CN102994643A - 用于检测鸡fmo3基因a1034t突变的引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测鸡FMO3基因A1034T突变的引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~4所示。利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测鸡FMO3基因A1034T突变位点即鱼腥味敏感基因的基因型，从而准确判定鸡只是否携带鱼腥味敏感基因位点。与传统的检测技术相比具有诸多优点，包括操作简单、检测速度快，只需要一次PCR反应即可判型，自动化程度高，高通量，灵敏度高，而且节约了时间，提高了检测效率。反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。

Description

用于检测鸡FMO3基因A1034T突变的引物和探针

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测鸡FMO3基因A1034T突变的引物和特异性的TaqMan MGB探针以及检测方法和试剂盒。

背景技术

2005年，Honkatukia等人研究发现，位于鸡8号染色体上的含黄素单氧化酶（flavine containing monooxygenase 3，FMO3）基因的一个错义突变是导致鱼腥味鸡蛋产生的原因。该突变位于FMO3基因的第7外显子上，突变个体cDNA序列（GenBank登录号：AJ431390）的第1034位碱基腺嘌呤（A）被胸腺嘧啶（T）取代，这使得编码蛋白的第329位氨基酸由苏氨酸（T）转变为丝氨酸（S），因此该突变又被命名为T329S突变。329位苏氨酸到丝氨酸的变异使含黄素单氧化酶的一个高度保守区域(FATGY)发生了改变，据推测，此区域可能是含黄素单氧化酶识别底物的结合区，这个区域的突变使含黄素单氧化酶不能识别体内的三甲胺，从而导致了三甲胺在鸡蛋中的沉积而产生了鱼腥味鸡蛋。此时，若饲料原料中含有鱼粉、油菜籽粕或过量的氯化胆碱时，则带有这种基因缺陷的蛋鸡体内的三甲胺（TMA）不能正常代谢，三甲胺在鸡蛋中沉积，产生鱼腥臭味。三甲胺主要存在于蛋黄中，普通鸡蛋中三甲胺含量很低，约0.1μg/g，而在鱼腥味鸡蛋的蛋黄中平均高达1.0μg/g，含量通常是正常鸡蛋的10倍以上（Hobson-Frobock等，1973）。三甲胺的沉积使得鸡蛋产生非常难闻的气味，严重降低了鸡蛋的品质和口感。此外三甲胺与亚硝酸盐作用可形成亚硝胺，并有致癌作用，因此鱼腥味鸡蛋不仅影响食用且不利于人类健康。

自Honkatukia等发现鸡的鱼腥味综合症与FMO3基因的一个错义突变有关后，许多研究人员和机构对该基因在不同品种鸡群中的频率与鸡蛋中三甲胺含量进行了大量研究。2006年，罗曼公司成为第一家成功剔除鱼腥味基因的育种公司，2008年开始，伊莎公司提供的商品代蛋鸡也不再含有任何对三甲胺敏感的鱼腥味基因。

据张龙超（2006）研究结果显示在我国一些优良地方品种家禽中也含有频率较高的A1034T突变等位基因。初芹等（2010）和陈强等（2010）分别在北京油鸡和新杨绿壳蛋鸡中同时发现FMO3基因除了A1034T突变位点外，还存在另一个G895A多态位点，G895A突变同样位于FMO3基因第7外显子上，使得编码氨基酸密码子由CCG变为CCA，但是不改变氨基酸类型，因而也不会影响FMO3基因编码酶的功能。并且设计了引物，建立了更适合的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态（PCR-RFLP）分子检测方法，通过使用限制性核酸内切酶Bsr I（BseNI）酶切PCR扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳分型，根据条带数来区分鸡只A1034T位点的基因型。

