CN102988242A - 绿豆萌芽提取液的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及绿豆萌芽提取液的制备方法及其用途，在常温的恒温培养箱中用常温去离子水浸泡绿豆，再在光照培养箱中常温萌发36-60小时；用水浴提取法：绿豆与水料液比1:10，50℃搅拌提取2h，经过滤、抽滤，得绿豆萌芽提取液；用于制备舒缓皮肤过敏的药品或化妆品，其包含由绿豆萌芽提取液及赋形剂复配而成的绿豆萌芽舒敏剂，固含量为0.1-15.1%。优点是：以绿豆萌芽为原料进行提取，提取液具有抑制透明质酸酶之功效。提取液通过复配制成具有抗过敏作用的舒敏剂，该舒敏剂稳定性好，能够合成多种抗过敏的有效物质，表现出优异的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒抑制率及大鼠肥大细胞组胺释放抑制率，且对皮肤无不良反应。

Description

绿豆萌芽提取液的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于化妆品制备领域，尤其涉及一种绿豆萌芽提取液的制备方法及该提取液的用途，用于皮肤护理，尤其是抗过敏的化妆品。

背景技术

随着自然环境的污染和人们生活、工作压力的增大以及饮食结构的变化，过敏人群急剧增加。据不完全统计，过敏患者已占世界人口的40%，在美国20%以上的人都受到过过敏性疾病的困扰；日本厚生省过敏综合研究报告也显示：35%的成人和22%的儿童都曾患过不同程度的花粉症，过敏性皮炎，哮喘、鼻炎等过敏性疾患。全球自我感觉敏感性肌肤的人群越来越多，皮肤敏感已经成为影响人类健康的社会问题。

在日常生活中过敏反应普遍发生的为I型过敏反应，其作用机制是通过某些小分子量蛋白质抗原或半抗原，主要有花粉、尘螨、真菌、昆虫、寄生虫、动物皮屑、异种血清、食物、某些药物等抗原（致敏原）进入机体后与附着在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE分子结合，并触发该细胞释放组织胺、前列腺素D、白三烯、血小板活化因子等生物活性物质，引起平滑肌收缩、血管通透性增加、浆液分泌增加等临床表现和病理变化。根据这些活性物质作用的靶细胞不同，可发生呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应或过敏性休克等疾病。

目前市售化妆品品牌均在重视敏感人群市场，几乎欧美所有护肤品牌均推出针对敏感肌肤的产品，并且数量和类型均在增加。但专业护理品牌少：国外品牌，如雅漾、理肤泉、薇姿等专业品牌产品线相对成熟，产品数量较多；国内的仅佰草集凭借其“中草药个人护理专家”的差异化品牌形象，在中高端化妆品市场，占有一席之地。其余品牌针对敏感类皮肤的产品相对数量不多。因此，从天然植物中寻找低毒、高效、安全、经济的抗过敏添加剂可成功避免化学合成制剂制作成本高、不良反应大的缺点，是化妆品领域重要的研究方向。

绿豆，又名青小豆，为豆科草本植物绿豆的成熟种子，自古就以清热解毒闻名，在抗敏古方甘草绿豆解毒汤里对绿豆的抗敏功效有所提及。从绿豆的药理学研究来看，绿豆被证实具有显著的抗炎活性，据已有文献报道，绿豆提取物可以一定程度上抑制脂多糖刺激巨噬细胞过程，从而间接抑制与过敏反应相关的介质（细胞因子、前列腺素）的释放及炎症反应的发生。

绿豆萌芽过程是一个天然活性物质激活和转化的过程。在萌发过程中，绿豆萌芽保存了干种子大部分的营养成分，同时，由于新陈代谢的需要，绿豆萌芽中的部分生物活性酶被激活从而发生一系列的生化反应。一是将大分子物质转化为利于人体吸收的小分子的活性物质，如萌发期的绿豆中蛋白质含量降低，分解为人体所需的各种氨基酸，如赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等16种氨基酸，并且含量增加；二是在各种酶的作用下，二级代谢产物如黄酮类、鞣质类、多酚类物质发生相应的生物转化和合成。研究证明：植物黄酮类、鞣质类成分普遍具有抗炎、抗过敏作用功效。此类物质的抗炎、抗敏作用一方面可以通过减少T细胞凋亡，降低过敏抗体IgE水平，从而在致敏阶段降低I型超敏反应敏感性；另一方面可以抑制肥大细胞脱颗粒，减少颗粒体中的活性介质释放，控制毛细血管扩张、血管通透性增高、黏膜肿胀等，从而缓解临床症状，在激发阶段降低了I型超敏反应的作用；还可以通过抑制机体过敏反应中的储备物质和活性中间介质的释放，从而在效应阶段降低过敏反应。三是各种营养物质大幅增加，如维生素C开始合成，铁、钙、锌、铜等微量元素含量增加。此过程为植物自身生长过程发生的变化。

