CN102993125A - 一种新的用于缺血心脏保护作用的κ-阿片受体激动剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对缺血心脏具有保护作用新的κ-阿片受体激动剂——季胺化U50488H。季胺化U50488H是在极性溶剂和催化剂条件下，由κ-阿片受体激动剂U50488H和CH₃I反应生成。该季胺化产物能够像U50488H一样明显改善缺血/再灌注心脏的功能，明显减少心肌梗死面积，降低心肌酶的漏出和显著减少心肌细胞凋亡数量。这种新的化合物的显著特点是它不能通过血脑屏障，避免了因U50488H通过血液循环进入脑组织引起可能发生的成瘾性和依赖性。这种具有心肌保护作用的新型κ-阿片受体激动剂可用于学术研究，也可为临床应用防治缺血性心脏病提供可能的新药，因而具有很好的科学研究价值和临床应用前景。

Description

一种新的用于缺血心脏保护作用的κ-阿片受体激动剂

技术领域

本发明涉及应用无依赖性新型阿片类药物治疗缺血性心脏疾病的基础研究和临床研究领域。

背景技术

缺血性心脏病是当今世界威胁人类健康的首敌。随着冠状动脉内溶栓及冠脉搭桥等内外科治疗手段的广泛应用，继之出现的心肌细胞再灌注损伤日益受到心脏病学家的高度重视。

研究表明κ-阿片受体在体内广泛存在(如口心、脑等组织和器官)，就心脏而言占主导地位的κ-阿片受体在心肌缺血/缺血再灌注过程中起着十分重要的调节作用。来自动物实验的大量证据表明，外源性κ-阿片受体选择性激动剂U50488H可明显降低缺血/缺血再灌注的心肌细胞凋亡数、减少心肌梗死面积，降低心律失常的发生率，改善心脏及冠脉微循环功能等。前期的实验研究还发现，由于U50488H的水溶性较低，分子量小，进入血液循环后可以通过血脑屏障，因此在改善缺血心肌的同时，可能引起机体成瘾和依赖，因而严重限制了其临床应用。

我们力图对现有的κ-阿片受体选择性激动剂U50488H进行改造，获得一种新的化合物——季胺化U50488H。改造后的产物可以显著地提高其水溶性，增大分子量，使其不能通过血脑屏障，可以减轻或避免因U50488H通过血液循环进入脑组织引起的成瘾性和依赖性，保留其在外周对缺血心脏的保护作用，这种具有心肌保护作用的新型阿片类药物可用于学术研究，也为临床应用防治缺血性心脏病提供可能的新药，因而具有很好的科学研究价值和临床应用前景。

发明内容

我们采用化学上成熟的方法，对κ-阿片受体选择性激动剂U50488H进行季胺化改造，季胺化改造主要分为两个步骤：首先将U50488H中的盐酸中和去掉，使其变成游离碱——U50488(该游离碱为一种叔胺)；然后将游离碱U50488与碘甲烷反应，生成一种季铵盐——季胺化U50488H。季胺化后的U50488H呈淡黄色粉末样，经质谱分析，确认所得产物为U50488H的碘甲烷季铵盐C₂₀H₂₉Cl₂IN₂O。详细的方法、步骤见具体实施方式。

为了验证改造后的季胺化U50488H能否通过血脑屏障，并检验其对缺血/缺血再灌注心脏的保护作用，我们做了以下几方面的实验研究。

一、季胺化改造前后比较和色谱分析鉴定

(一)季胺化改造前后分子量和水溶性比较

1.改造前后的分子量测定季胺化U50488H分子量为：511.2695，U50488H的分子量为：405.7895。显示改造后的季胺化U50488H分子量明显增大。

2.改造前后的水溶性测定在相同时间和条件下，每毫升水可以溶解季胺化U50488H 5毫克；同样每毫升水只能溶解U50488H 2毫克，显示改造后的季胺化U50488H水溶解度明显增加。

