CN102994508A - Olmsted综合征相关基因的鉴别以及与其相关的产品、方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明鉴定了与Olmsted综合征相关的致病基因-TPRV3基因。在此基础上，本发明提供了突变的TRPV3基因及其用途，包含突变的TRPV3基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗Olmsted综合征的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。

Description

Olmsted综合征相关基因的鉴别以及与其相关的产品、方法及用途

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域以及疾病诊断和治疗领域。特别地，本发明鉴定了与Olmsted综合征相关的致病基因-TPRV3基因。在此基础上，本发明提供了突变的TRPV3基因及其用途，包含突变的TRPV3基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗Olmsted综合征的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。

背景技术

Olmsted综合征(Olmsted syndrome，OS)是一种少见的先天性皮肤病，其最早由Olmsted于1927年报道(Olmsted HC.Keratodermiapalmaris et plantaris congenitalis.1927.33：757-64)。该疾病主要表现为出生不久后出现的掌跖角化及腔口周围角化，部分患者可伴有毛发缺失(Dogra D，Ravindraprasad JS，Khanna N，Pandhi RK.Olmsted syndrome with hypotrichosis.Indian J Dermatol VenereolLeprol.1997.63(2)：120-2)。患者的掌跖角化可伴有剧烈瘙痒(TaoJ，Huang CZ，Yu NW，et al.Olmsted syndrome：a case report andreview of literature.Int J Dermatol.2008.47(5)：432-7)和典型的皮疹(其为特征性海星状肥厚性角化，为残毁性)，可导致患者出现趾、指挛缩或者远端断裂，严重影响患者的手、足活动功能，导致患者残疾(Poulin Y，Perry HO，Muller SA.Olmsted syndrome-congenital palmoplantar and periorificial keratoderma.J AmAcad Dermatol.1984.10(4)：600-10)。腔口周围角化可以累及患者的口腔外周、鼻前庭周围、会阴及肛门周围，表现为境界清楚的肥厚性角化性红色斑块，严重影响患者的外观，给患者造成巨大心理负担。除了诊断OS所必要的残毁性掌跖角化及腔口周围角化以外，部分患者可出现毛发稀疏或毛发缺失、毛周角化、口腔粘膜角化性白斑、甲营养不良、听力减退及反复细菌或真菌感染等症状(Tao J，Huang CZ，Yu NW，et al.Olmsted syndrome：a case report and review ofliterature.Int J Dermatol.2008.47(5)：432-7)。目前国内外报道的总病例数仅有40余例，这可能与临床医生对于OS认识不足，或者未能进行全面体检(如会阴及肛门周围)，导致重要体征遗漏而误诊为残毁性掌跖角化症有关。OS的实际发病率可能远高于此。

OS的病因尚不清楚。目前大多认为该疾病为遗传性疾病，但由于遗传模式尚未清楚，发病率极低，且由于疾病表现严重导致家族性病例极罕见，因此对于该疾病的致病基因，研究较为困难。由于KRT1、GJB2、SLURP1和LOR基因突变也可以引起严重掌跖角化症，曾有研究者针对这4个基因的突变情况对Olmsted患者进行了研究，结果均未发现任何致病性突变(Mevorah B，Goldberg I，Sprecher E，et al.Olmsted syndrome：mutilating palmoplantar keratoderma withperiorificial keratotic plaques.J Am Acad Dermatol.2005.53(5 Suppl 1)：S266-72)。此外，已报道，OS患者皮损部位的角蛋白1、角蛋白10、角蛋白5及角蛋白14表达异常(Fonseca E，Pena C，DelPJ，et al.Olmsted syndrome.J Cutan Pathol.2001.28(5)：271-5)。我们研究组也曾经对一例OS患者的KRT1、KRT10、KRT5及KRT14基因进行突变检测，亦未能发现致病性突变。另外，由于报道的家族性OS病例的家系均较小，无法进行有效的全基因组连锁分析。

最近，外显子组测序(exome sequencing)已成功地应用于发现稀有单基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon综合征的MYH3基因，Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62基因等(Ng SB，Turner EH，Robertson PD，et al，Targeted captureand massively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature2009，461(7261)：272-276；Hoischen A，van Bon BW，Gilissen C，et al.De novo mutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedionsyndrome.Nat Genet 2010：42(6)：483-5；Bilguvar K，Ozturk AK，Louvi A，et al，Whole-exome sequencing identifies recessiveWDR62 mutations in severe brain malformations.Nature 2010，467(7312)：207-210)。外显子组测序技术已被证明为减少稀有单基因疾病的候选基因个数甚至发现其致病基因的有力、有效手段。通过对很少的几个个体(包括患者及正常对照)进行外显子组测序，以筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。

本发明基于外显子组测序技术鉴定了与Olmsted综合征相关的致病基因-TPRV3基因。在此基础上，本发明提供了突变的TRPV3基因及其用途，包含突变的TRPV3基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗Olmsted综合征的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“TRPV3基因”是指编码一过性受体阳离子通道蛋白V3亚型(transient receptor potential cationchannel vanilloid 3，TRPV3)的基因。TRPV3基因含有18个外显子，其示例性cDNA序列如SEQ ID NO：37所示。如本文中所使用的，TRPV3基因的第N个外显子被简称为外显子N(N为1-18的整数)。

如本文中所使用的，术语“突变”，当用于描述基因或DNA时，是指基因序列或DNA序列中一个或多个(例如，几个)碱基的添加、缺失和/或置换；当用于描述蛋白质时，是指蛋白质氨基酸序列中一个或多个(例如，几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。

如本文中所使用的，术语“沉默突变”是指这样的基因突变，其引起mRNA中的密码子发生改变，但由于密码子的简并性而未引起编码的氨基酸发生改变。如本文中所使用的，术语“非沉默突变”是指除了沉默突变以外的基因突变，包括但不限于，错义突变、无义突变和移码突变等。