以绿豆萌芽作为原料研究开发的具有特定功能的活性物质，符合现代人在追求“功效显著”、“回归自然”、“注重安全”的需求。绿豆萌发过程中内含的活性成分发生着复杂的合成、代谢及转化反应，在各种酶的调控作用下，抗敏活性物质发生明显的变化。因此，绿豆萌芽的营养成份、活性物质含量和代谢能力要远高于绿豆本身，从而合成更多新的有效成分和独特的微量元素，而且更易被人体吸收。所以，绿豆萌芽作为化妆品的舒敏添加剂具有很大的开发价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种绿豆萌芽提取液的制备方法，对绿豆萌芽进行提取，为其抗敏应用提供方案。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述绿豆萌芽提取液的用途。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案是：一种绿豆萌芽提取液的制备方法，包括绿豆萌芽的萌发和提取，包括下述步骤：

萌发：第一步：将绿豆消毒、洗净、吸干水分；第二步：在常温的恒温培养箱中用常温去离子水浸泡至绿豆壳破裂；第三步：破壳绿豆在光照培养箱中常温萌发36～60小时；

提取：采用回流提取法、超声提取法或水浴提取法中的一种提取，其中，

水浴提取法为：将绿豆萌芽压紧，加入水，料液比1:(9～11)，48～52℃搅拌提取100～140分钟，提取1～2次，经过滤、抽滤，得绿豆萌芽提取液；

回流提取法为：将绿豆萌芽压紧，加入乙醇，料液比1:(9～11)，48～52℃回流多次，每次40～80分钟，经过滤，合并多次滤液，减压蒸馏回收乙醇，得绿豆萌芽提取液；

超声提取法为：将绿豆萌芽压紧，加入乙醇或水，料液比1:(9～11)，功率150～250W，温度48～52℃提取40～80分钟，经过滤、抽滤，得绿豆萌芽提取液。

具体的，常温萌发的时间可以为30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60小时。

在上述方案的基础上，第三步中，所述的在光照培养箱中常温萌发的时间为45～50小时。即常温萌发两天左右效果最优。

在上述方案的基础上，第三步中，对常温萌发的绿豆每隔12小时用无菌水喷淋一次，每隔24小时用去离子水冲洗一次，以冲去粘、脏物质。

在上述方案的基础上，所述提取方法为水浴提取法，包括下述步骤：

第一步：将绿豆萌芽压紧，加入水，料液比1:(9～11)；

第二步：先闪式提取2～5分钟，再在48～52℃搅拌提取100～140分钟，常温静置5～20分钟；第三步：用150～250目纱布过滤，取清液离心，取上清液抽滤，得绿豆萌芽提取液；

或进一步将绿豆萌芽提取液旋转蒸发浓缩5～15倍，得绿豆萌芽浓缩提取液。

具体的，旋转蒸发浓缩的倍数可以为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。

一种针对上述的绿豆萌芽提取液的用途，用于制备舒缓皮肤过敏的药品或化妆品，所述的药品或化妆品包含由绿豆芽提取液及赋形剂复配而成的绿豆萌芽舒敏剂，舒敏剂中绿豆萌芽的固含量为0.1%～15.1%。

具体的，舒敏剂中绿豆萌芽的固含量可以为0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15或15.1%。

在上述方案的基础上，所述的舒敏剂由绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=(0.06～10)mL:(0.4～0.6)g:(0.8～1.2)mL复配而成。

具体的，绿豆萌芽提取液的用量可以为0.06、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5、5.2、5.5、5.8、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8、9、9.2、9.5、9.8或10mL；海藻糖的用量可以为0.4、0.45、0.5、0.55或0.6g；甘油的用量可以为0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15或1.2mL。