通过上述比较，显示了季胺化U50488H的分子量和水溶解度都明显增加，这些理化性状提示：改造后的季胺化U50488H不易通过血脑屏障。

(二)季胺化改造前后标准品的色谱分析

1.U50488H标准品与生理盐水的色谱分析单纯生理盐水和用生理盐水溶解U50488H标准品后分别进行色谱分析，结果表明：2.4min出现的波峰为生理盐水；6.8min出现的波峰为U50488H标准品(见图1A、B)。

2.季胺化U50488H标准品与生理盐水的色谱分析单纯生理盐水和用生理盐水溶解季胺化U50488H标准品后分别进行色谱分析，结果表明：2.4min出现的波峰为生理盐水；6.8min出现的波峰为季胺化U50488H标准品(见图1C)。

二、季胺化改造前后的血清和脑组织液的色谱分析

(一)静脉注射季胺化改造前后的血清色谱分析

1.标准血清的液相色谱分析取不给任何药物的标准血清进行色谱分析，结果表明：分别在2.4min、4min、5.5min、8min和9.4min时出现5个波峰。由于血清中各种成份较多，除2.4min出现的波峰由生理盐水引起外，其余4个峰所代表的物质尚不清楚(图2A)。

2.注射U50488H后血清色谱分析给大鼠静脉注射U50488H后5min时取静脉血，将经离心后所得血清进行色谱分析，结果出现了6个波峰，其中在7.2min时出现的波峰由U50488H所引起(图2B)。

3.注射季胺化U50488H后血清色谱分析给大鼠静脉注射季胺化U50488H后5min时取静脉血，将经离心后所得血清进行色谱分析，结果出现了6个波峰，其中在7.2min时出现的波峰由季胺化U50488H所引起(图2C)。

上述结果表明：静脉注射U50488H和季胺化U50488H后，经色谱分析均可在血清中检测到所注射的药物，说明二者均可随血液循环分布到全身。

(二)静脉注射季胺化改造前后的脑组织液色谱分析

1.标准脑组织液的液相色谱分析取不给任何药物的标准脑组织液进行色谱分析，分别在2.5min、8.5min和10.5min时出现3个波峰，除2.5min出现的波峰由生理盐水引起外，其余2个峰所代表的物质尚不清楚(图3A)。

2.注射U50488H后脑组织液色谱分析给大鼠静脉注射U50488H后5min时取脑组织，将经离心后所得脑组织上清液进行色谱分析，结果出现了4个波峰，其中在7.2min时出现的波峰由U50488H所引起(图3B)。

3.注射季胺化U50488H后脑组织液色谱分析给大鼠静脉注射季胺化U50488H后5min时取脑组织，将经离心后所得脑组织上清液进行色谱分析，结果出现了与标准脑组织液的液相色谱分析相同的结果(图3C)。

上述结果表明：分别静脉注射U50488H和季胺化U50488H后，在脑组织液中可以检测到U50488H，说明其经血液循环可以通过血脑屏障进入脑组织；而静脉注射季胺化U50488H后，在脑组织液中未能检测到季胺化U50488H，说明其不能通过血脑屏障进入脑组织，可以克服由κ-阿片受体选择性激动剂U50488H引起的依赖和成瘾等毒副作用，证明了对κ-阿片受体选择性激动剂U50488H的季胺化改造是成功的，实现了我们对其改造的目的。为了证明改造后的季胺化U50488H是否具有对缺血/缺血再灌注心脏的保护作用，我们在动物实验中对其进行了观察。

三、季胺化改造后对缺血心脏的保护作用

季胺化改造后的U50488H对缺血心脏保护作用的实验研究，是通过建立大鼠心肌缺血/缺血再灌注模型来实现的。详细的实验方法、步骤见具体实施方式。

(一)季胺化U50488H对缺血心肌梗死面积的影响

各实验组大鼠心脏均采用伊文思蓝-TTC双染色，其中蓝色部分为非缺血区，红色部分为缺血区，白色部分为梗死区。心肌损伤的程度可用心肌梗死区域与危险区域(缺血区加上梗死区)的比值(％)来表示，该比值越小，表示心肌损伤程度越轻；比值越大，说明心肌损伤程度越重。