随着人们对优质家禽产品消费需求的增加，许多地方品种鸡种，包括北京油鸡、绿壳蛋鸡等作为柴蛋鸡饲养，其规模和影响力日益增加。而且养殖方式也多元化，如大麦虫、黄粉虫等养鸡模式，这些饲料中都可能含有三甲胺（TMA）或其前体物质。如果鸡群中含有TT纯合基因型个体，即鱼腥味敏感个体，则所产鸡蛋很容易沉积三甲胺，出现鱼腥臭味，影响消费者食用和健康。虽然AT杂合基因型个体不直接产生鱼腥味鸡蛋，但是会将不利等位基因位点T位点传递给后代，导致后代出现TT纯合子。因此淘汰鱼腥味敏感基因位点T位点成为育种工作面临的重要任务之一。而建立一种快速、简便、准确，适合大规模、高通量的检测方法将会具有非常重要的意义。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态（PCR-RFLP）方法是检测单碱基突变的常用方法之一，其原理是利用单碱基突变导致的酶切位点的产生或者消失。检测过程需要3个步骤：①根据酶切位点上下游序列设计引物，利用聚合酶链式反应扩增目的片段；②扩增产物的限制性内切酶消化；③酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测。显然，PCR-RFLP方法具有步骤繁琐，耗时长的缺点。DNA质量、扩增条件、内切酶消化条件、琼脂糖凝胶质量等都会影响到判型的有效性和准确性。非常不适合于大规模、高通量的检测。

实时荧光定量TaqMan SNP分型技术是一种基于实时荧光定量PCR的单核苷酸多态性（SNP）检测方法，由美国ABI公司研发，基本原理是利用DNA聚合酶的5′→3′核酸酶外切功能来水解探针，通过探针报告基团发出的荧光来检测PCR产物的基因型。等位基因分型需要两条探针（TaqMan探针）和一对引物，一条探针对应一种等位基因，每条探针在5′和3′分别有一个含有荧光的报告基团和一个淬灭基团。当探针完整时，由于报告基团距离淬灭基团很近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收。在PCR进行过程中，正反向引物在DNA聚合酶的引导下合成一个特定分子DNA，探针可以和目的DNA杂交，DNA聚合酶的5′→3′核酸酶外切功能可以水解这个杂合分子，这样探针被水解后，5′报告基团和3′淬灭基团被分开，5′报告基团发出荧光，根据检测到的荧光信号的颜色即可判定等位基因的基因型。PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，仪器每个PCR循环过程中收集一次荧光信号，随着PCR反应的进行荧光信号不断累积，根据荧光信号的种类及信号强度，判定SNP基因型。TaqMan MGB探针是对传统TaqMan探针的改进，其优点是3′端的淬灭基团是不发光的淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher，NFQ），因此当淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰；此外，TaqManMGB探针还具有更强的序列特异性，实验结果更精确可靠等优点。总之，实时荧光定量TaqMan SNP分型技术与传统方法相比有诸多优点，包括检测速度快，灵敏度高，自动化程度高，而且经过一个PCR反应即可判型，反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。

发明内容

本发明的目的是克服现有的采用PCR-RFLP方法检测该突变位点存在的步骤繁琐，耗时长，灵敏度低、检测结果易受实验条件影响等缺点，提供一种能够准确高效地检测FMO3基因A1034T突变位点的合适引物和特异性的TaqMan MGB探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测鸡只FMO3基因A1034T突变位点的基因型，从而准确筛查鸡只是否携带鱼腥味敏感基因位点。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于检测鸡FMO3基因A1034T突变的引物，所述引物包括:

上游引物FMO3 F：5’-GTGCAGGACGACCTCGAT-3’（SEQ IDNO.1）

下游引物FMO3 R：5’-CTCCATGAAAGGAAAGGAGTGAGA-3’

（SEQ ID NO.2）。

上游引物由18个碱基组成，对应GenBank中鸡FMO3基因cDNA序列（登录号：AJ431390）的第1001～1018位碱基；下游引物由24个碱基组成，对应鸡FMO3基因cDNA序列的第1043～1066位碱基序列。该引物对的扩增片段长度为66bp。

本发明还提供了与上述特异性引物配合使用的TaqMan荧光探针。

进一步地，所述TaqMan荧光探针核苷酸序列为：

FMO3-突变型等位基因探针：5’-ATCTTTGCCTCTGGTTAC（SEQ ID NO.3）；

FMO3-野生型等位基因探针：5’-ATCTTTGCCACTGGTTAC（SEQ ID NO.4）。

探针均由18个碱基组成，对应FMO3基因cDNA序列的第1025～1042位碱基序列。其中，突变型等位基因的探针针对突变碱基T，探针5’端连接了荧光基团FAM；野生型等位基因的探针针对野生型碱基A，探针5’端连接了荧光基团VIC。两个探针的3’端标均标记有淬灭基团，该基团为不发光的淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher，NFQ）。