如本文中所使用的，术语“杂合突变”是指这样的突变，其仅存在于一对等位基因中的一个基因中。

如本文中所使用的，术语“c.1717”是指cDNA序列的第1717位碱基(以起始密码子ATG的碱基A为第1位碱基)，其中“c.”表示cDNA，数字“1717”表示第1717位碱基。本文中所使用的其他类似的术语，例如c.1703和c.2074，具有类似的含义。

如本文中所使用的，术语“c.1717G→A”是指cDNA序列的第1717位碱基(以起始密码子ATG的碱基A为第1位碱基)由G突变为A。本文中所使用的其他类似的术语，例如c.1717G→T，c.1703G→T和c.2074T→G，具有类似的含义。

如本文中所使用的，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。此类载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

载体中可包含与目的基因可操作地连接的表达控制序列。如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达的控制作用。如本文中所使用的，术语“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域熟知的。表达控制序列通常必须包括启动子，常常也包括转录终止序列，并且还可以包含其他序列，如增强子序列。基因表达对于siRNA、miRNA等而言是指转录，并且还可以包括转录后加工；对于蛋白质编码序列而言通常是指转录和翻译，产生蛋白质。

另外，载体中还可包含选择标记。此类选择标记是本领域技术人员熟知的，例如但不限于抗生素抗性基因，例如青霉素抗性基因、红霉素抗性基因等等。

如本文中所使用的，“PCR引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。

本领域技术人员公知，引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增TRPV3基因是指，在PCR反应中引物只扩增TRPV3基因，而不扩增其他基因。此类引物的设计是本领域技术人员公知的，参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)。

通常，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有大体上的同一性，从而能够特异性扩增目的基因。例如，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。

如本文中所使用的，术语“杂交”是指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。在杂交体系中已知的核酸分子称作探针(probe)。核酸杂交包括固-液相杂交和液相杂交。液相杂交是在溶液中进行的杂交反应，其是指待测核酸分子与已知核酸分子(探针)在溶液中退火形成杂交复合物。

如本文中所使用的，术语“特异性检测TRPV3基因突变”是指探针能够区分出含有突变的TRPV3基因与不含有突变的TRPV3基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下，与TRPV3基因精确互补的探针可以与不含有突变的TRPV3基因杂交，而不与甚至只包含一个点突变的突变的TRPV3基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的TRPV3基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的TRPV3基因杂交，而不与不含有突变的TRPV3基因杂交。

在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的，参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992)。为了举例说明的目的，杂交的条件可以是严紧条件，例如与滤膜结合的DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下进行一次或多次洗涤；高度严紧条件，例如与滤膜结合的核酸在6×SSC中约45℃下杂交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下进行一次或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件。

通常，探针是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。同样，也可以对引物进行标记，从而在PCR后，通过利用引物上的标记物，可以分离和检测扩增产物。可用于标记探针和引物的标记物在本领域内是已知的，包括但不限于，放射性同位素如¹²⁵I、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯二胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯-β-D-半乳糖和甲基伞形酮-β-D-半乳糖(针对β半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I²-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；荧光基团如伞形三糖(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade蓝、二氯三嗪基荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系络合物如包括铕和铽、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其荧光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子斑(quantum dot)：或放射性材料如¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、Tc99m、³⁵S或³H；或球珠(spherical shell)，以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所编的Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum Pub Corp，第二版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第六版的MolecularProbes Handbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子斑(即Qdots)，参见U.S.P 6,207,392。Qdots可从Quantum Dot Corporation购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括Group II-V半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及Group III-V半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。Group IV半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于GroupIII-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其组合物的半导体。根据使用的标记物，相应的核酸分离和检测方法在本领域内也是已知的。参见例如，Henegariu O等人，(1999).“Customfluorescent-nucleotide synthesis as an alternative method fornucleic acid labeling”，Nature Biotechnology 18：345-348；EzakiT等，1989.Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-DeoxyribonucleicAcid Hybridization in Microdilution Wells as an Alternative toMembrane Filter Hybridization in which Radioisotopes Are UsedTo Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains.Int.J.of Systemic Bacteriology 29(3)：224-229；和Herrington C等人，1998.PCR 3：PCR in situ hybridization：a practicalapproach，Volume 3.Oxford：Oxford University Press。

如本文中所使用的，表述“反义RNA特异于突变的TRPV3基因，且不作用于正常的TRPV3基因”是指反义RNA能够通过基因沉默而使得突变的TRPV3基因不表达或表达降低，并且不影响正常的TRPV3基因的表达。此类反义RNA的设计是本领域技术人员公知的。

如本文中所使用的，表述“抗体特异于突变的TRPV3基因所编码的蛋白，且不作用于正常的TRPV3基因所编码的蛋白”是指抗体能够特异性识别突变的TRPV3基因所编码的蛋白并阻抑其功能，而不识别正常的TRPV3基因所编码的蛋白或影响其功能。此类抗体的产生方法也是本领域技术人员公知的，例如，杂交瘤技术。

本发明至少部分基于发明人的发现：TPRV3基因的突变可导致Olmsted综合征。在此基础上，本发明提供了突变的TRPV3基因及其用途，包含突变的TRPV3基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外，本发明还提供了用于诊断或治疗Olmsted综合征的方法，用于所述方法的诊断剂或治疗剂，以及包含所述诊断剂或治疗剂的试剂盒。

因此，在一个方面，本发明提供了突变的TRPV3基因，其与SEQ IDNO：37相比具有至少1个非沉默突变，并且所述突变的TRPV3基因导致Olmsted综合征的发生。

在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于这样的区域，所述区域选自TRPV3基因的外显子1-18中的一个或多个。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于TRPV3基因的第13个和/或15个外显子。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于选自下列位置中的一个或多个位置：c.1717，c.1703和c.2074。在进一步优选的实施方案中，所述非沉默突变是选自下列突变中的一个或多个突变：c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G。

