CN101269062B - 马钱素在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了马钱素在制备治疗或者预防心脑血管疾病的药物中的应用，具体涉及马钱素在制备治疗或者制备缺血性脑损伤、脑缺血/再灌注损伤、以及在制备治疗或者预防心肌缺血/再灌注药物中的应用。

Description

马钱素在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及马钱素在制备治疗或者预防心脑血管疾病的药物中的应用。

背景技术

马钱素(loganin)是忍冬的主要成分，结构式如下：

图1马钱素结构式

本发明人通过大量的实验发现，马钱素有抗缺血性脑损伤、抗脑缺血/再灌注损伤和抗心肌缺血/再灌注损伤的药理作用，具有预防或者治疗心脑血管疾病的医药用途。

发明内容

本发明提供了马钱素在制备治疗或者预防心脑血管疾病的药物中的应用。

本发明提供了马钱素在制备治疗或者预防缺血性脑损伤的药物中的应用。

本发明提供了马钱素在制备治疗或者预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。

本发明提供了马钱素在制备治疗或者预防心肌缺血/再灌注的药物中的应用。

本发明提供了以马钱素为活性成分用于心脑血管疾病的药物组合。

本发明所述的马钱素在用于上述任一用途时，其使用的剂量范围为20mg-8000mg/天，优选80mg-3000mg/天，更优选200mg-1000mg/天。

本发明提供的以马钱素为活性成分的药物组合物，其含量为20-1000mg。其可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或者皮下、皮肤粘膜、静脉途径给药。可以以片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、口服液、粉针剂、注射液、膏剂等形式存在。可以以药学常规方法制备而成。

本发明人通过具体实施方式中的实验证明了马钱素具有治疗或者预防心脑血管疾病的作用，实验所用的马钱素，经高效液相检测，含量为95.5％。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例做进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1：马钱素的制备

取忍冬药材加8倍量的水提取3次，每次1小时，滤过，合并提取液，降压浓缩至密度为1.15(50-60℃)，加乙醇质醇含量为80％，静置8小时，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水至1：1(水的体积：原药材重量)，上大孔树脂(大孔树脂可以是SP70、SP850、SP825、HP20中的任何一种)，上样量体积为1-3倍大孔树脂柱体积，5％乙醇溶液洗脱5倍柱体积，20％乙醇溶液洗脱5倍体积，降压回收20％乙醇洗脱液，干燥得到提取物。提取物用甲醇溶解，1倍80目硅胶吸附，真空干燥，得到硅胶吸附物，上硅胶柱柱层析，硅胶柱为200-300目硅胶，上硅胶的量为样品量的5-10倍，氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层硅胶板检测，将含有马钱素部分浓缩，静置，过滤得到马钱素。

实施例2：取马钱素20g，加糊晶10g拌匀，加50％乙醇适量溶湿，制粒干燥，装胶囊，即得，每粒胶囊30mg，含马钱素20mg。

实验例1：马钱素对大鼠局部脑缺血损伤的影响

(1)实验材料：SD大鼠，雌雄兼用，体重190～210g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK1120020008。马钱素提取物，黄棕色粉末，用蒸馏水配制。阳性对照药：天保宁，康恩贝集团制药有限公司生产，每片含银杏叶精提物40mg，批号：980902。FeCl₃·6H₂O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制；红四氮唑(TTC)，北京化工厂产品，批号：960307。化学诱导剂：化学荧光染料四碘四氯荧光素二钠(rose bengal RB)，分子量为1017.60，分析纯(北京化工厂810627)。取RB溶于0.9％生理盐水中，浓度为5.0％，经0.45μm超滤后遮光低温保存备用。

(2)方法与结果

1)马钱素对大鼠中动脉血栓(MCAO)模型试验

将60只大鼠随机分为六组，即假手术对照组、MCAT模型组、给药组3组，天保宁组(24mg/kg)。造模前灌胃给药，一日一次，共给药七次，假手术对照组、MCAT模型组给予等量的饮用水(1ml/100g)，造模后灌胃给药一次。大鼠腹腔注射12％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉，大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约115cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径215mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。