本发明还提供了含有上述引物和TaqMan荧光探针的试剂盒。

进一步地，本发明提供了上述试剂盒在鸡只选育中的应用。

本发明提供了上述引物和TaqMan荧光探针在制备检测鸡FMO3基因A1034T突变位点试剂盒中的应用。

本发明提供了一种检测鸡FMO3基因A1034T突变的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测鸡只的基因组DNA；

（2）采用实时荧光定量PCR技术，以待测鸡只的基因组DNA为模板，用引物和两条探针进行PCR扩增；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示，所述两条探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示；

（3）应用分析软件对步骤（2）的扩增产物进行基因型判定：如果突变型等位基因探针所标记荧光染料（FAM，其激发波长465nm，发射波长510nm）的荧光强度呈S型增长，而野生型等位基因探针所标记荧光染料（VIC，其激发波长533nm，发射波长580nm）的荧光强度无S型增长，表示被测样本基因型为TT；反之，如果野生型等位基因探针所标记荧光染料（VIC）的荧光强度呈S型增长，而突变型等位基因探针所标记荧光染料（FAM）的荧光强度无S型增长，表示被测样本基因型为AA；如果两种荧光强度均呈S型增长，则被测样本基因型为AT型，是杂合子携带者。

其中AA型代表的是野生型纯合子，即正常个体，不含有鱼腥味敏感基因位点，即使饲喂含有三甲胺或其前体物的饲料，鸡只也不会产生有鱼腥臭味的鸡蛋；TT型代表的是突变型纯合子，即鱼腥味敏感个体，也就是说，该基因的2个等位基因位点都是鱼腥味敏感基因位点，如果在饲料中含有三甲胺或其前体物质，TT型鸡只采食后容易产生有鱼腥臭味的鸡蛋；AT型代表的是携带者，携带1个鱼腥味敏感基因位点，AT型携带者鸡只采食含三甲胺或其前体物质的饲料后，虽然鸡蛋中三甲胺沉积较低，不影响食用，但是会将此不利基因位点T位点传递给后代，导致该鱼腥味敏感位点在群体中持续存在。

在检测过程中通常需要加入不加模板DNA的空白对照，以方便软件对背景色进行校正。

本发明提供的检测方法中，实时荧光定量PCR技术其10μL总工作体系为：

进一步地，所述实时荧光定量PCR技术其PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

进一步地，本发明提供了上述检测方法在鸡选育中的应用。

本发明提供的一种能够准确高效地检测鸡FMO3基因A1034T突变位点的引物和特异性的TaqMan MGB探针，具有以下优点：

（1）所设计的引物和探针具有良好的特异性，能够灵敏地检测FMO3基因A1034T突变。

（2）检测过程只经一个酶反应步骤，即可得出判型结果，无需PCR后反应，步骤简单、耗时短。

（3）所用的反应体系和反应条件稳定，检测结果可靠。

（4）反应的整个过程在封闭的管中进行，减少了污染。

（5）工作流程简单，只需混合DNA模板、引物和探针试剂即可进行仪器检测，易于掌握。

（6）该方法灵敏性高，对DNA的浓度要求低，1-20ng即可满足试验需要。

附图说明

图1为各种基因型测序峰图。a)为AA型（野生型纯合子），即正常个体；b)为AT型（杂合子），鱼腥味敏感基因位点携带者；c)为TT型（突变型纯合子），鱼腥味敏感个体。箭头所示位置为突变位点。

图2为实时荧光定量PCR仪对纯合子和杂合子个体检测到的PCR扩增曲线。①对应的是VIC荧光染料的信号曲线，②对应的是FAM荧光染料的信号曲线。图2a为AA型（野生型）纯合子，只有VIC荧光染料的一条S形扩增曲线，图2b为AT型杂合子，有两条S形扩增曲线，分别是FAM荧光染料和VIC荧光染料，图2c为TT型（突变型）纯合子，只有FAM荧光染料的一条S形扩增曲线。