在另一个方面，本发明提供了包含上述突变的TRPV3基因的载体。

在一个优选的实施方案中，所述载体包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中，所述载体是商购可得的。在一个优选的实施方案中，所述载体包含与上述突变的TRPV3基因可操作地连接的表达控制序列，例如但不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所述载体任选地还包含选择标记。

在另一个方面，本发明提供了包含上述突变的TRPV3基因和/或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

本领域技术人员公知，可将致病基因用于产生疾病动物模型和/或用作药物靶点，从而研究疾病的发病机制和开发有效治疗疾病的药物。因此，在另一个方面，本发明提供了上述突变的TRPV3基因的用途，其用于产生Olmsted综合征动物模型，或用作药物靶点，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生Olmsted综合征动物模型，或用作药物靶点。在一个优选的实施方案中，所述动物包括但不限于，哺乳动物，例如小鼠，大鼠，兔和猴。

在另一个方面，本发明提供了上述载体或宿主细胞的用途，其用于产生Olmsted综合征动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生Olmsted综合征动物模型。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含上述突变的TRPV3基因和/或载体和/或宿主细胞。

在另一个方面，本发明提供了用于诊断Olmsted综合征的诊断剂，其包含能够特异性扩增TRPV3基因的引物，或能够特异性检测TRPV3基因突变的探针。

在一个优选的实施方案中，所述引物能够特异性扩增TRPV3基因的外显子，优选第13个和/或15个外显子。在一个优选的实施方案中，所述引物的序列选自SEQ ID NO：25、26、29和30。在进一步优选的实施方案中，所述引物是如SEQ ID NO：25和26所示的引物，或如SEQ ID NO：29和30所示的引物。

在一个优选的实施方案中，所述突变位于TRPV3基因的外显子，优选第13个和/或15个外显子，更优选地位于选自下列的一个或多个位置：c.1717，c.1703和c.2074。在进一步优选的实施方案中，所述突变是选自下列的一个或多个突变：c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗Olmsted综合征的治疗剂，其包含反义RNA，所述反义RNA特异于上文所述的突变的TRPV3基因，且不作用于正常的TRPV3基因。如本文中所使用的，术语“正常的TRPV3基因”是指编码具有正常生物学功能的TRPV3蛋白的TRPV3基因，其例如但不限于，如SEQ ID NO：37所示的TRPV3基因。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗Olmsted综合征的治疗剂，其包含抗体，所述抗体特异于上文所述的突变的TRPV3基因所编码的蛋白，且不作用于正常的TRPV3基因所编码的蛋白。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含上文所述的诊断剂，或治疗剂。

在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否患有Olmsted综合征的方法，其包括，检测受试者的TRPV3基因是否存在非沉默突变，如果存在所述非沉默突变，则判断受试者患有Olmsted综合征。

在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于这样的区域，所述区域选自TRPV3基因的外显子1-18中的一个或多个。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于TRPV3基因的第13个和/或15个外显子。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变位于选自下列位置中的一个或多个位置：c.1717，c.1703和c.2074。在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变是选自下列突变中的一个或多个突变：c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G。

在另一个方面，本发明提供了检测TRPV3基因的突变的方法，其包括使用上文所述的诊断剂。在一个优选的实施方案中，所述方法不是诊断方法。例如，所述方法可以用于研究目的。

在另一个方面，本发明提供了治疗Olmsted综合征的方法，其包括使用上文所述的治疗剂。

在另一个方面，本发明提供了上文所述的诊断剂在制备用于检测TRPV3基因的突变和/或用于诊断Olmsted综合征的试剂盒中的用途。

在另一个方面，本发明提供了上文所述的治疗剂在制备用于治疗Olmsted综合征的试剂盒中的用途。

本发明的试剂、试剂组合物或试剂盒中可进一步包含与活性成分相容的缓冲液、载体或媒介等，例如选自下列的一种或多种：水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。此类缓冲液、载体或媒介可进一步包括微量辅助物质，例如湿润剂、乳化剂、表面活性剂、防腐剂或助悬剂等。

发明的有益效果

本发明通过外显子组测序技术确定了OS的致病基因，这至少带来了以下有益效果。

一方面，本发明为OS的诊断和治疗提供了新的方法和工具。特别地，本发明所提供的诊断方法以及用于该方法的引物和/或探针可用于快速、有效地诊断Olmsted综合征，并且根据OS致病基因所设计的反义RNA和抗体可用于有效治疗Olmsted综合征，从而提供了新的治疗选择。

另一方面，本发明为OS的发病机制研究奠定了重要基础，为OS患者的治疗提供全新的理论依据。特别地，由于OS患者的残毁性掌跖角化可以伴有剧烈的瘙痒，本发明所确定的致病基因可能在瘙痒的发作过程中起到一定的作用，这对于病理生理过程极为复杂的瘙痒症状的研究提供一个新的思考方向。此外，本发明所确定的基因很有可能参与表皮角化及毛发生长调控过程，这可能为重症角化性皮肤病及毛发疾病的发病机制研究提供新的思路。最后，利用OS致病基因所获得的疾病动物模型是研究OS的发病机制和治疗方法的有力工具。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为TRPV3基因的测序图，其显示了OS患者的TRPV3基因中所发生的突变。其中，图1A显示，TRPV3基因在c.1717处(c.1717是指cDNA编码区的第1717位碱基，以起始密码子ATG的碱基A为第1位碱基，下同)的碱基G突变为A(即，c.1717G→A)，其导致TRPV3蛋白的第573位氨基酸残基由Gly突变为Ser(即，Gly573Ser)；图1B显示，TRPV3基因在c.1717处的碱基G突变为T(即，c.1717G→T)，其导致TRPV3蛋白的第573位氨基酸残基由Gly突变为Cys(即，Gly573Cys)；图1C显示，TRPV3基因在c.1703处的碱基G突变为T(即，c.1703G→T)，其导致TRPV3蛋白的第568位氨基酸残基由Gly突变为Val(即，Gly568Val)；图1D显示，TRPV3基因在c.2074处的碱基T突变为G(即，c.2074T→G)，其导致TRPV3蛋白的第692位氨基酸残基由Trp突变为Gly(即，Trp692Gly)。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如，分子生物学和核酸化学实验方法)。参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates(1992)，其全部通过引用合并入本文。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1：OS致病基因的鉴定