MCAT大鼠神经症状和梗塞范围的评定：在术后不同时间(6h，24h)，按Bederson等的方法并加以改进，对动物进行行为评分。1.提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、时屈曲、肩内旋或既有腕时的屈曲又有内旋者，记为1分。2.将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力者记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。3.将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分；手术对侧前肢肌张力下降记为1分。4.提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分；否则记为0分。根据以上标准评分，满分为4分，分数越高动物的行为障碍越严重。对行为检测打分值进行组间比较，t检验。结果见表1。动物经末次行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部份在4℃下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC1.5ml，1MK₂HPO₄0.1ml)，37℃避光温孵30min，再取出置于10％甲醛液中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占右侧半脑重量的百分比作为脑梗塞范围。结果进行组间比较，t检验，结果见表2。

表1 对MCAT大鼠脑梗塞范围及神经症状的影响(n＝10)

注：与模型阻相比^*P<0.05.^**P<0.01，^***P<0.001

表2 马钱素对光化学诱导脑血栓形成大鼠脑梗塞的影响(n＝10)

结果显示，除假手术组未见行为异常改变，MCAT模型组大鼠在术后6h、24h均出现偏瘫样症状。给药组与天保宁组的大鼠在术后6h、24h其神经症状均有不同程度的改善(P<0.01，P<0.05)。术后24h，除假手术组未见脑组织异常改变外，模型组、给药组大鼠均有不同程度梗塞灶，给药组、天保宁组的大鼠梗塞程度明显减轻，与模型组相比具有显著差异(P<0.01，P<0.05)。马钱素可减轻梗塞灶，结果显示出一定的量效关系。

2)马钱素对光化学诱导脑血栓形成大鼠的影响

将60只大鼠随机分为6组，模型组、假手术组、阳性药组、3个给药组。每日口服给药1次，容积为10ml/kg。连续灌胃15天，模型组及假手术组给等容积的蒸馏水。3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉，沿头正中切口，小心剥离右侧附着于顶骨处的软组织及肌肉，电凝止血，完全暴露右侧顶骨，使用自制微型开颅钻，以矢状缝右侧0.3cm、冠状缝后0.3cm为中心开直径0.6cm的颅窗，保留下层骨板及硬脑膜，股静脉注射5％RB(125mg/kg)，时间为1min。注射RB结束后5min，移入光导纤维照射10min，位置为颅窗脑区。

实验指标与评定：实验组动物于光照结束后10min，假手术组于注射RB结束后25min，经舌下静脉注射1％Evans Blue1ml，1h后断头取脑去除小脑及嗅球，将脑部图象扫描输入计算机。用图象分析软件计算梗塞灶(红染区)及VIP(蓝染区)的范围(占右半脑的相对面积，％)。并用显微观察法评价ADP诱导的血小板聚集，显微镜放大倍数为150，ADP诱导富血小板血浆的终浓度为0.7μmol/ml。记分标准定为视野内无聚集为0；所见最大聚集体中血小板数小于5记分为1；5～10记分为2；10～20为3；大于20为4。

结果表明，模型组与假手术组之间，各项指标均有显著性差异，说明大鼠脑梗塞和血管损伤模型成功。阳性药给药组平均数的改变方向都是与模型组背道而驰的，这说明药效的趋向。马钱素对于脑梗塞的发生有相当显著的抑制作用，三个剂量组的显著性均达到P<0.01以上。对于血管损伤的发生也有一定抑制作用，表现为蓝区面积平均数的减小，在中剂量组也达到统计显著限，对于血小板聚集表现了剂量依赖的抑制作用，在两个剂量达到统计显著限。因此马钱素的抗血小板聚集作用可能是它抗脑梗塞和血管损伤的主要机理，从而使给药组血栓形成的程度低于模型动物。