图3为5μL、10μL、15μL三种反应体系下，已知基因型的6个个体的判定结果。图3a是5μL反应体系的结果，图3b是10μL反应体系的结果，图3c是15μL反应体系的结果。相同基因型的个体聚类在一起，其中，正方形代表的是AA纯合子，正常个体；三角形代表的是AT杂合子，鱼腥味敏感基因位点T位点的携带者；圆形代表的是TT纯合子，鱼腥味敏感个体。可以看出，无论选用哪种反应体系，检测结果都显示，A、B两个个体为AA纯合基因型，C、E、F三个个体为AT杂合基因型，D个体为TT纯合基因型。与测序结果完全一致，说明该方法准确可靠。

图4为44只待测鸡只的TaqMan探针实时荧光定量PCR法判型结果图。

图5为PCR-RFLP检测结果。M表示100bp marker；个体1，13，16，19有3条带（212bp，163bp，49bp）为杂合子AT型；个体2-7，10-12，14-18，20，22-24有2条带（163bp，49bp）为野生纯合子AA型；个体21有1条带（212bp）为突变纯合子TT型；个体9无带，未检出。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1检测鸡FMO3基因A1034T突变位点的特异性引物和探针的设计

本发明经反复筛选和验证，得到一对用于检测鸡FMO3基因A1034T突变位点的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的TaqMan探针。

上游引物FMO3 F：5’-GTGCAGGACGACCTCGAT-3’（SEQ IDNO.1）

下游引物FMO3 R：5’-CTCCATGAAAGGAAAGGAGTGAGA-3’（SEQ ID NO.2）。

上游引物由18个碱基组成，对应GenBank中鸡FMO3基因cDNA序列（登录号：AJ431390）的第1001～1018位碱基；下游引物由24个碱基组成，对应鸡FMO3基因cDNA序列的第1043～1066位碱基序列。该引物对的扩增片段长度为66bp。

与上述特异性引物配合使用的TaqMan荧光探针核苷酸序列为：

FMO3-突变型等位基因探针：5’-ATCTTTGCCTCTGGTTAC（SEQ IN NO.3）；

FMO3-野生型等位基因探针：5’-ATCTTTGCCACTGGTTAC（SEQ IN NO.4）。

探针均由18个碱基组成，对应FMO3基因cDNA序列的第1025～1042位碱基序列。其中，突变型等位基因的探针针对突变碱基T，探针5’端连接了荧光基团FAM；野生型等位基因的探针针对野生型碱基A，探针5’端连接了荧光基团VIC。两个探针的3’端标均标记有淬灭基团，该基团为不发光的淬灭基团（Non-Fluorescent Quencher，NFQ）。

实施例2鸡抗凝血基因组DNA提取

本实施例共包含50只北京油鸡，其中6只青年鸡（8周龄）用于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立，另外44只母鸡为40周龄处于纯繁前的待选留母鸡。饲养于北京市农林科学院榆垡种鸡场，翅下静脉采血，ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加蒸馏水至100ml）抗凝。

选用鸡抗凝血基因组DNA提取试剂盒DP318（天根生化技术有限公司，北京），提取基因组DNA，具体步骤如下：

1)取出样品，融化后，吸取20μL于2mL离心管中；

2)加入180μL缓冲液GS，20μL蛋白酶K，混匀；

3)加入200μL缓冲液GB，充分摇匀；

4)56℃烘箱中消化3小时以上（或过夜），消化早期，每隔3-5min颠倒摇匀一次，直至溶液变澄清透亮；

5)加入200μL无水乙醇，轻轻晃动混匀，转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去收集管中的暗绿色废液；