在上述方案的基础上，所述的舒敏剂经灭菌及防腐处理，其中，灭菌为在80～100℃灭菌20～40分钟，防腐为加入质量百分比0.5～0.7%的防腐剂桑普LGP。

本发明的有益效果是：

本发明以绿豆萌芽为原料进行提取，提取液具有抑制透明质酸酶之功效。提取液通过复配制成具有抗过敏作用的舒敏剂，该舒敏剂稳定性好，能够合成多种抗过敏的有效物质，表现出优异的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒抑制率及大鼠肥大细胞组胺释放抑制率，且对皮肤无不良反应。

附图说明

图1为三批绿豆萌芽抑制透明质酸酶的功效检测曲线图；

图2为三批绿豆萌芽抑制透明质酸酶的功效均值曲线图；

图3为绿豆萌芽萌发2天的照片；

图4为用不同方法和溶剂的绿豆萌芽提取液抑制透明质酸酶的功效检测柱状图；

图5为绿豆萌芽舒敏剂样品Ⅰ的照片；

图6为绿豆萌芽舒敏剂样品Ⅱ的照片；

图7为未萌芽（0天）绿豆样品的色谱图；

图8为萌发2天的绿豆萌芽样品的色谱图；

图9为绿豆萌芽舒敏剂对透明质酸酶抑制率的柱状图；

图10为绿豆萌芽舒敏剂对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒抑制率的柱状图；

图11为绿豆萌芽舒敏剂对大鼠肥大细胞组胺释放抑制率的柱状图；

图12为绿豆萌芽舒敏剂溶血实验的柱状图；

附图中标号说明

图7，8中，

2—牡荊素；3—异牡荆素； 5—山奈酚-3-O-芸香糖苷；

6—大豆苷元；7—黄豆黄素；8—染料木素；

10—芦丁；11—木犀草素；12—槲皮素；

13—山奈酚；14—异鼠李素。

图12中，

1—绿豆萌芽固含量0.1%；2—绿豆萌芽固含量0.5%；3—绿豆萌芽固含量1%；

4—绿豆萌芽固含量5%；5—绿豆萌芽固含量10%。 

具体实施方式

绿豆萌芽的萌发工艺

    准备工作：分别准备无污染的塑料盆和塑料筐，用75%酒精消毒，晾干；纱布放入灭菌锅中灭菌；去离子水装入锥形瓶，用灭菌用封口膜封好；光照培养箱灭菌。

    实验过程：    

    第一步：选色泽新鲜、籽粒饱满、无虫蛀、无霉烂、无残破的绿豆粒，将绿豆分为9组，标记为第0组、第1组、……第8组，分别装入9个塑料盆中。将每组绿豆用次氯酸钠溶液消毒，然后用去离子水冲洗，并用滤纸将水吸干。

第二步：用常温去离子水浸泡绿豆，上下翻动使之均匀，在26℃的恒温培养箱中浸泡绿豆约16h至绿豆壳破裂。于浸泡后的绿豆中，立刻取第0组绿豆，常温保存。

第三步：将剩下的第1组～第8组绿豆装入塑料筐中，用纱布作为发芽床托放置绿豆种子，在光照培养箱中26℃进行绿豆萌芽的萌发。在绿豆萌芽过程中，第1组～第8组每隔12h用无菌水喷淋一次，上下翻动使绿豆均匀，且每隔24h对培养箱中的每份豆芽和塑料筐进行一次整体去离子水冲洗，冲去粘、脏物质。

从放入光照培养箱后开始计时，每隔一天取出一筐绿豆萌芽，挑出发霉、腐烂的豆芽后，常温储存备用。即8组绿豆的萌发时间依次为第1组1天，第2组2天，第3组3天，第4组4天，第5组5天，第6组6天，第7组7天及第8组8天。

上述绿豆萌发工艺重复进行三次，验证其稳定性，并选出抗敏功效最佳的萌芽时间。

实验结果：

发芽周期初步选为0～8天，8天后绿豆芽易腐烂，工艺稳定性不易控制。

结果如图1所示，三批绿豆萌芽功效趋势基本相同，证明工艺稳定性良好。图2对三批绿豆萌芽的功效进行了均值处理，由图可知，在第1组～第8组的不同萌芽周期内，第2组，即萌发2天所获得的抗敏功效最佳。萌发时间在48小时左右均能得到较佳的抑制效果。

