CH675879A5

CH675879A5 -

Info

Publication number: CH675879A5
Application number: CH3045/88A
Authority: CH
Inventors: Richard Dennis Dimarchi; Harlan Beall Long
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1987-08-24
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1990-11-15
Also published as: DK465588A; CN1031538A; SE8802941L; CA1315482C; FR2619820B1; GB2209033A; IL87479A0; GB8819861D0; CN1029976C; FR2619820A1; HUT48560A; IT1226864B; DE3828287A1; DK465588D0; JPH02262590A; IT8821716A0; BE1004198A3; US4835254A; SE8802941D0; KR890003798A

Description

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Beschreibung

Das Sulfoxidoxidationsprodukt von Methionin ist ein Derivat, welches man häufig in der Natur antrifft, und ebenfalls in der synthetischen Peptidchemie. Wegen der Leichtigkeit, durch welches es gebildet wird, ist es eine übliche Verunreinigung in den meisten Methionin enthaltenden Peptiden, die aus natürlichen Quellen isoliert worden sind.

Es ist daher mit-gereinigten Peptiden äusserst tatsam, Lagerungsbedingungen zu vermeiden, bei welchen die Sulfoxidbildung begünstigt wird [Toennies, G. und Callan, T.P. (1939) J.Biol.Chem. 129,481]. Einmal oxidiert, macht die reduzierte Nucleophilizität (nucleophilicity) des Stamm-Thioethers die Aminosäure weniger anfällig für andere Modifikationen. Das ist die Basis ihrer Verwendung in der Peptidsynthese [Iselin, B. (1961) Helv.Chim.Acta 44, 61] und Protein-Modifikations-Studien [Tashjian, A., Ontjes, D. und Munson, P.L. (1964) Biochem. 3,1175]. Durch die Neigung des Methionins, wenn es einmal gereinigt ist, zu oxidieren, zusätzlich zu den Anforderungen eines reversiblen Schutzes in der Synthese, wurden viele Forscher dazu verleitet, es durch alternative Aminosäuren zu substituieren [Kempe, T., Chow, F., Pe-terson, S.M., Baker, P., Hays, W., Opperman, G., L'Italien, J.J., Long, G. und Paulson, B. (1986) Bio-technology 4, 565; Krstenansky, J.L., Trivedi, D., Johnson, D. und Hruby, V. (1986) J.Am.Chem.Soc. 108, 1696; und Schalch, D., Reisman, D., Emier, C., Hubel, R., Li, C.H., Peters, M. und Lau E. (1984) Endocrinology 115,2490].

Die selektive und zerstörungsfreie Reduktion von Methionin-Sulfoxid enthaltenden Peptiden stellte ein sich wiederholendes Problem in der Peptidchemie dar [Kessler, W. und Iselin, B. (1966) Helv.Chim.Acxta 49, 1330]. Erst kürzlich wurde die Reduktion durch Verwendung hoher Konzentrationen von Reduktionsmitteln, wie z.B. Dithiothreitol oder ß-Mercaptoethanol, bei erhöhten Temperaturen erzielt [Houghten, R.A. und Li, C.H. (1979) Anal.Biochem. 98, 36]. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist langsam und das Verfahren ergibt im allgemeinen eine unvollständige Reduktion. Ein alternatives Mittel zur Reduktion war die Dimethylsulfid- oder Thioanisol-Beschleunigung des Sauerstoffaustausches in wäss-riger Chlorwasserstoffsäure [Savige, E.E. und Fontana, A. (1977) Adv. in Enzymology 47, 453; Shech-ter, Y. (1986) J.Biol.Chem. 261, 66], wasserfreier HF [Tarn, J.P., Heath, W.F. und Merrifield, R.B. (1983) J. Am.Chem.Soc. 105, 6442], 1m Trifluormethansulfonsäure-TFA [Fujii, N., Kuno, S., Otaka, A., Funa-koshi, S., Takagi, K. und Yajami, H. (1985) Chem.Pharm.Bull., Jpn. 33, 4587]. In diesen Fällen ist die Reduktion leicht und ein variabler Grad der Unversehrtheit von Disulfid kann aufrecht erhalten werden. Von beträchtlichem Interesse sind jedoch die potentiellen sekundären Konsequenzen, welche durch den Einfluss starker Säuren dieser Art erzielt werden.