6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃去收集管中废液；

7)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去废液；

8)加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去废液；

9)12000rpm离心2min；

10)将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，开口凉干；

11)加入100μL在64℃预热的洗脱缓冲液TB，静置2min；

12)12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管中溶液中；

13）使用NanoDrop2000色谱法检测DNA浓度，稀释到20ng/μl，4℃保存备用或-20℃长期保存。

实施例3TaqMan探针实时荧光定量PCR检测鸡FMO3基因A1034T突变方法的建立

1、样品DNA基因型的确定

对实施例2中获得的6只鸡的基因组DNA使用NanoDrop2000色谱法再次检测DNA浓度，鸡只A、B、C、D、E、F的DNA浓度分别为：14.5ng/μL、14.5ng/μL、13.3ng/μL、32.2ng/μL、23.2ng/μL、29.9ng/μL。

以上述6只鸡的基因组DNA为模板，利用下述引物对（张龙超，2006），进行PCR扩增，上游引物FMO_F1：5’-CAGGGTGGTATCAAGCCTGT-3’，下游引物FMO_R1：5’-GATCCAAAGGACTGGACCAA-3’。扩增反应体系为25μL体系，包括：实施例2获得的6只鸡的基因组DNA模板2μL（50ng），Taq酶（Takara）0.5μL，10×buffer2.5μL，dNTP2.0μL，上下游引物（10pmol/μL）各1μL，dd H₂O16μL。PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物直接测序，由擎科新业科技有限公司完成。

经测序，共发现2只AA纯合个体（正常个体），1只TT纯合个体（鱼腥味味敏感个体），3只AT杂合个体（鱼腥味敏感基因位点携带者个体）。分别是，个体A、B为AA型，个体D为TT型，个体C、E、F为AT型。

图1给出了各种基因型测序峰图。a)为AA型，正常个体；b)为AT型，鱼腥味敏感基因位点携带者；c)为TT型，鱼腥味敏感个体。箭头所示位置为突变位点。

2、建立荧光定量PCR方法检测鸡FMO3基因A1034T突变

使用伯乐（Bio-Rad）iQ^TM5型实时荧光定量PCR仪进行TaqMan探针实时荧光定量PCR试验。

以上述6个已知基因型的个体的基因组DNA为模板，分别用5μL、10μL、15μL体系来进行试验，采用实施例1的引物和探针，建立TaqMan荧光定量PCR检测方法。各体系如下：

其中，基因组DNA为实施例2中获得的基因组DNA，40×SNPGenotyping AssayMix（上、下游引物（实施例1的引物）浓度各36μM和探针（实施例1的两个探针）浓度各8μM）由ABI（美国）合成，购自英潍捷基（上海）贸易有限公司），

Genotyping MasterMix由ABI（美国）合成，购自英潍捷基（上海）贸易有限公司，ddH₂O为灭菌去离子水。在检测过程中每种反应体系都设置2个不加模板DNA的空白对照，以方便软件对背景色进行校正。

PCR反应条件：95℃，预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环，实时检测整个扩增中两种荧光染料的信号强度。结果见图2。图2是实时荧光定量PCR仪对纯合子和杂合子个体检测到的PCR扩增曲线。①对应的是VIC荧光染料的信号曲线，②对应的是FAM荧光染料的信号曲线。图2a为AA型（野生型）纯合子，只有VIC荧光染料的一条S形扩增曲线，图2b为AT型杂合子，有两条S形扩增曲线，分别是FAM荧光染料和VIC荧光染料，图2c为TT型（突变型）纯合子，只有FAM荧光染料的一条S形扩增曲线。在使用伯乐iQ^TM5型实时荧光定量PCR仪实际操作时，需要结合软件中FAM、VIC按钮切换荧光染料类型能够看出S形扩增曲线是由哪一种荧光染料信号产生的。

反应结束后，还可以使用仪器自带软件，data analysis模块中的Allelic Disc功能界面直接进行判型。

图3显示的是5μL、10μL、15μL三种反应体系下，对已知基因型的6个个体的判定结果。图3a是5μL反应体系的结果，图3b是10μL反应体系的结果，图3c是15μL反应体系的结果。相同基因型的个体聚类在一起，其中，正方形代表的是AA纯合子，正常个体；三角形代表的是AT杂合子，鱼腥味敏感基因位点T位点的携带者；圆形代表的是TT纯合子，鱼腥味敏感个体。可以看出，无论选用哪种反应体系，本发明建立的实时荧光定量PCR检测结果都显示，A、B两个个体为AA纯合基因型，C、E、F三个个体为AT杂合基因型，D个体为TT纯合基因型。与现有技术的PCR产物直接测序方法结果完全一致，说明TaqMan探针实时荧光定量PCR方法准确可靠。