我们在国内收集到7例OS病例，其中1例为家族性病例，6例为散发病例，各个病例的详细情况提供于表1中(所有病例均由北京大学第一医院采集和提供)。在这些病例中，所有患者均表现为残毁性掌跖角化伴腔口周围角化，并且病例1-4伴有毛发缺失及头部毛周角化。所收集的1例家族性病例即为表1中的病例3，该病例的女儿与其一样患有OS，且症状如上所述，但因该病例的女儿出生后不久就去世而未取到样本。之前的研究曾经报道了3个家族性OS病例(Yaghoobi R，Omidian M，Sina N，Abtahian SA，Panahi-Bazaz MR.Olmsted syndrome in anIranian family：report of two new cases.Arch Iran Med.2007.10(2)：246-9；Rivers JK，Duke EE，Justus DW.Etretinate：management of keratoma hereditaria mutilans in four familymembers.J Am Acad Dermatol.1985.13(1)：43-9；和Atherton DJ，Sutton C，Jones BM.Mutilating palmoplantar keratoderma withperiorificial keratotic plaques(Olmsted′s syndrome).Br JDermatol.1990.122(2)：245-52)，以及1个同卵双胞胎病例(Cambiaghi S，Tadini G，Barbareschi M，Caputo R.Olmsted syndromein twins.Arch Dermatol.1995.131(6)：738-9)。这些已报道的家族性病例，与我们所收集到的家族性病例一起，提示OS很可能是孟德尔遗传性疾病，而且常染色体显性遗传的可能性较大。

表1：所收集的7例OS病例的详细情况

基于上述分析，我们使用Agilent SureSelect Human All Exon Kit(Agilent)，利用Solexa高通量测序平台(Illumina Hiseq 2000)，根据厂商的说明书，对病例1及其父母的外显子组序列进行了测序。简言之，外显子组测序方法如下：

1)获得受试者的基因组DNA，并将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段；随后在片段两端分别连接上接头以制备杂交文库(参见例如，http://www.illumina.com/support/documentation.ilmn提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

2)根据制造商提供的说明书，将按照Illumina/Solexa标准建库说明书建立的杂交文库与SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)(Agilent SureSelect Human All Exon Kit)进行杂交富集，然后再次进行LM-PCR线性扩增，最后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度为至少20×。

3)测序所获得的原始数据由Illumina basecalling Software1.7进行处理；经过过滤去除污染后，使用SOAPaligner 2.20(Li R，Li Y，Kristiansen K，et al，SOAP：short oligonucleotidealignment program.Bioinformatics 2008，24(5)：713-714；和Li R，Yu C，Li Y，ea al，SOAP2：an improved ultrafast tool for shortread alignment.Bioinformatics 2009，25(15)：1966-1967)将测序数据与参考基因组(hg18/build36.3)进行比对，从而获得比对到参考基因组上的Unique Mapped Reads。然后使用SOAPsnp(Li R，Li Y，Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallelwhole-genome resequencing.Genome Res 2009，19(6)：1124-1132)确定靶区域(即，全基因组所有外显子区域)的基因型。

结果显示，与参考基因组相比，在病例1的外显子组中存在19593个单核苷酸多态性(SNP)和2757处的插入/缺失。使用dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi)，千人基因组数据库(www.1000genomes.org/)和HapMap 8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)等公共数据库对上述结果进行进一步的过滤，去除所有已知的变异(SNP和插入/缺失)。进一步，还利用通过上述方法获得的病例1的父母的外显子组测序结果进行过滤(以去除也存在于父母外显子组中的变异)，并利用SIFT软件(http://sift.jcvi.org/)进行SNP功能预测，最终获得45个杂合的可能具有致病意义的de novo SNP位点。

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，因此我们进一步利用Sanger测序法，对上述45个杂合的可能具有致病意义的de novo SNP位点进行验证。Sanger测序结果显示，上述45个de novo SNP位点中有44个是假阳性的：其中，2个位点的突变也存在于病例1的父母的外显子组中(但是外显子组测序法没有将其检测出来)，42个位点在病例1的外显子组没有发生突变(但是外显子组测序法因为假阳性的问题而将其检测为突变)。因此，最终的结果显示，在使用外显子组测序法所鉴定的45个位点中，仅有1个位点为真正的de novo SNP位点，该位点为TRPV3基因的c.1717G→A杂合突变(参见图1A)，其导致TRPV3蛋白发生错义突变，即第573位氨基酸残基由Gly突变为Ser(Gly573Ser)。

TRPV3蛋白为一过性受体阳离子通道蛋白(transient receptorpotential cation channel)的V3亚型(vanilloid 3)，主要介导以钙离子为主的多种阳离子的通透。TRPV3基因(其cDNA序列如SEQ ID NO：37所示)含有18个外显子，编码一个TRPV3蛋白单体，该单体含有6个跨膜螺旋结构区(S1-S6)、连接跨膜结构氨基酸以及N端和C端亚区。每4个TRPV3蛋白单体聚合成一个具有完整功能的TRPV3通道。Gly573位于连接S4和S5跨膜区域的胞内区，该位点在TRPV蛋白的不同亚型中以及在不同物种中高度保守。之前的研究表明，TRPV3通道可以被多种物理及化学刺激激活，特别是在33-39℃的温度下激活，因此，其被认为可能具有介导温度感受的功能；并且，TRPV3通道在皮肤的角质形成细胞中高度表达(Smith GD，Gunthorpe MJ，Kelsell RE，etal.TRPV3 is a temperature-sensitive vanilloid receptor-likeprotein.Nature.2002.418(6894)：186-90)。之前还已报道，携带TRPV3的Gly573Ser自发性突变的小鼠发生口周角化及无毛的临床表型，该临床表型与我们收集到的OS病例的临床表现高度类似(Asakawa M，Yoshioka T，Matsutani T，et al.Association of amutation in TRPV3 with defective hair growth in rodents.JInvest Dermatol.2006.126(12)：2664-72)。因此，我们将TRPV3基因初步鉴定为OS的致病基因。