Seit einiger Zeit wurde erkannt, dass Halogensäuren den Übergang von Sauerstoff von einem Sul-foxid zu einem Sulfid katalysieren [Scorrano, G. (1973) Acc.Chem.Res. 6, 132]. Savige und Fontana, supra, waren die ersten, welche die Reduktion von freien (nämlich nicht Teil eines Proteins) Metheonin-suifoxids unter Verwendung von 12 normaler Chlorwasserstoffsäure und Dimethylsulfid beschrieben. Die erfolgreiche Anwendung für ein oxidiertes Lysozym-Derivat mit minimalen Möglichkeiten von sekundären Nebenreaktionen wurde auch beschrieben. Die Autoren folgerten, dass «die Reaktionsbedingungen sehr streng sind und man Chlorwasserstoffsäure hoher Konzentrationen benötigt». Erst kürzlich berichteten Shechter, supra, über eine ähnliche Reduktion von Methioninsulfoxid in Proteinen durch die Verwendung von Dimethylsulfid und variierenden Konzentrationen von Chlorwasserstoffsäure. Er folgert daraus, dass «bei 4,4 -10,7 m HCl die Reaktion vollständig verläuft, während bei niedrigeren Konzentrationen von Chlorwasserstoffsäure (z.B. 1,0 m) das Ausmass der Reduktion äusserst stark verzögert wird». Eine Hochleistungsanalyse für sekundäre Modifikationen wurde in keiner dieser Studien ausgeführt.

Es wird angenommen, dass die Methionin-Sulfoxid-Reduktion in wasserfreier Fluorwasserstoffsäure oder einmolarer Trifluormethansulfonsäure-TFA durch einen verschiedenen Mechanismus stattfindet, als demjenigen, welcher in wässriger Chlorwasserstoffsäure auftritt. Man meint, dass in diesen starken wasserfreien Säuren die Reduktion eine Funktion der Azidität der Mischung ist und nicht von der Nucleophilizität des Säureanions abhängt. Es wurde über eine wirksame Reduktion mit einem minimalen Niveau an unerwünschten Modifikationen berichtet. Die kaustische Natur dieser Lösungsmittel erfordert jedoch spezielle Handhabung-Vorsichtsmassnahmen, welche eine starke Einschränkung bei ihrer Verwendung bedingen.

Diese Erfindung bezieht sich auf ein leichtes und hochselektives Verfahren zur Behandlung von Proteinen und Peptiden, welche Methioninsulfoxid-Rückstände aufweisen, um eine selektive Reduktion solcher Rückstände zu Methionin-Rückständen zu bewirken. Vor allem bewirkt das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung eine Reduktion unter Venwendung von im wesentlichen milderen Bedingungen als denjenigen, die in dem Verfahren des Standes der Technik eingesetzt werden.

So bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung von Peptiden und Proteinen, welchen einen oder mehrere Methionin-Sulfoxid-Reste enthalten, zur Reduktion solcher Reste zur Methio-nin-Resten und es ist dadurch gekennzeichnet, dass man das genannte Peptid oder Protein einem im wesentlichen wasserfreien Fluoressigsäurereaktionsmedium unterwirft, das 0,01 m bis 3 m eines organischen Sulfids und etwa 0,01 m bis etwa 3 m einer Halogensäure enthält, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Jodwasserstoffsäure umfasst.

Wie weiter oben angeführt, bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zur selektiven Reduktion

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von Proteinen und Peptiden, welche Methionin-Sulfoxid-Reste enthalten zu ihren entsprechenden Me-thionin-Rest-Gegenstücken. Das Verfahren wird hauptsächlich bei der Entwicklung eines reifen biologisch aktiven Produktes aus seinem oxidierten Vorläufer Verwendung finden, wobei der letztere oft als Resultat der verwendeten Bedingungen bei der synthetischen Entwicklung des Proteins oder des Peptids entsteht. Die Bedingungen, welche zur Oxidation von Methioninresten zu der Sulfoxidform führen, können im Verlaufe beliebiger Bereiche der Verfahrensstufen auftreten, einschliesslich der Synthese und Reinigung des gewünschten Proteins oder Peptids. Ohne wirksame Methode, den Methioninrest wieder zu seinem reduzierten Zustand zurückzuführen, könnte man nur unter Verlust, wenigstens bei der Produktion des reifen Produktes im grossen Massstab, Mengen des gewünschten Produktes in annehmbarer Grösse erhalten.