绿豆萌芽萌发2天的形态为：长出约1cm嫩芽，无子叶。

绿豆萌芽提取工艺

绿豆萌芽提取方法和溶剂比较

    实验方法：

（1）水浴提取法：将绿豆萌芽压紧置于烧杯中，加入80%乙醇或水，料液比1:10，50℃搅拌提取120分钟，经过滤、抽滤，旋蒸浓缩，得绿豆萌芽提取液。

（2）回流提取法：将绿豆萌芽压紧置于圆底烧瓶中，加入80%乙醇或水，料液比1:10，50℃回流3次，每次60分钟，趁热过滤，合并3次滤液，减压蒸馏回收乙醇，得绿豆萌芽提取液。

（3）超声提取法：将绿豆萌芽压紧置于烧杯中，加入80%乙醇或水，料液比1:10，功率200W，50℃提取60分钟，经过滤，抽滤，旋蒸浓缩，得绿豆萌芽提取液。

实验结果：

由图4可知，回流提取法中醇提的抑制率为84%，效果最佳；超声提取法中的水提及水浴提取法中的水提，其抑制率均为80%，效果次佳。但由于工业生产中回流提取和超声提取的成本较大，综合性比较选取水浴提取法中的水提。

绿豆萌芽提取工艺条件的优化

采用L₉(3⁴)正交试验（表1），考察了提取温度、提取时间、料液比、提取次数4个因素对发芽2天的绿豆萌芽的透明质酸酶抑制率，确定其提取的最佳提取工艺。

由正交实验结果可知，最佳提取工艺条件为：料液比1:10，提取温度50℃，提取时间2小时，提取次数1次，对透明质酸酶抑制最佳。其他条件相同，提取次数2次为次佳。

绿豆萌芽舒敏剂的制备工艺

样品I制备工艺：

实施例1

    第一步：将26℃萌发2天所得的绿豆萌芽压紧，加入去离子水，料液比1:10；

第二步：先闪式提取3分钟，再在50℃搅拌提取120分钟，常温静置10分钟；     第三步：用200目纱布过滤，取清液5000rpm离心5min，取上清液经硅藻土抽滤，得绿豆萌芽提取液；

第四步：按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=10mL:0.5g:1mL进行复配；

第五步：在90℃水浴中灭菌30min，搅拌加入0.6wt%的防腐剂桑普LGP，制成绿豆萌芽舒敏剂，灌装储存。

按照第四步的复配比例，所得舒敏剂的固含量在15.1%。

实施例2

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=0.06mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在0.1%（或1mg/mL）。

实施例3

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=0.15mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在0.25%（或2.5mg/mL）。

实施例4

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=0.3mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在0.5%（或5mg/mL）。

实施例5

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=0.6mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在1%（或10mg/mL）。

实施例6

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=1.5mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在2.5%（或25mg/mL）。

实施例7

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=3mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在5%（或50mg/mL）。

实施例8

其他步骤均与实施例1相同，只是复配的比例不同。按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=6mL:0.5g:1mL复配，以使舒敏剂中的固含量在10%（或100mg/mL）。

样品Ⅱ制备工艺：

    第一步：将26℃萌发2天所得的绿豆萌芽压紧，加入去离子水，料液比1:10；

    第二步：先闪式提取3分钟，再在50℃搅拌提取120分钟，常温静置10分钟；     第三步：用200目纱布过滤，取清液5000rpm离心5min，取上清液经硅藻土抽滤，得绿豆萌芽提取液；

    第四步：将绿豆萌芽提取液旋转蒸发浓缩10倍，得绿豆萌芽浓缩提取液。

第五步：按绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=10mL:0.5g:1mL复配；

第六步：在90℃水浴中灭菌30min，搅拌加入0.6wt%的防腐剂桑普LGP，制成绿豆萌芽舒敏剂，灌装储存。

绿豆萌芽有效成分检测

    实验方法：

（1）色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse Plus C18 3×150mm，3.5μm；流动相的选择：乙腈B-0.2%乙酸水溶液A（乙腈B：0min，12%；12min，12%；23min，20%；30min，28%；31min，35%；40min，40%；60min，40%）；检测波长：280nm；流速：0.6mL/min，进样量：1μL。