SEQ ID NO：37：TRPV3基因的cDNA

  1 CCACAACTTCGATCTTGGCACCTGCGGCCTCCCCTGCCTTTTCTCCGGTGGGGATGAGGC

 61 TGCTGTGTGGGTGTGGGGGTGACTCACACGGGCCACGTGGGTGGGCGGGTGCTGCAGCTG

121 TGGCTGGTGGGCGTGGCCTGCCTGGCGCCGAGGGCAGGTGGCTCAGCCAGTTCTGCCTCT

181 GACGCCTCATTCCAGCCATCCCTCTGCCTGCAATGAGAGCTTCCCGCCGCCTCAGCCACA

241 GTCCCACCCGGGGGCCTTGGGCCCCAGACATGCGGTGATCTCAGGGCAAGGGTTGCCACG

 301 ACCACCCAGAACCTCACCAGCCATGAAAGCCCACCCCAAGGAGATGGTGCCTCTCATGGG

 361 CAAGAGAGTTGCTGCCCCCAGTGGGAACCCTGCCATCCTGCCAGAGAAGAGGCCGGCGGA

 421 GATCACCCCCACAAAGAAGAGTGCACACTTCTTCCTGGAGATAGAAGGGTTTGAACCCAA

 481 CCCCACAGTTGCCAAGACCTCTCCTCCTGTCTTCTCCAAGCCCATGGATTCCAACATCCG

 541 GCAGTGCATCTCTGGTAACTGTGATGACATGGACTCCCCCCAGTCTCCTCAGGATGATGT

 601 GACAGAGACCCCATCCAATCCCAACAGCCCCAGTGCACAGCTGGCCAAGGAAGAGCAGAG

 661 GAGGAAAAAGAGGCGGCTGAAGAAGCGCATCTTTGCAGCCGTGTCTGAGGGCTGCGTGGA

 721 GGAGTTGGTAGAGTTGCTGGTGGAGCTGCAGGAGCTTTGCAGGCGGCGCCATGATGAGGA

 781 TGTGCCTGACTTCCTCATGCACAAGCTGACGGCCTCCGACACGGGGAAGACCTGCCTGAT

 841 GAAGGCCTTGTTAAACATCAACCCCAACACCAAGGAGATAGTGCGGATCCTGCTTGCCTT

 901 TGCTGAAGAGAACGACATCCTGGGCAGGTTCATCAACGCCGAGTACACAGAGGAGGCCTA

 961 TGAAGGGCAGACGGCGCTGAACATCGCCATCGAGCGGCGGCAGGGGGACATCGCAGCCCT

1021 GCTCATCGCCGCCGGCGCCGACGTCAACGCGCACGCCAAGGGGGCCTTCTTCAACCCCAA

1081 GTACCAACACGAAGGCTTCTACTTCGGTGAGACGCCCCTGGCCCTGGCAGCATGCACCAA

1141 CCAGCCCGAGATTGTGCAGCTGCTGATGGAGCACGAGCAGACGGACATCACCTCGCGGGA

1201 CTCACGAGGCAACAACATCCTTCACGCCCTGGTGACCGTGGCCGAGGACTTCAAGACGCA

1261 GAATGACTTTGTGAAGCGCATGTACGACATGATCCTACTGCGGAGTGGCAACTGGGAGCT

1321 GGAGACCACTCGCAACAACGATGGCCTCACGCCGCTGCAGCTGGCCGCCAAGATGGGCAA

1381 GGCGGAGATCCTGAAGTACATCCTCAGTCGTGAGATCAAGGAGAAGCGGCTCCGGAGCCT

1441 GTCCAGGAAGTTCACCGACTGGGCGTACGGACCCGTGTCATCCTCCCTCTACGACCTCAC

1501 CAACGTGGACACCACCACGGACAACTCAGTGCTGGAAATCACTGTCTACAACACCAACAT

1561 CGACAACCGGCATGAGATGCTGACCCTGGAGCCGCTGCACACGCTGCTGCATATGAAGTG

1621 GAAGAAGTTTGCCAAGCACATGTTCTTTCTGTCCTTCTGCTTTTATTTCTTCTACAACAT

1681 CACCCTGACCCTCGTCTCGTACTACCGCCCCCGGGAGGAGGAGGCCATCCCGCACCCCTT

1741 GGCCCTGACGCACAAGATGGGGTGGCTGCAGCTCCTAGGGAGGATGTTTGTGCTCATCTG

1801 GGCCATGTGCATCTCTGTGAAAGAGGGCATTGCCATCTTCCTGCTGAGACCCTCGGATCT

1861 GCAGTCCATCCTCTCGGATGCCTGGTTCCACTTTGTCTTTTTTATCCAAGCTGTGCTTGT

1921 GATACTGTCTGTCTTCTTGTACTTGTTTGCCTACAAAGAGTACCTCGCCTGCCTCGTGCT

1981 GGCCATGGCCCTGGGCTGGGCGAACATGCTCTACTATACGCGGGGTTTCCAGTCCATGGG

2041 CATGTACAGCGTCATGATCCAGAAGGTCATTTTGCATGATGTTCTGAAGTTCTTGTTTGT

2101 ATATATCGTGTTTTTGCTTGGATTTGGAGTAGCCTTGGCCTCGCTGATCGAGAAGTGTCC

2161 CAAAGACAACAAGGACTGCAGCTCCTACGGCAGCTTCAGCGACGCAGTGCTGGAACTCTT

2221 CAAGCTCACCATAGGCCTGGGTGACCTGAACATCCAGCAGAACTCCAAGTATCCCATTCT