Das Verfahren dieser Erfindung wird unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen ausgeführt und daher verwendet man im wesentlichen wasserfreie Trifluoressigsäuren. Es ist nicht beabsichtigt, dass durch die Definition «im wesentlichen wasserfreie» Trifiuoressigsäure positive Massnahmen getroffen werden müssen, welche die Anwesenheit von Spuren von Wasser ausschiiessen. Es wird nur beabsichtigt, dass eine positive Zugabe von Wasser vermieden wird.

Zu dieser Trifiuoressigsäure gibt man das Protein oder Peptid, um es einer Reduktion zusammen mit einem organischen Sulfid und einer der genannten Halogensäuren zu unterwerfen. Die Reagenzien können in beliebiger Reihenfolge hinzugefügt werden. Idealerweise löst man jedoch das Peptid oder das Protein zuerst in der Trifiuoressigsäure und anschliessend gibt man das organische Sulfid hinzu, gefolgt von der Halogensäure.

Die Menge des Proteins oder des Peptids, welche zu der Trifiuoressigsäure gegeben werden, wird im allgemeinen eine solche sein, dass man eine Konzentration erhält, welche sich im Bereich von 0,01 bis 100 mg/ml bewegt. Vorzugsweise wird die Konzentration 0,1 bis 20 mg/ml betragen und noch mehr bevorzugt 1 bis 10 mg/ml.

Das Protein oder das Peptid wird in Trifiuoressigsäure mit einem organischen Sulfid und einer Halogensäure umgesetzt. Man kann einen weiten Bereich organischer Sulfide verwenden, es besteht nur die einzige Anforderung, abgesehen davon, dass es einen reaktionsfähigen Sulfidanteil aufweist, dass es unter den Bedingungen des Verfahrens dieser Erfindung inert ist. Beispiele solcher typischen Sulfide sind Dimethylsulfid, Diethylsulfid, Ethyl-Methylsulfid, Diphenylsulfid, Dithiothrietol, Cysteine und ähnliche. Bevorzugte Sulfide sind Dialkylsulfide, in welchen jede Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist. Besonders bevorzugt für das Verfahren dieser Erfindung ist Dimethylsulfid.

Man gibt das organische Sulfid zu der Reaktionsmischung, um eine Konzentration zu erzielen, die sich im Bereich von 0,01 m bis 3 m bewegt. Vorzugsweise beträgt die Konzentration 0,1 m bis 1 m und besonders bevorzugt 0,5 m bis 1 m.

Das restliche wesentliche Reagenz ist eine Halogensäure. Die Halogensäure wird aus der Gruppe Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Jodwasserstoffsäure ausgewählt. Vorzugsweise ist die Halogensäure Chlorwasserstoffsäure. Die Halogensäure ist in der Reaktionsmischung in einer Menge anwesend, die sich in einem Bereich von 0,01 m bis 3 m bewegt.

Vorzugsweise ist die Halogensäure in einer Menge von 0,1 m bis 1 m vorhanden. Innerhalb des obigen Bereiches ist es bevorzugt, das Verfahren beim unteren Ende des Bereiches durchzuführen, falls das behandelte Protein oder das Peptid eine oder mehrere Disulfidbindungen enthalten und beim oberen Ende des Bereiches, falls keine Disulfide anwesend sind.

Ungeachtet der vorhergehenden Diskussion, welche den Vorzug betrifft, das Verfahren unter wasserfreien Bedingungen auszuführen, werden normalerweise gewisse Mengen an Wasser in der Reaktionsmischung durch die Zugabe der Halogensäure enthalten sein. Da die Gesamtmenge der verwendeten Halogensäure klein ist und sie durch Zugabe konzentrierter Säure einverleibt werden kann, muss tatsächlich nur eine geringe Menge an Wasser zu der Mischung hinzugefügt werden. Die zugefügte Menge ist vollständig annehmbar in Übereinstimmung mit dem Verfahren dieser Erfindung.