实验例2：马钱素对大鼠局部脑缺血/再灌注损伤的影响

(1)实验材料：SD大鼠，雌雄兼用，体重190～210g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK1120020008。马钱素提取物，黄棕色粉末，用蒸馏水配制。MDA，SOD，蛋白定量(考马斯亮蓝法)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

(2)方法与结果

1)实验方法：120只大鼠随机分为5组，即假手术组、模型组、3个给药组，每组25只。除假手术组不插线外，其余4组造模(MCAO)。给药组各剂量组ig每天1次，连续13d。术前1h ig再给药1次。6％水合氯醛(350mg·kg^-1)腹腔麻醉，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎颈总动脉近心端、颈外动脉起始端后，在颈总动脉处剪一“V”形小口，沿颈总动脉插入线栓(线栓采用直径为0.235mm的鱼线，头端烧成球状，并于距线球18.5mm处作标记)经颈内动脉向颅内插至大脑中动脉分叉处，插入深度为18～20mm，将线与颈内动脉一起结扎。术中维持体温(37±015)℃。再灌注时外拉线使球端回至ECA，拔除插线，结扎ECA即可。假手术组除不插线外，其余步骤同上。大脑中动脉栓塞后2h恢复血供，神经行为学评分参照ZeaLonga5分制标准，术后出现左前肢屈曲，行走时向左侧转圈即视为造模成功，然后保温常规饲养，至24h断头处死取材。实验过程中，因麻醉意外、MCAO手术失败、造模不成功及24h内死亡的均弃去不用。

脑组织含水量的测定：大鼠造模24h后断头取脑，称量两侧半脑湿重。再置于烘箱中，100℃烘烤24h至恒重，精确称量干重，计算含水量。脑组织含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％。

脑梗死体积测定：断头取脑，将大脑作连续2mm冠状切片，共5片，然后将脑片放入2％TTC磷酸盐缓冲液中37℃恒温孵育30min，正常脑组织染为红色，梗死灶呈白色。滤纸吸去表面液体后用刀片小心刻取未着色部分，将着色部分和未着色部分分别用电子天平称重(以重量代表体积)，计算脑片中梗死部分的质量百分比，以此反映梗死体积比。

脑组织匀浆SOD活力、MDA含量的检测：右侧半脑称重后按1∶10加入冰生理盐水制成匀浆，参照SOD，MDA试剂盒说明书，检测脑组织中SOD，MDA含量。

应用SPSS10.0for windows软件对数据进行处理，计量数据以.x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析。

2)结果

脑组织含水量：左脑组织含水量各组间相比无统计学意义，模型组右脑组织含水量明显高于各组(P<0.05)，高于假手术组(P<0.05)，给药组各剂量组可降低模型脑组织含水量(P<0.05)(表3)。

表3 对脑组织含水量、梗死体积、SOD、MDA含量的影响(n＝8)

与模型阻相比，^*P<0.05

脑梗死体积：模型组脑组织梗死体积高于各组(P<0.05)，给药组各剂量组可降低模型脑组织梗死体积(P<0105)(表3)。

脑组织SOD活力及MDA含量检测与假手术组相比，脑缺血再灌注模型组脑组织MDA含量增加(P<0.05)，SOD活性减弱(P<0.05)；给药组能减少脑组织中MDA的含量(P<0.05)，提高SOD的活性(P<0.05)(表3)。

本研究结果表明，马钱素可减少脑缺血后脑组织水肿，缩小梗死体积，提高SOD活性，降低MDA含量，减轻自由基反应对脑组织的损害，对缺血脑组织具有明显的保护作用。

实验例3：马钱素对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响

(1)实验材料：

SD大鼠，雌雄兼用，体重190～210g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK1120020008。马钱素提取物，黄棕色粉末，用蒸馏水配制。硝酸甘油为北京益民制药厂产品(060105)，0.9％氯化钠注射液、垂体后叶素为上海禾丰制药有限公司产品(060101)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、普萘洛尔为武汉医药公司售品；异搏定注射液为KNOLLAG.D产品(06901.95)，复合麻醉剂(硫喷妥钠2.5％，羟丁酸钠5％)。