2281 CTTTCTGTTCCTGCTCATCACCTATGTCATCCTCACCTTTGTTCTCCTCCTCAACATGCT

2341 CATTGCTCTGATGGGCGAGACTGTGGAGAACGTCTCCAAGGAGAGCGAACGCATCTGGCG

2401 CCTGCAGAGAGCCAGGACCATCTTGGAGTTTGAGAAAATGTTACCAGAATGGCTGAGGAG

2461 CAGATTCCGGATGGGAGAGCTGTGCAAAGTGGCCGAGGATGATTTCCGACTGTGTTTGCG

2521 GATCAATGAGGTGAAGTGGACTGAATGGAAGACGCACGTCTCCTTCCTTAACGAAGACCC

2581 GGGGCCTGTAAGACGAACAGCAGATTTCAACAAAATCCAAGATTCTTCCAGGAACAACAG

2641 CAAAACCACTCTCAATGCATTTGAAGAAGTCGAGGAATTCCCGGAAACCTCGGTGTAGAA

2701 GCGGAACCCAGAGCTGGTGTGCGCGTGCGCTGTCTGGCGCTGCAGGCGGAGTCACCGACT

2761 CTGTGCAGAGAGGCTTTGAGGGATGGTGGAGTCCGGCTCTGCTGGCCTAGAAGCAGAGTG

2821 CACCCTCGTGCTCAGTGCTCAGTGGGTGTCTGAACTGAGGGGCAGTTGTCAATTTGTCTG

2881 AGTGGGAAACATCCTGGATTTTGTTACTTGGCAAACAGCTGGTGTAAACCTACAGCCAGC

2941 AGCAGTCTGGAGCCTGGGAGCCTCCTGAAGTCCCGGGTGAAGCCTCTGGTTTTACCAATT

3001 GCAGGTCGGCTTGGCTGGGAGAGATGGATGGCGGGAAAGGGGCAGCAGTCTTGAGGAGCA

3061 GGGAGAGGAGTCTTTCCTCCTGCCAGCTTCCCCCGTCAGCCCCAACCCCAGCCCACACAT

3121 TGTACCATCTCTTCTGCTGTGACTGGGTTGCCTGAATTTGTGGGAGACCCGTGATCCCAT

3181 CCCAGAGTGTGCGGGGGACGGAGGTAAGCTGGATATCCTGGGGGAGGAGGGGAATGCGCT

3241 CTGGAAACACCCTTCCGGAACCCTTCGGGGAAAAGGAGACCATCCTTGGAGTGAACGTCC

3301 CCTGACACCCCAAGGTTCAAACTGTCTCAAGCTGAGAGATGTTTTTAGTAGCAGAATTAA

3361 CACAGGGTTTTAACTTGCAATACGGAAAAGACATTTCAGTTGAGAATGAAAATTACTACA

3421 ATGAAGTTTGTGATTTTAAAAGTGGAGACAGACTGGGGGCTTTGGGGCTGGATGTAAGTA

3481 TTATATATTTGGCCTCAGGGTGCCCAGAGCAAGACAAAAAGCTTTTCTTCACACACACAA

3541 AAGTCTGCATGAGACACTCCGGGCAAGTCCTGCTGGGCCGCCGCGATCTGGGTGAAAGGT

3601 CCTGGCTCTTTTCCTCGTCCTGACCTCACAGTAGCGCGTGCCTGTGTGCTGGGATCGTGG

3661 CTTTCGCTGAAGCAGAAATAGCAGCTGCTCGATCGATATCATCTTGGAACTCAGCAGTTA

3721 GTCGCATACCTCAGTATGTCTCAGTGGGGGAATTTAACAAAATGCCTCAACTGCTTTGGT

3781 ACGAAGTATTTTTTTTTTAATTTTAACTGTGAATTTTGAAGCTGAAGGGGAAGCTTGTGA

3841 GAGAAAAGCATTTGCCAAGACTTTGAGCTTATTTTTAGGTCCTCGTCCTCTGATGTTCTC

3901 TTTCTGAAATGACACGGAGTCAGTCTGGGGGGCAGAGGTGAAGTGGAGACGGAAGGATTT

3961 TCCAGGTGACTGGGGCCGAAACCACCAGAAAATCCACTCTGCCGCCGTTATCTGGTGAAA

4021 GGATTCATGTAAAAATGTTCGAGGTGGAATTATAAAAATAGTAACCATAAATGTTAATCT

4081 TAAATGGCAGAAATAGAAATTTGGCCTTCAGATAACATGGCGATAGATAAGTTCATCTGG

4141 CTTGAGGCAAACTGAAGAGTCGGGGCCTAGCAGTGCACTCTGGGCCAGTTTCTCTGCCCT

4201 GGGCCACTCTGTGTGCCAGACTAGCTGGACAGATAGAGACTTTGTGCCCCTGATGGGGCC

4261 GATTGGGGAGAGGTGGGCTGGGGTGTGTGAGGCTTCACAATCCACAGCAGCCCCTGCCCT

4321 CCCAGCTGACCCAGGGAGTAATCGCGTGCTCTAAGCCACAGTGGTCGGGGCTGGGCATGG

4381 GCCTCTGGAGAAGAGAAGATTTGAGGAGAACTGTCCTAGAGGCAGGAGGAGCAGATGTGT

4441 TTCAGAATGGGCAGAATTAGGAAATTGAGAAAGATTTTGGCTCAACAGAATCCAGCAACT

4501 GCTCCAGATGTTGGAGATGTTTAAGCAGAAGCTGGTTGCGCACTTAATGAGGAATGTTGT

4561 TGAAAATGGTCATTGGAAGAAGTTTAAGGTCCCTTTTAGCCTGGAGATTGTACAAATCAG

