-NH2产生了肽，这种肽显示出与合成的标准FMGPET-NH2相同的色谱滞留时间。研究结果显示于以下表1中。
表1
FM（O）GPET-NH2的还原作用
HCl 浓度，N DMS浓度，M1形成的 剩余的
FMGPET-NH2，% FM（O）GPET-NH2，%
0 0 0 100
0 .01 0 98
0 0.1 0 95
0 1.0 3 89
.01 0 4 95
.01 .01 10 86
.01 0.1 11 84
.01 1.0 12 85
0.1 0 4 96
0.1 .01 57 41
0.1 0.1 54 41
0.1 1.0 68 33
1.0 0 4 85
1.0 .01 94 0
1.0 0.1 93 0
1.0 1.0 95 0
1在无水的三氟乙酸中
实施例2
对GRF（1-45）Met（O）27，Lys45-OH的处理
将GRF（1-45）Met（O）27，Lys45-OH（1.68mg）溶解于1.5ml无水三氟乙酸（TFA）中。先后将100μl甲硫醚（DMS）、10μl浓盐酸加到900μl的肽溶液中。剧烈地混合溶液，于室温下使之保持静止状。于
加入盐酸后的5、15、30、60分钟时，各取出60μl反应混合物溶液等分液。用氮气对每一试样进行干燥;加0.1%TFA水溶液，将其稀释至1.2ml。在60分钟结束时，再次将浓HCl（7.6μl）加到其余的肽溶液（760μl）中，并再次剧烈地混合该溶液，然后于室温下使之保持静止状。在开始加入HCl后的第65、75、90、120和180分钟时，各取出60μl的等分液，如上所述，用氮气干燥，用0.1% TFA水溶液稀释。
采用多孔层实心球C逆相柱（.46×10cm），经高效液体色谱法（HPLC）测定化学改性程度。在0.1%的TFA水溶液中，于45℃下，利用以线性梯度增加的乙腈达到洗脱，进行色谱法分离。根据214nm时的峰高测定法进行定量。经TFA/DMS/HCl处理的GRF（1-45）Met（O）27，Lys45-OH产生出一种肽，这种肽具有与合成的标准GRF（1-45）Met27，Lys45-OH相同的液体滞留时间。研究结果显示于以下表2中。
表2
GRF（1-45）Met（O）27，Lys45-OH的还原作用
时间（分钟） 产生的GRF（1-45）Met27，Lys45-OH，%
5 64
15 92
30 98
60 93
65 96
75 97
90 95
120 93
180 88
实施例3
对胰高血糖素Met（O）27的处理
将胰高血糖素Met（O）27（1.32mg）溶解于660μl 1M的DMS与无水三氟乙酸（TFA）的溶液中。取30μl的等分液，用氮气将其干燥，并在1.2ml 0.1%的TFA水溶液中加溶之，得到未处理的对照物。将肽/TFA/DMS的溶液分成六份。将不同量的浓HCl和色氨酸加到各份溶液中，剧烈地混合各溶液，然后于室温下使溶液保持静止状60分钟。加入色氨酸的目的在于：使胰高血糖素的25位内色氨酸的破坏程度减至最低。从各溶液取出各60μl的等分液，迅速用氮气干燥，用1.2ml 0.1%的TFA水溶液稀释，进而使反应中止。在60分钟结束时，再次将浓HCl加到其余的肽溶液中。剧烈地搅拌混合物，然后于室温下使之保持静止状。在第二次加入HCl的六十分钟后，取每一溶液的等分液各60μl，按上所述用氮气干燥，用12ml 0.1%的TFA水溶液稀释。采用杜邦C8逆相柱（.46×25cm），经高效液体色谱法（HPLC），测定化学改性的程度。在0.1M、pH为7的磷酸铵中，于45℃，利用增加线性梯度的乙腈达到洗脱，进行色谱法分离。根据在214nm处的峰面积测定法进行定量。经过TFA/DMS/HCl处理的胰高血糖素Met（O）27产生了一种肽，这种肽显示出与合成的标准胰高血糖素相同的色谱滞留时间。该研究结果如以下表3所示。