(2)方法与结果

1)实验方法

垂体后叶素诱导的急性心肌缺血实验：将大鼠随机分为5组：阳性对照组，阴性对照组，给药组3组，每组8只。给药组灌胃给药，两对照组每天给予同体积量的蒸馏水灌胃，各组连续灌胃7d。均于第7天灌胃后1.5～2.0h腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，采用MS2302多媒体生物信号采集分析系统持续记录标准II导联心电图。实验组、阳性对照组舌下静脉注射垂体后叶素5IU/kg(5s内完成，阳性对照组于注射垂体后叶素前10min腹腔注射硝酸甘油5mg/kg)10min后连续记录15min心电图的变化。心电图中若出现以下之一变化：T波低平，双向，倒置，ST段水平下移≥0.05mV，给予记1分。最后对每只大鼠的总分进行分析，如用药后得分降低，提示心肌缺血有改善。以注射垂体后叶素前后心率变化百分率表示药物对心率的影响。

心肌抗缺血再灌注损伤实验：将大鼠随机分为5组：阳性对照组，阴性对照组，给药组3组，每组8只。给药组灌胃给药，两对照组每天给予同体积量的蒸馏水灌胃，各组连续灌胃7d。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉后记录标准II导联心电图。气管插管，接人工呼吸机(1.0ml·g^-1·min^-1)，在第4～5肋间打开胸腔，暴露心脏，在肺动脉圆锥左缘，左心耳下缘1mm处用320丝线结扎左冠状动脉前降支(阳性对照组于结扎冠状动脉前3min舌下静脉注射普萘洛尔1.0mg/kg)。结扎30min后，剪断结扎线，复灌30min。快速取出心脏，用0.9％氯化钠冲洗，将结扎线以下的心室切成0.1cm厚的心肌片，用0.9％氯化钠冲洗干净。将心肌片放在1％的TTC溶液中，于37℃孵化5min。染色后立即用水冲洗去心肌片上多余的染料。剪去各心肌片被染色的非梗死区心肌，把未染色的梗死心肌和缺血心肌称重。

大鼠血流动力学实验：将大鼠随机分为5组：阳性对照组，阴性对照组，给药组3组，每组8只。给药组灌胃给药，两对照组每天给予同体积量的蒸馏水灌胃，各组连续给药5d。第6天腹腔注射乌拉坦10ml/kg麻醉。记录标准II导联心电图。纵向切开右颈部皮肤，分离右颈总动脉，插入已充满肝素0.9％氯化钠的左室导管，将导管缓慢插入左心室腔。切开左下肢内侧皮肤，分离股动脉，插入动脉导管。接通压力换能器，把信号输至多媒体生物信号记录仪进行观察。平衡30min后，记录给药前各血流动力学指标。

所有数据均以.x±s表达，实验组和对照组数据分析用两样本均数的双侧t检验。

2)结果

缺血/再灌注损伤实验结果表明，给药组、阳性对照组、阴性对照组心肌梗死与结扎线下心肌重量百分比分别见表4。

表4 对心肌梗死与结扎线下心肌重量比的影响

^**P<0.01

马钱素能够降低心肌梗死的发生。

马钱素对垂体后叶素引起的急性心肌缺血的影响见表5。

表5 对垂体后叶素诱导的急性心肌缺血的影响

^**P<0.01，^*<0.05

标明马钱素可以明显改变心电度的变化，不改变心率。

以上实验可以说明，马钱素能够治疗心肌缺血/再灌注。

Claims (6)

1.马钱素作为唯一活性成分，在制备治疗或者预防心脑血管疾病的药物中的应用。

2.马钱素作为唯一活性成分，在制备治疗或者预防缺血性脑损伤的药物中的应用。

3.马钱素作为唯一活性成分，在制备治疗或者预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。

4.马钱素在制备治疗或者预防心肌缺血/再灌注的药物中的应用。

5.以马钱素作为唯一活性成分用于心脑血管疾病的药物组合物。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其含量为20-1000mg。