实验结果显示，Sham(假手术)组染色为蓝色，说明该组大鼠心肌无缺血；I/R(缺血/缺血再灌注)组有蓝色、红色和部分白色区域组成，说明该组大鼠心肌部分发生缺血和梗死；与I/R组相比，在I/R前给予U50488H或季胺化U50488H预处理的两个实验组，无白色区域，即无明显梗死面积出现；而在季胺化U50488H预处理之前，给予κ-阿片受体特异性阻断剂nor-BNI静脉注射，又有白色区域即心肌梗死出现。经计算机软件分析系统测得心脏梗死区域与危险区域的面积，并计算二者比值后，发现：I/R组为39.8±2.2，给予U50488H预处理(6.4±1.8)或季胺化U50488H预处理(6.3±0.6)均能有效缩小心肌梗死面积，减轻心肌损伤的程度，且二者的作用无统计学差异；在季胺化U50488H预处理前给予nor-BNI(37.8±2.6)，可阻断其缩小心肌梗死面积的作用，说明季胺化U50488H对心肌梗死心脏的保护效应是通过κ-阿片受体介导的(图4)。

(二)季胺化U50488H对缺血心肌酶学和自由基的影响

按照测试试剂盒说明书所述方法步骤，我们分别对各实验组大鼠血清中的乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(GOT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)进行了测定。

1.血清LDH、CK、GOT、MDA和NO的测定

LDH、CK、GOT、MDA和NO存在于正常心肌细胞浆中，只有在心肌细胞受到损伤或坏死时，它们才可能大量释放到血液中。因此，测定血清中这些物质的含量可以作为反映心肌损伤程度的指标。

实验结果显示，与Sham组相比，I/R组血清中的LDH、CK、GOT、MDA和NO的含量均有明显升高，说明缺血/缺血再灌注时，心肌受损；与I/R组相比，U50488H+I/R组和季胺化U50488H+I/R组明显降低，且有统计学意义，说明U50488H或季胺化U50488H的预处理可以明显减轻缺血/缺血再灌注时的心肌损伤，对心肌具有保护作用；二者对心肌的保护作用经统计学分析无明显差异，说明季胺化改造后的U50488H能发挥和改造前一样的心脏保护作用；而在季胺化U50488H的预处理之前，给予nor-BM静脉注射，这些物质的含量又有明显升高，提示季胺化U50488H的作用被阻断，说明季胺化U50488H对缺血心脏的这种保护作用是通过κ-阿片受体介导的(图5)。

2.血清SOD的测定

氧自由基损伤是心肌缺血/缺血再灌注损伤的重要机制之一，而SOD作为自由基清除剂，可以对抗这种损伤。

实验结果显示，与Sham组相比，I/R组血清中的SOD有明显降低，说明心肌缺血/缺血再灌注时，氧自由基大量产生，消耗过多的SOD，导致血清SOD含量显著降低；U50488H+I/R组和季胺化U50488H+I/R组中血清SOD则明显升高，且有统计学意义，说明经U50488H或季胺化U50488H的预处理后，可以明显升高血清中SOD的含量，减轻缺血/缺血再灌注时氧自由基对心肌造成的损伤，对心肌具有保护作用；二者作用经统计学分析无明显差异，说明季胺化改造后的U50488H能发挥和改造前一样的心脏保护作用；而在季胺化U50488H的预处理之前，给予nor-BNI静脉注射，血清中SOD含量明显降低，提示季胺化U50488H升高缺血/缺血再灌注时血清SOD含量的作用被阻断，说明季胺化U50488H对缺血心脏的这种保护作用是通过κ-阿片受体介导的(图6)。

(三)季胺化U50488H对缺血心肌细胞凋亡的影响

心肌组织切片经TUNEL染色后，所有的细胞核均被染为蓝色(图7，左图)，而凋亡细胞核则被试剂标记显示为绿色点状(图7，右图)。

实验结果显示，Sham组几乎无心肌细胞凋亡；I/R组有大量心肌细胞出现凋亡；而给予U50488H或季胺化U50488H预处理后，则显著性减少了心肌缺血/缺血再灌注引起的细胞凋亡；两者对心肌细胞凋亡的抑制作用无明显差异，说明季胺化改造前后的U50488H能发挥相同的抗心肌细胞凋亡的作用；而在季胺化U50488H的预处理之前，给予nor-BNI静脉注射，凋亡心肌细胞明显增加，季胺化U50488H对心肌凋亡的抑制作用被阻断，说明季胺化U50488H对缺血心肌细胞凋亡的抑制作用是通过κ-阿片受体介导的(图7)。