（2）对照品：异牡荆素，山奈酚-3-O-芸香糖苷，牡荆素，芒柄花素，大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素，黄豆黄素，山奈酚，杨梅素，异鼠李素均购于上海TAUTO Biotech公司；芦丁（169050）购于J&K CHEMICAL LTD

    实验结果：

由图7和图8对比可知，未萌芽（0天）的绿豆合成了牡荊素2，异牡荆素3，山奈酚-3-O-芸香糖苷5，大豆苷元6，黄豆黄素7，染料木素8，木犀草素11，山奈酚13和异鼠李素14九种物质，而萌发2天的绿豆萌芽相比未萌芽（0天）的绿豆进一步新合成了芦丁10和槲皮素12两种物质，而且除了异牡荆素3和牡荆素2稍低外，其它成分均高于未萌芽（0天）的绿豆。

据文献报道芦丁、槲皮素、牡荆素、木犀草素等物质均为有效的抗敏物质。

绿豆萌芽抗敏功效检测

体外透明质酸酶抑制实验

    实验方法：

采用透明质酸酶体外抑制实验Elson-Morgan法：取0.1mL浓度为0.25mol/L的CaCl₂溶液和0.5mL透明质酸酶溶液，在37℃保温培养20min；加入样品液（未浓缩样品Ⅰ）0.5mL，继续37℃保温培养20min；加入0.5mL透明质酸钠溶液后，37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1mL浓度为0.4mol/L的NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定其吸光度值。

样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式为：

            

式中： A——对照溶液ABS值（用醋酸缓冲溶液代替样品液）

       B——对照空白溶液ABS值（用醋酸缓冲溶液代替样品液及酶液）

       C——试样溶液ABS值

       D——试样空白溶液ABS值（用醋酸缓冲溶液代替酶液）

实验结果：

如图9所示，以1%甘草酸二钾为阳性对照，样品Ⅰ固含量达到5%时抑制率与阳性对照相等，可达到95%，固含量达到10%效果更佳，固含量在0.5%～2.5%也具有60%以上的抑制率。

肥大细胞脱颗粒及组胺释放的影响

    实验方法：

将SD大鼠分为6组：正常对照(非致敏)组、模型对照组、绿豆萌芽提取物高计量组（固含量1%）、中计量组（固含量0.5%）、低计量组（固含量0.25%）、色甘酸钠阳性对照组。

（1）动物致敏：在第1日和第5日两次致敏，每只大鼠腹腔注射含150ug OVA、15mg Al(OH)₃致敏液1.5mL。正常对照组注射等量生理盐水。

（2）大鼠腹腔肥大细胞（PMC）脱颗粒实验：

正常对照组：未致敏大鼠PMC悬液1mL + 1mL 1640培养液；

模型对照组：致敏大鼠PMC悬液1mL + 1mL 1640培养液；

阳性对照组：致敏大鼠PMC悬液1mL + 0.2mg/mL色甘酸钠1mL；

绿豆萌芽提取液低计量组：致敏大鼠PMC悬液1mL + 2.5mg/mL（0.25%）绿豆萌芽提取物液1mL；

绿豆萌芽提取液中计量组：致敏大鼠PMC悬液1mL + 5mg/mL（0.5%）绿豆萌芽提取物液1mL；

绿豆萌芽提取液高计量组：致敏大鼠PMC悬液1mL + 10mg/mL（1%）绿豆萌芽提取物液1mL；

各组溶液混匀，放置5min，除正常对照组外，每组加2mg/mL OVA 20uL(导致发敏)，放置20min，37℃水浴5min，1500rpm离心5min，冰浴冷却，取上清液0.6mL测组胺；剩余部分加入0.4mL 0.5%的中性红染液，37℃染色3min，计算出脱颗粒百分率及药物对肥大细胞脱颗粒抑制百分率。