Das Verfahren dieser Erfindung kann über einen weiten Temperaturbereich ausgeführt werden, z.B. im allgemeinen überall zwischen 4°C und 45°C. Vorzugsweise wird die Reaktion bei Zimmertemperatur (etwa 20°C bis etwa 25°C) durchgeführt.

Normalerweise tritt die Reduktion ziemlich schnell ein. Obwohl man die Reaktion während einer ausgedehnten Periode ausführen kann, z.B. etwa 6 Stunden lang, kann sie auch in so kurzer Zeit wie 5 Minuten vollständig durchgeführt werden. Daher wird üblicherweise die Reaktion während einer Periode von 30 Minuten bis 90 Minuten durchgeführt.

Nach Beendigung der Reaktion kann das gewünschte Produkt unter Verwendung eines grossen Bereiches anerkannter Isoliertechniken isoliert werden.

In den folgenden Beispielen wird das Verfahren dieser Erfindung näher erläutert. Es ist nicht beabsichtigt, den breiten Bereich der Erfindung durch diese Beispiele einzuschränken.

Beispiel 1

Behandlung von H-Phe-Met(0)-Gly-Pro-Glu-Thr-NH2-(FM(0)GPET-NH2) Das Peptid FM(0)GPET-NH2(2,15 mg) wurde in 1,72 ml wasserfreier Trifiuoressigsäure (TFA) aufgelöst. Man teilte die Peptidlö-sung in 17 80 jxf Aliquote. Ein Aliquot diente als Kontrolle und man fügte kein Dimethylsulfid (DMS) und

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keine Chlorwasserstoffsäure (HCl) hinzu. Zu den anderen 16 Peptidlösungen gab man verschiedene Mengen an DMS bis zu einer Konzentration, die von 0,01 m bis 1 m reichte und ebenfalls fügte man konzentrierte Chlorwasserstoffsäure bis zu einer Chlorwasserstoffkonzentration von 0,01 n bis 1 n hinzu. Am Anfang wurden die Lösungen heftig gerührt und dann Hess man sie ungestört bei Zimmertemperatur 60 Minuten lang stehen. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 900 nl 0,1%iger wässriger TFA beendet.

Das Ausmass der chemischen Modifikation wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Altex Ultrasphäre ODS Kolonne mit einer umgekehrten Phase (0,46 x 25 cm) geschätzt. Die Chromatographie wurde in 0,1%iger wässriger TFA bei 45°C mit Eluieren durch einen ansteigenden linearen Gradienten von CH3CN erzielt. Die Quantisierung wurde auf Messungen des Peak-Gebietes bei 214 nm basiert. Die TFA/DMS/HCI-behandelte FM(0)GPET-NH2 ergab ein Peptid, welches eine chromatographische Retentionszeit entfaltete, welche derjenigen eines synthetischen Standard FMG-PET-NH2 gleich war. Die Resultate dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Reduktion von FM(0)GPET-NH2

HCl

DMS

FMGPET-NH2,

FM(0)GPET-NH2,

Kong., n

Kong., m*

% gebildet

% bleiben zurück

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100

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0,01

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0,1

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0,01

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1.0

1,0

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* In wasserfreier Trifiuoressigsäure

Beispiel 2

Behandlung von GRF(1-45)Met(OF, Lys«-OH GRF (1-^5)Met(OF, Lys«-OH (1,68mg) wurde in 1,5 ml wasserfreier Trifiuoressigsäure (TFA) gelöst. Zu 900 nl der Peptidlösung gab man 100 (il Dimethylsulfid (DMS), gefolgt von 10 jil konzentrierte Chlorwasserstoffsäure. Die Lösung wurde heftig gemischt und dann Hess man sie ungerührt bei Zimmertemperatur stehen. Nach 5,15, 30 und 60 Minuten folgte die Zugabe der Chlorwasserstoffsäure, 60 nl-Aliquote der Lösung der Reaktionsmischung wurden entfernt. Jede Probe wurde mit Stickstoff getrocknet und auf 1,2 ml durch Zugabe von 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure verdünnt. Am Ende der 60 Minuten fügte man zusätzliche konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (7,6 nl) zu der zurückgebliebenen Peptidlösung (760 nl), und die Lösung wurde abermals heftig gemischt und dann liess man sie ungerührt bei Zimmertemperatur stehen. 65, 75, 90, 120 und 180 Minuten nach der ersten Zugabe von Chlorwasserstoffsäure entfernte man 60 jxl-Aliquote und trocknete über Stickstoff und verdünnte mit 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure, wie weiter oben beschrieben ist.