总之，研究表明κ-阿片受体选择性激动剂U50488H，在心肌缺血/缺血再灌注过程中起着十分重要的调节作用。由于其进入血液循环后可以通过血脑屏障进入脑组织，因此在改善缺血心肌的同时，容易引起机体成瘾和依赖的毒副作用，因而严重限制了其临床应用。本实验证明，κ-阿片受体选择性激动剂U50488H经季胺化改造后，通过增大分子量和提高水溶性，使其在血液循环中不能通过血脑屏障进入脑组织，避免引起机体成瘾和依赖等毒副作用的可能性。同时又完全保留了与改造前相同的对缺血心脏的保护作用，且这些作用能被κ-阿片受体特异性阻断剂所阻断，说明其对缺血心脏的保护作用是通过κ-阿片受体所介导，进一步证明了所合成的季胺化U50488H为新一类κ-阿片受体选择性激动剂。本研究为κ-阿片受体选择性激动剂U50488H的医学研究和临床应用提供了重要的实验依据，具有良好的应用前景。

附图说明

图1季胺化改造前后标准品的色谱分析

图2季胺化改造前后的血清色谱分析

图3季胺化改造前后的脑组织液色谱分析

图4季胺化U50488H对缺血心肌梗死面积的影响(Sham：假手术组，I/R：缺血/缺血再灌注组，U50：U50488H+I/R组，季胺化U50：季胺化U50488H+I/R组，nor-BNI：

nor-BNI+季胺化U50488H+I/R组)

图5血清LDH、CK、GOT、MDA和NO的测定(分组同图4)

图6血清SOD的测定(分组同图4)

图7季胺化U50488H对缺血心肌细胞凋亡的影响(分组同图4)

具体实施方式

一、U50488H的季胺化改造：

(1)U50488游离碱的制备

取U50488H粉末，逐渐加入蒸馏水至完全溶解，滴加饱和Na₂CO₃至溶液PH为10，用乙酸乙酯萃取，经薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)检测为纯品(展开剂：乙酸乙酯∶甲醇＝5∶2)，然后用无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，得淡黄色油状物即为U50488游离碱，产率97.3％。

(2)碘甲烷季铵盐的制备

在N₂保护下，将U50488置于三颈瓶中，加入新蒸CH₃I(分子量：142，密度：2.28g/ml)，回流(42℃)，大约5h后，经TLC检测，原料几乎消失，停止反应，蒸出CH₃I，得粗品(淡黄色固体)，用柱层析分离得淡黄色粉末样固体(CH₃Cl₂∶甲醇＝10∶1)，产率61.6％。

U50488H的季胺化改造结束后，运用质谱法分析，确认所得淡黄色粉末样产物即为U50488H的碘甲烷季铵盐C₂₀H₂₉Cl₂IN₂O。

二、U50488H改造前后的高效液相色谱分析鉴定

取成年健康SD雄性大鼠12只，称重，以30g/L戊巴比妥钠(2mg/kg)腹腔注射麻醉，固定。颈前部备皮后，剪一颈前正中纵向切口，逐层分离至气管暴露，做一气管插管，保证其呼吸通畅。依次分离右侧颈总动脉和左侧颈静脉，各做一血管插管，分别为实验完毕抽取血液和建立给药途径所用。其中6只静脉注射U50488H 2mg/kg，于给药后5min通过插管抽取血液和开颅取大脑半球组织，另外6只静脉注射季胺化U50488H 10mg/kg(为明确季胺化U50488H究竟是否能透过血脑屏障，特加大给药剂量)，取材方法同前所述。