从图3可以看出，5μL反应体系虽然能够准确区分出每一个个体的基因型，但是同一基因型类型的个体聚类较为分散。而10μL和15μL反应体系聚类效果较好。综合试验准确性和节约成本考虑，最终选择10μL反应体系作为后续应用的首选反应体系。

实施例4本发明方法在鸡育种中的应用

用实施例3建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，以实施例2获得的44只40周龄（纯繁前）母鸡的基因组DNA为模板，进行鱼腥味基因FMO3A1034T突变位点基因型判定。

首先，对实施例2中获得的44只鸡的基因组DNA使用NanoDrop2000色谱法再次检测DNA浓度，各样品的DNA浓度如下表1。

表1本发明方法对44只鸡稀释后DNA浓度的再次检测结果（ng/μL）

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												DNA浓度	6.4	10.0	14.0	10.6	16.6	12.5	5.8	7.6	21.7	11.3	15.5
编号	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22
												DNA浓度	7.4	12.9	5.7	7.7	21.7	17.6	16.6	5.9	13.3	15.4	21.6
编号	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33
												DNA浓度	24.6	9.3	12.3	8.9	21.3	7.6	18.7	10.5	19.5	16.1	15.0
编号	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44
												DNA浓度	17.7	19.1	19.0	23.2	15.4	25.3	19.4	13.6	8.5	19.4	18.5

反应体系和反应条件同实施例2。图4给出了44只待测鸡只的TaqMan探针实时荧光定量PCR法判型结果图。很明显，同一基因型类型的个体聚类在一起，能够清晰的判定每一只鸡的基因型。

检测的44只鸡，有2只TT型纯合子，为鱼腥味敏感个体，13只为AT杂合子，鱼腥味敏感基因位点的携带子，其余29只鸡全都是AA型纯合子，正常个体。具体每只鸡的基因型见下表2。

表2本发明方法对44只鸡的鱼腥味基因基因型检测结果

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												基因型	AT	AA	AA	AA	AA	AA	AA	AA	AT	AA	AA
编号	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22
												基因型	AA	AT	AA	AA	AT	AA	AA	AT	AA	TT	AA
编号	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33
												基因型	AA	AA	AT	AA	AT	AT	AA	AA	TT	AA	AT
编号	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44
												基因型	AA	AA	AT	AT	AA	AA	AT	AA	AA	AT	AA

选择AA型个体2个（第2、3号个体），AT型个体2个（第1、9号个体），TT型个体2个（第21、31号个体）进行DNA测序验证。测序方法同实施例3。测序个体的基因型与本发明方法所检测的结果是一致的。证明本发明提供的技术方法在育种中使用时检测结果准确可靠。

在育种工作中，TT型鱼腥味敏感个体和AT型携带者个体，共15只个体都将被淘汰，以剔除北京油鸡群体中的不利等位基因位点T位点，最终将构建起不含鱼腥味敏感基因T位点的北京油鸡群体。

实施例5本发明检测方法与PCR-RFLP方法的对比

对上述实施例4中44个检测个体，进行PCR-RFLP检测，使用的引物序列如下（初芹等，2010）：

FMO_F2：5’-AAGATGGGACTGTGCAGGACG-3’

FMO_R2：3’-ATCTGCTGTTGGGATGGCGGA-3’

PCR反应体系为25μL，包括dd H₂O16.3μL，Taq酶（Takara）0.2μL，10×buffer2.5μL，dNTP2.0μL，上下游引物（10pmol/μL）各1μL，DNA模板2μL（50ng）。PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

使用限制性内切酶为BseNI，对PCR产物进行酶切。酶切反应体系共15μL，包含5μLPCR扩增产物，8μL的dd H₂O，1μL的10×Buffer B，1μL的BseNI。65℃酶切时间10~14h。酶切完成后，3%琼脂糖凝胶电泳检测判型。