Das Ausmass der chemischen Modifikation wurde durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) mit einer Vydac C4 Kolonne mit umgekehrter Phase (0,46 x 10 cm) geschätzt. Man führte die Chromatographie in 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure bei 45°C aus, und die Elution wurde unter Verwendung eines ansteigenden linearen Gradienten von CH3CN erzielt. Die Quantisierung basierte auf Messungen der Peakhöhe bei 214 nm. Die TFA/DMS/HCI-behandelte GRF(1-45)Met(0)27, Lys45-

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OH ergab ein Peptid, welches eine chromatographische Retentionszeit hatte, welche mit derjenigen eines synthetischen Standard-GRF(1-45)Met27, Lys45-OH identisch war. Die Resultate dieses Versuches sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Reduktion von GRF(1-45)Met(0)27,Lys45-0H

Zeit (Min.) GRF(1-45)Met27,Lys45-OH, % Ausbeute

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Beispiel 3

Behandlung von Glucagon-Met(O)27

Man löste Glucagon-Met(0)27(1,32 mg) in 660 fil von 1 molarem Dimethylsulfid in wasserfreier Tri-fluressigsäure. Eine unbehandelte Kontrolle wurde erhalten, indem man ein 30 nl-Aliquot entfernte, es mit Stickstoff trocknete und es in 1,2 ml 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure löslich machte. Die Pep-tid/TFA/DMS-Lösung wurde in sechs Portionen aufgeteilt. Variierende Mengen an konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und Tryptophan wurden zu den Lösungen gegeben und man mischte die Lösungen heftig und liess sie dann ungerührt 60 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen. Das Tryptophan wurde hinzugefügt, um die Zerstörung des internen Tryptophans von Glucagon bei Stellung 25 zu minima-lisieren. 60 jil-Aliquote von jeder Lösung wurden entfernt und die Reaktionen wurden beendet, indem man schnell mit Stickstoff trocknete und mit 1,2 ml 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure verdünnte. Am Ende der 60 Minuten fügte man zusätzliche konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zu den zurückgebliebenen Peptidlösungen. Die Mischungen wurden heftig gemischt und dann liess man sie ungemischt bei Zimmertemperatur stehen. 60 Minuten nach der zweiten Hinzugabe von Chlorwasserstoffsäure entfernte man 60 nl-Aliquote einer jeden Lösung und trocknete über Stickstoff und verdünnte mit 1,2 ml 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure, wie weiter oben beschrieben ist. Das Ausmass der chemischen Modifikation wurde durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) mit einer DuPont Cs Kolonne mit umgekehrter Phase (0,46 x 25 cm) bestimmt. Die Chromatographie wurde in 0,1 molarem Ammoniumphosphat mit einem pH-Wert von 7 bei 45°C mit Eluieren erzielt, unter Verwendung eines ansteigenden linearen Gradienten von CH3CN. Die Quantisierung basierte auf Messungen der Peak-Fläche bei 214 nm. Das TFA/DMS/HCI-behandelte Glucagon-Met(O)27 ergab ein Peptid, welches eine gleiche chromatographische Retentionszeit zeigte, wie das synthetisch erhaltene Standard-Glucagon. Diè Resultate dieses Versuches sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt.

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Tabelle IH

Reduktion von G!ucagon-MET(0)27

Trp Kong., Reaktionszeit, HCl Glucagon, Glucagon-Met(0),

m 1,2

Min.