表3
胰高血糖素Met（O）27的还原
色氨酸 还原时间 HCl，浓 胰高血糖 其余的胰高血
浓度，M1，2（分） 度，N 素收率% 糖素Met（O），%
0 60 .1 38 10
0 60 .1 40 8
0 120 .2 28 2
0 120 .2 25 1
10 60 .1 68 7
10 60 .1 66 7
10 120 .2 58 1
10 120 .2 59 1
100 60 .1 75 17
100 60 .1 76 15
100 120 .2 83 1
100 120 .2 81 1
1以相当于胰高血糖素的摩尔浓度表示
2DMS的浓度为1M
实施例4
对IGF-I，Met（O）59的处理
将IGF-I，Met（O）59（0.90mg）溶解于0.90ml的无水三氟乙酸（TFA）中。将该肽溶液分成8份每份100μl的等分液。用氮气将样品1、2、7和8干燥，然后进行处理。除了将编号为偶数的试样转化成半胱氨酰磺酸盐外，还使每对试样（即：1和2，3和4，5和6，7和8）都经相同的处理，然后测定。将不同量的无水TFA、甲硫醚（DMS）和浓盐酸加到试样中。剧烈地混合该溶液，然后于室温下使之保持静止状。在第一次加入盐酸
的30分钟后，再次将浓盐酸加到其中一些试样中。在30分钟或60分钟结束时，通过用0.1%的TFA水溶液稀释，或对中性溶液进行亚硫酸根络分解（sulfitolysis），使所有试样的反应中止。
采用杜邦C8Reliance逆相柱（.6×4cm），经高效液体色谱法（HPLC）测定化学改性程度。在0.1M、pH为7的磷酸铵中，于45℃下，通过增加线性梯度的乙腈达到洗脱，进行色谱法分析。根据214nm处的峰面积测定法进行定量。经过TFA/DMS/HCl处理的IGF-I，Met（O）59产生一种肽，这种肽显示出与合成的标准IGF-I相同的色谱滞留时间。下面的表4显示了研究结果。
表4
IGF-I Met（O）59的还原
样品 TFA， HCl浓 DMS浓 时间 还原作 IGF-I
编号 μl 度，M 度，M （分钟） 用，% 收率，%
110 0 0 0 0 -
210 0 0 0 0 -
3 100 .1 1 30 80 672
4 100 .1 1 30 80 693
5 100 .2 1 60 93 562
6 100 .2 1 60 97 863
7 0 4.4 .5 30 6.9 ＜12
8 0 4.4 .5 30 10 4.53
1对照物
2鉴定为二硫化物
3鉴定为S-磺酸盐（在亚硫酸根络分解后）
Claims (8)
1、一种处理含有一种或多种甲硫氨酸亚砜残基的肽和蛋白质以便将所述残基还原成甲硫氨酸残基的方法，该方法包括：使所述的肽或蛋白质置于基本上无水的三氟乙酸反应介质中其浓度为0.01mg/ml至100mg/ml，所述介质含有0.01M至1M的有机硫化物、0.01M至1M的卤酸，所述卤酸选自盐酸、氢溴酸和氢碘酸，其反应温度为4℃至45℃。
2、根据权利要求1的方法，其中蛋白质或肽的浓度为0.1mg/ml至20mg/ml。
3、根据权利要求1的方法，其中有机硫化物是二烷基硫醚，其中每一烷基基团含1至3个碳原子。
4、根据权利要求3的方法，其中有机硫化物为甲硫醚。
5、根据权利要求1的方法，其中在反应混合物中的有机硫化物的浓度为0.1M至1M。
6、根据权利要求5的方法，其中在反应混合物中的有机硫化物的浓度为0.5M至1M。
7、根据权利要求1的方法，其中的囟酸为盐酸。
8、根据权利要求1的方法，其中在反应混合物中的囟酸的浓度为约0.1M至约1M。
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