4621 CATTCCACATCTGGAGTTAGCTACCCGCATTAAGCCTGAACAGACATCTTGGTCTGAAAG

4681 GAAGTGGTTTGGATTCATGATGCCAAGCTCCACACTATGGAGCTGGGAATTCCAGAATTG

4741 CTTTGACTCAGATATTAATGGAGAAAGTCATATCCATTAATGGATAAAGCCGTATCTGTT

4801 ATGGATAAAGCCGTATCCAGAGTTGCTTTGACTCGGATGTTAATGGATAAAGCCAATTAT

4861 TGATTTCTATTTGCCTAACCTGCCAGCTTTTGTCCAAGTGGGGAATGGAGAGCCATAGGG

4921 ATGTTTGTCATCTCACATGTTTTGGTGATCTGCTGTCTGTGGGTCTGGATGGAATTTGTT

4981 GGCAAGACCATTTTCTGTATTGGATATTCTTCCCAACAGTGTCCACCCCAAAAGGCTTTC

5041 AGCCAAAACGTCTGAGCCTAGGTAGGTTTACCAAGGGAAGCCATAAGTCAAGAAGCATCA

5101 GAGTGAAAAGGAGCACTTCCTTCATTTTACGCCCAGAGGCTAATGCTCCGAGAGGAATGT

5161 GTACTTGGGCAAAGTCATGCAGGAAGGTCATATCAGAGCTGTGGAGGCTGGAGTGTCCTG

5221 ATTCTTGGACCACAGATGTCTCCCTGAGCCATTATTTATTTATTTTTAAAAAGCACAGTT

5281 ATTCCATCATTTTGAGTCTTTGTATTTCGCTTATATTGGGGGGCAGGACTATTTTCTCAG

5341 GTGTCTCATTTGGCAGTCAACATTGTCCCCTATGTTCCCTATGACTAGTTGAAAATTCAA

5401 GTGTGCCCACAGGGGTGCACAAAACCACACCCATGCACACACACACCCTCAGCCCCCACA

5461 CACACCCCGTTGAACCCGTGGGTCTATCAGGACATCCTAAAACTCCGTGATTGACATTTC

5521 AGTAATTTCAGGGGAAGGTGTTTTCCAGGGATGGGGTCTCCCAGGTTCAGATAGTGCCTT

5581 TGGCTGCAAATGCTCCTTTAGCTAAACTTTTCCTCAGGAAGAATTCATTATTCTAGACAT

5641 TATGTGATATATCTGTTAGGAATAAAAGGTGCTTAACCTTCCTCCCTGGGATGTGGGAGA

5701 AGGTGCTGGAGGTTGTACTGTGAAGTCTTCAGGCTCTTAGAAGGCTCCAGCCTGAGAGAG

5761 CCCTTTATTATTGACATTCCTGTCCTTCCTCAAGGCCTGGTGACCTGTGACCTTTCGCTC

5821 TGGGCAGGGCCCAGGTAGATGGGCCGTCATCCGGGCCTGTAAGCCGTACTTGATTTCTGC

5881 ATTGATTTACATATTTTTTACTGTGATCTTGGTTCCAAACACAGAATCGTCACCCCATTC

5941 TCCCTTGAATGTGCCGGATCCTTGTAAATTCTCATTTACCTACTTGTTCTTAGTGTGTAT

6001 GTGTGTGCGAAACTCTATGTTCAAGAAAGAAATCATACAAAGAGTAAGAACATGTTTGTG

6061 CCATTGAAGAAATGGTTTTTTGATTTCTAATAAATATTTGTTTTGCCTCGTTA

实施例2：OS致病基因的验证

为进一步确认TRPV3基因为OS的致病基因，我们使用Sanger测序法对收集的另外6个病例(表1的病例2-7)的TRPV3基因进行测序验证。我们还对12名家系内正常人(即，该6个病例的父母，他们均未发病)和216名家系外正常人(即，与表2中所有病例无血缘关系的正常人)的TRPV3基因进行测序，以用作对照。

1.样品制备

分别采集所有受试者(6例OS患者，12名家系内正常人及216名家系外正常人)的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量获得的DNA的浓度及纯度。结果显示，所得的每个样本基因组DNA的OD 260/OD280均位于1.7-2.0之间，且浓度不少于200ng/ul，总量不少于30μg。

2.Sanger法测序验证

针对TRPV3基因的18个外显子的序列设计引物，使用Sanger测序法获得步骤1的所有受试者的TRPV3基因的外显子序列。根据所有受试者的测序结果(即，TRPV3基因的外显子中是否存在突变)，验证TRPV3基因与OS疾病之间的相关性。

a)引物设计

引物设计参考人类基因组序列数据库hg18/build36.3。所设计的引物的具体序列如表2所示。

表2：引物序列

b)Sanger测序法的反应体系和反应条件

分别使用表2中所列的18个引物对，对每一个受试者的TRPV3基因的18个外显子及其侧翼序列进行测序。Sanger测序法的扩增反应体系(所有试剂购自Takara公司)如下：

Sanger测序法的扩增反应条件如下：

c)测序

使用ABI3730(ABI)，分别对上述步骤中获得的所有样本(6例OS患者、12名家系内正常人和216名家系外正常人)的PCR扩增产物直接进行DNA测序。

利用获得的测序结果，在所有受试者中对TRPV3基因的所有编码序列及侧翼序列进行突变排查。

结果显示，我们收集到的7例OS病例(实施例1的病例1和实施例2的病例2-7)均在TRPV3基因中检测到杂合性错义突变(图1)。图1示例性显示了OS患者的测序结果，其显示OS患者的TRPV3基因中存在杂合性错义突变。