Kong, n

% Ausbeute

% bleiben zurück

0

60

0,1

38

10

0

60

0,1

40

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120

0,2

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2

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120

0,2

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1

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0,1

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7

10

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0,1

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7

10

120

0,2

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1

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120

0,2

59

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0,1

75

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76

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100

120

0,2

83

1

100

120

0,2

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1

1 Ausgedrückt als molare Äquivalente zu Glucagon

2 DMS ergibt eine 1 m Konzentration

Beispiel 4

Behandlung von IGF-I, Met(O)59 Man löste IGF-I,Met(O)59 (0,90 mg) in 0,90 ml wasserfreier Trifiuoressigsäure, Die Peptidlösung wurde in acht 100 jil-Aliquote aufgeteilt. Man trocknete die Proben 1, 2, 7 und 8 mit Stickstoff vor ihrer Behandlung. Jedes Paar der Proben (nämlich 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6, 7 und 8) erhielt die gleiche Behandlung, mit der Ausnahme, dass Proben mit gerader Zahl vor dem Versuch in das Cysteinyl-S-Sulfonat umgewandelt wurden. Zu den Proben gab man verschiedene Mengen an wasserfreier Trifiuoressigsäure, Dimethylsulfid und konzentrierte Chlorwasserstoffsäure. Die Lösungen wurden heftig gerührt und dann liess man sie ungerührt bei Zimmertemperatur stehen. Zu einigen Proben gab man zusätzlich konzentrierte Chlorwasserstoffsäure 30 Minuten nach der anfänglichen Zugabe der Chlorwasserstoffsäure. Die Reaktionen alier Proben wurden am Ende von 30 und 60 Minuten durch Verdünnung mit 0,1%iger wässriger Trifiuoressigsäure oder durch Sulfitolyse der neutralisierten Lösungen beendet.

Das Ausmass der chemischen Modifikation wurde durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) mit einer DuPont Cs Reliance Kolonne mit umgekehrter Phase (0,6 x 4 cm) bestimmt. Man führte die Chromatographie in 0,1 molarem Ammoniumphosphat mit einem pH-Wert von 7 bei 45°C durch Eluie-ren mit einem ansteigenden linearen Gradienten von CH3CN aus. Die Quantisierung basierte auf Messungen der Peak-Fläche bei 214 nm. Das TFA/DMS/HCI-behandelte IGF-I,Met(0)59 ergab ein Peptid, welches die gleiche chromatographische Retentionszeit aufwies wie ein synthetisches Standard-IGF-I. Die Resultate dieses Versuches sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt.

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Tabelle IV

Reduktion von IGF-l Met(0)59

Probe Nr.

TFA, I

HCl

Kong., n

DMS Kong., m

Zeit, Min.

Reduktion %

IGF-I,

% Ausbeute

11

0

-

21

0

-

3

100

0,1

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80

CK

CO

4

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1

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80

co O CD

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0,2

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0,2

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97

86®

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4,4

0,5

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6,9

<12

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4,4

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4,53

1 Kontrolle

2 Untersucht als Disulfid

3 Untersucht als S-Sulfonat nach der Sulfitolyse

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Behandlung von Peptiden und Proteinen, welche einen oder mehrere Methionin-Sul-fonid-Reste enthalten, zur Reduktion solcher Reste zu Methionin-Resten, dadurch gekennzeichnet, dass man das genannte Peptid oder Protein einem im wesentlichen wasserfreien Trifiuoressigsäurereak-tionsmedium unterwirft, das 0,01 m bis 3 m eines organischen Sulfids und 0,01 m bis 3 m einer Halogensäu-re der Gruppe Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Jodwasserstoffsäure enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder das Peptid in einer Konzentration von 0,01 bis 100 mg/ml anwesend ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder das Peptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mg/ml anwesend ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Sulfid ein Dialkylsulfid ist, in welchem jede Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Sulfid Dimethylsulfid ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Sulfid in der Reaktionsmischung mit einer Konzentration von 0,1 m bis 1 m anwesend ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Sulfid in der Reaktionsmischung mit einer Konzentration von 0,5 m bis 1 m anwesend ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Halogensäure Chlorwasserstoffsäure ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Halogensäure in der Reaktionsmischung mit einer Konzentration von 0,1 m bis 1 m anwesend ist.

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