实验所取血液经室温静置10min后，4000转/min离心25min，抽取上层血清置于-80℃冻存备用；所取脑组织按2ml∶1mg的比例加入新鲜超纯水，经超声细胞粉碎仪匀浆后，14000转/min离心2h，抽取上层清液即脑组织液置于-80℃冻存备用。以上操作在冰上进行。高效液相色谱测定时，U50488H和季胺化U50488H标准品可直接上机检测；血清和脑组织液则须在4℃解冻，分别加入乙酸乙酯，旋涡充分混匀，7000转/min离心15min，然后抽取上清液，经N₂吹干，加入甲醇，旋涡混匀，再经有机相滤器抽滤后，方可上机检测。液相条件为：甲醇30％，水70％；波长：290nm；流速：1ml/min；描记时间：15min。

三、建立动物心肌缺血/缺血再灌注模型

取成年健康SD雄性大鼠，称重，麻醉(方法同前所述)，固定。颈前部和胸前部备皮后，剪一颈前正中纵向切口，逐层分离至气管暴露，做一气管插管。依次分离右侧颈总动脉、右侧股动脉和左侧颈静脉，各做一血管插管，其中右颈总动脉插管插至左心室，分别为记录左心室内压(右颈总动脉插管也用于实验完毕抽取血液样本)、记录动脉血压和建立给药途径所用。连接呼吸机和心电图针状电极，逐层打开胸腔至心脏完全暴露，在心室收缩期小心剪开心包，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘1-2mm处以6-0丝线穿线，备用。

实验共分5个组，(1)对照组(Sham)，该组在大鼠开胸后，对左冠状动脉只穿线，不结扎。(2)缺血/缺血再灌注组(I/R)，将结扎线轻轻提起，用血管钳夹紧，给予缺血30min，然后松开血管钳，使其恢复再灌注120min。(3)U50488H+I/R组(U50)，在缺血前10min静脉注射U50488H，余同I/R组。(4)季胺化U50488H+I/R组(季胺化U50)，在缺血前10min静脉注射季胺化U50488H，余同I/R组。(5)nor-BNI+季胺化U50488H+I/R组(nor-BNI)，在静脉注射季胺化U50488H之前10min静脉注射nor-BNI，余同季胺化U50组。

实验完毕，通过血管插管抽取血液，离心备用(方法同前所述)。

四、季胺化U50488H对缺血心肌梗死面积的影响

实验的手术部分同心肌缺血/缺血再灌注模型的建立。实验完毕，将大鼠冠状动脉左前降支完全结扎(Sham组不结扎)，经大鼠右颈动脉插管将20g/L的伊文思蓝约1ml注入大鼠心脏，待大鼠口唇变蓝后，迅速摘除大鼠心脏进行TTC染色。做TTC染色时，用干净锋利刀片将结扎线以下的大鼠心脏切成约2mm厚的薄片，置于新鲜配制的TTC溶液中37℃水浴孵育15min，取出观察心肌梗死面积。其中，未发生缺血处被TTC染成红色，由于被伊文思蓝掩盖而呈现蓝色；发生缺血的心肌部分被TTC染成红色；而心肌发生梗死的部分既不能被伊文思蓝染色，也不能被TTC染色，因而呈现苍白色。等待色差明显后，将心脏薄片放入4％多聚甲醛中固定，隔夜拍照。

五、血清LDH、CK、GOT、MDA、NO和SOD的检测

各项指标检测时，严格按照试剂盒说明书进行。

六、季胺化U50488H对缺血心肌细胞凋亡的影响

实验的手术部分同心肌缺血/缺血再灌注模型的建立。实验完毕，立即取心脏结扎线以下缺血区作冰冻切片，然后做TUNEL染色，在荧光显微镜下拍照。

Claims (2)

1.首次对κ-阿片受体激动剂U50488H进行季胺化改造，获得一种新的κ-阿片受体激动剂——季胺化U50488H。

2.季胺化U50488H的特征在于，它不能通过血脑屏障，避免了引起机体成瘾和依赖等毒副作用的可能性；但是仍然具有保护缺血/缺血再灌注心脏的功能；且能被κ-阿片受体特异性阻断剂所阻断。这种具有心肌保护作用的新型阿片类药物可用于学术研究，也为临床应用防治缺血性心脏病提供可能的新药，因而具有很好的科学研究价值和临床应用前景。

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