结果还显示，在7例OS病例中总共检测到TRPV3基因的4种不同的杂合性错义突变，其中，突变c.1717G→A、c.1717G→T和c.1703G→T位于第13个外显子上，并且突变c.2074T→G位于第15个外显子上。这些杂合性错义突变示于表3中。

表3.所有OS患者的基因突变位点

另外，测序结果还显示，未能在216名家系外正常人对照中检测到表3中鉴定到的突变(即，Gly573Ser、Gly573Cys、Trp692Gly和Gly568Val)；并且，所有未受累的家族成员(12名家系内正常人)的TRPV3基因均不带有所述突变。上述结果表明，表3中鉴定到的突变位点并非SNP位点。

进一步的分析显示，Gly573、Gly568和Trp692在TRPV蛋白的不同亚型中，以及在不同物种的同源蛋白中均高度保守。此外，之前的研究表明，携带TRPV3的Gly573Ser突变的小鼠发生口周角化及无毛的临床表型(sakawa M，Yoshioka T，Matsutani T，et al.Association of a mutation in TRPV3 with defective hair growthin rodents.J Invest Dermatol.2006.126(12)：2664-72)，并且已在小鼠中发现，TRPV3的Gly573Ser及Gly573Cys突变体的电生理发生功能获得性改变(Xiao R，Tian J，Tang J，Zhu MX.The TRPV3mutation associated with the hairless phenotype in rodents isconstitutively active.Cell Calcium.2008.43(4)：334-43)。

因此，所获得的测序结果充分表明，本发明所鉴定到的4种突变(表3)均导致TRPV3蛋白的结构和功能发生变化，从而导致OS疾病。即，TRPV3基因为OS的致病基因，该基因的突变与OS疾病的发生具有相关性。

上述实验还表明，本发明所设计的引物(特别是，用于扩增第13个和第15个外显子的引物对)可用于检测TRPV3基因中是否存在突变(特别是，本发明所鉴定到的4种突变，c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G)，从而诊断受试者是否患有OS疾病。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (15)

1.突变的TRPV3基因，其与SEQ ID NO：37相比具有至少1个非沉默突变，并且所述突变的TRPV3基因导致Olmsted综合征的发生；

优选地，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种；

优选地，所述非沉默突变位于这样的区域，所述区域选自TRPV3基因的外显子1-18中的一个或多个；

优选地，所述非沉默突变位于TRPV3基因的第13个和/或15个外显子；

优选地，所述非沉默突变位于选自下列位置中的一个或多个位置：c.1717，c.1703和c.2074；

优选地，所述非沉默突变是选自下列突变中的一个或多个突变：c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G。

2.包含权利要求1的突变的TRPV3基因的载体。

3.包含权利要求1的突变的TRPV3基因和/或权利要求2的载体的宿主细胞。

4.权利要求1的突变的TRPV3基因的用途，其用于产生Olmsted综合征动物模型，或用作药物靶点，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生Olmsted综合征动物模型，或用作药物靶点。

5.权利要求2的载体或权利要求3的宿主细胞的用途，其用于产生Olmsted综合征动物模型，或用于制备试剂盒，所述试剂盒用于产生Olmsted综合征动物模型。

6.试剂盒，其包含权利要求1的突变的TRPV3基因和/或权利要求2的载体和/或权利要求3的宿主细胞。

7.用于诊断Olmsted综合征的诊断剂，其包含能够特异性扩增TRPV3基因的引物，或能够特异性检测TRPV3基因突变的探针；

优选地，所述引物能够特异性扩增TRPV3基因的外显子，优选第13个和/或15个外显子；

优选地，所述引物的序列选自SEQ ID NO：25、26、29和30；

优选地，所述引物是如SEQ ID NO：25和26所示的引物，或如SEQID NO：29和30所示的引物；

优选地，所述突变位于TRPV3基因的外显子，优选第13个和/或15个外显子，更优选地位于选自下列的一个或多个位置：c.1717，c.1703和c.2074；

优选地，所述突变是选自下列的一个或多个突变：c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G。

8.用于治疗Olmsted综合征的治疗剂，其包含反义RNA，所述反义RNA特异于权利要求1的突变的TRPV3基因，且不作用于正常的TRPV3基因。

9.用于治疗Olmsted综合征的治疗剂，其包含抗体，所述抗体特异于权利要求1的突变的TRPV3基因所编码的蛋白，且不作用于正常的TRPV3基因所编码的蛋白。

10.试剂盒，其包含权利要求7的诊断剂，或权利要求8的治疗剂，或权利要求9的治疗剂。

11.诊断受试者是否患有Olmsted综合征的方法，其包括，检测受试者的TRPV3基因是否存在非沉默突变；

优选地，所述非沉默突变选自添加，缺失和置换中的一种或多种；

优选地，所述非沉默突变位于这样的区域，所述区域选自TRPV3基因的外显子1-18中的一个或多个；

优选地，所述非沉默突变位于TRPV3基因的第13个和/或15个外显子；

优选地，所述非沉默突变位于选自下列位置中的一个或多个位置：c.1717，c.1703和c.2074；

优选地，所述非沉默突变是选自下列突变中的一个或多个突变：c.1717G→A、c.1717G→T、c.1703G→T和c.2074T→G。

如果存在所述非沉默突变，则判断受试者患有Olmsted综合征。

12.检测TRPV3基因的突变的方法，其包括使用权利要求7的诊断剂。

13.治疗Olmsted综合征的方法，其包括使用权利要求8或9的治疗剂。

14.权利要求7的诊断剂在制备用于检测TRPV3基因的突变和/或用于诊断Olmsted综合征的试剂盒中的用途。

15.权利要求8或9的治疗剂在制备用于治疗Olmsted综合征的试剂盒中的用途。