如图5所示（琼脂糖凝胶图片所限，只给出了前24个个体的酶切检测结果），野生型纯合子AA型的酶切产物可以看到2条带，分别是163bp，49bp（如果跑胶时间长，49bp条带比较模糊）；突变纯合子TT型个体只有1条带，212bp；携带者个体AT型有3条带，212bp，163bp和49bp。

对所有44只待测鸡只均进行了PCR-RFLP方法检测，所有44个个体的检测结果与TaqMan探针实时荧光定量PCR判型结果一致。然而，在第一次PCR-RFLP检测过程中，个体9、25未检出，重新PCR扩增、酶切、跑胶后才获得基因型结果。

然而，对比TaqMan探针实时荧光定量PCR法和PCR-RFLP方法，前者对44个待检样品一次就完成全部样品的基因型判定，而后者第一次试验时44个样品中就有2个样品无法准确判型，是通过二次重复试验才得到结果的，这充分表明本发明建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR法的检测效率要显著高于已知PCR-RFLP检测方法。因为PCR-RFLP方法在操作过程中，存在多次的加样混样过程，操作步骤复杂且很容易导致PCR产物或者酶切产物污染或者挥发，人为操作因素很容易影响到检测和判型结果。而TaqMan探针实时荧光定量PCR法仅仅通过一个酶反应过程就能完成对鸡只基因型的判定，不仅操作非常简便，结果准确可靠，而且非常高效。此外，PCR-RFLP方法检测44个个体，耗时至少2天，第一天加样PCR扩增、混样酶切；第二天制胶、电泳、检测酶切产物、判型。而TaqMan探针实时荧光定量PCR法只需一次加样后实时荧光定量PCR过程，2个小时就能得到结果，省略了多次加样混样、制备琼脂糖凝胶等的繁琐步骤，而且能够使用软件实现自动判型，非常简单省时省力。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测鸡FMO3基因A1034T突变的特异性引物，其核苷酸序列为：

上游引物FMO3F：5’-GTGCAGGACGACCTCGAT-3’；

下游引物FMO3R：5’CTCCATGAAAGGAAAGGAGTGAGA-3。

2.与权利要求1所述特异性引物配合使用的TaqMan荧光探针。

3.如权利要求2所述的TaqMan荧光探针，其特征在于，其核苷酸序列为：

FMO3-突变型等位基因探针：5’-ATCTTTGCCTCTGGTTAC；

FMO3-野生型等位基因探针：5’ATCTTTGCCACTGGTTAC。

4.如权利要求3所述的TaqMan荧光探针，其特征在于，所述FMO3-突变型等位基因探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团NFQ；所述FMO3-野生型等位基因探针的5’端标记荧光报告基团VIC，3’端标记荧光淬灭基团NFQ。

5.含有权利要求1所述引物和权利要求2~4任一所述TaqMan荧光探针的试剂盒。

6.权利要求1所述引物和权利要求2~4任一所述TaqMan荧光探针在制备检测鸡FMO3基因A1034T突变位点试剂盒中的应用。

7.一种检测鸡FMO3基因A1034T突变的方法，其特征在于，

（1）提取待测鸡只的基因组DNA；

（2）采用实时荧光定量PCR技术，以待测鸡只的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对和两条探针进行PCR扩增；所述两条探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示；

（3）应用分析软件对步骤（2）的扩增产物进行基因型判定：如果突变型等位基因探针所标记荧光染料的荧光强度呈S型增长，而野生型等位基因探针所标记荧光染料的荧光强度无S型增长，表示被测样本基因型为TT；如果野生型等位基因探针所标记荧光染料的荧光强度呈S型增长，而突变型等位基因探针所标记荧光染料的荧光强度无S型增长，表示被测样本基因型为AA；如果两种荧光强度均呈S型增长，则被测样本基因型为AT型，是杂合子携带者。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR技术其10μL总工作体系为：

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR技术其PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

10.权利要求5所述的试剂盒或权利要求7~9所述的检测方法在鸡选育中的应用。

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