（3）组胺的测定：采用ELISA法，按试剂盒内方法操作。

实验结果：

（1）对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒的影响

    由图10可知，绿豆萌芽提取液高剂量组和阳性对照组（色甘酸钠）显示其对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒具有极显著的抑制作用（P＜0.01），且绿豆萌芽提取液高剂量组更优于阳性对照组；绿豆萌芽提取液中剂量组亦显示对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒具有显著的抑制作用（P＜0.05）。

（2）对大鼠腹腔肥大细胞释放组胺的影响

由图11可知，绿豆萌芽提取液高剂量组和阳性对照组（色甘酸钠）显示其对大鼠腹腔肥大细胞释放组胺具有极显著的抑制作用（P＜0.01），绿豆萌芽提取液中剂量组、绿豆萌芽提取液低剂量组亦显示对大鼠腹腔肥大细胞释放组胺具有显著的抑制作用（P＜0.05）。

综上所述，绿豆提取物从药效学实验证明其具有良好的抗敏功效。

绿豆萌芽安全性检测

红细胞溶血实验

实验方法：

（1）血红细胞（RBC）的制备和储存  

屠宰场取新鲜牛血450mL，盛于聚乙烯塑料容器中，与50mL柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21～22℃，30min内运至实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1h。

用10mL聚乙烯无菌离心管分装采集的血液样本，室温下，1500rpm离心15min，用一次性注射器小心吸取上清液，弃之。同条件下用与全血等量的PBS缓冲液混洗离心管中的RBC 4次，该过程能去除大量的白细胞、血浆和黄色的碎片。向离心管中的RBC添加适量的葡萄糖，使葡萄糖的最终浓度为10mmol/L，密封，4℃冰箱保存备用。

实验前，将RBC取出放置，使其温度稳定于室温，以PBS调RBC终浓度为8×10⁹个/mL，待用，整个过程无菌操作。

（2）RBC溶血实验 

实验分为3组：

阳性对照组（图12中“阳”所指）：向1.5mL离心管中加入25μL RBC悬液，935μL PBS缓冲液和40μL质量浓度为1.0mg/mL的SDS溶液，37℃150rpm振荡孵育10min；

绿豆萌芽自溶对照组（图12中“阴”所指）：分别向1.5mL离心管中加入不同固含量的绿豆萌芽提取液，分别为0.1%、0.5%、1%、5%及10%，加入PBS至975μL混匀，快速加入25μL RBC轻缓混匀，37℃150rpm振荡孵育30min；

绿豆萌芽+SDS组：分别向1.5mL离心管加入不同固含量的绿豆萌芽提取液，分别为0.1%、0.5%、1%、5%及10%（图12中标号分别对应1、2、3、4及5），再加入PBS 至935μL，混匀后加入25μL RBC，振荡孵育30 min后取出，加入40μL质量浓度为1.0mg/mL SDS液，振荡孵育10min。180rpm离心1min终止3组反应，取上清液于1cm比色皿中于530nm波长处测吸光度，计算溶血率。

实验结果：

由图12可以看出，添加绿豆萌芽提取液的组在体系中的浓度为8000μg/mL，均未发生血红细胞溶血现象，溶血率均小于20%，样品没有使血红细胞发生明显的溶血，表明没有明显的刺激性。

斑贴实验

实验方法：

（1）按受试者入选标准选择受试人员，人数为32例。

（2）将受试物放入斑试器内，用量约为0.020mL～0.025mL，可滴加在斑试器所附的滤纸片上置于斑试器内。对照孔为空白对照（不置任何物质）。将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。

（3）去除斑贴器后间隔30min，待压痕消失后观察皮肤反应。

如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

此次实验中样品斑贴试验结果，根据2007年《化妆品卫生规范》的要求原则及《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》判定标准，送检样品绿豆萌芽对皮肤无不良反应。

Claims (7)

1.一种绿豆萌芽提取液的制备方法，包括绿豆萌芽的萌发和提取，其特征在于：包括下述步骤：

萌发：第一步：将绿豆消毒、洗净、吸干水分；第二步：在常温的恒温培养箱中用常温去离子水浸泡至绿豆壳破裂；第三步：破壳绿豆在光照培养箱中常温萌发36～60小时；

提取：采用回流提取法、超声提取法或水浴提取法中的一种提取，其中，

水浴提取法为：将绿豆萌芽压紧，加入水，料液比1:(9～11)，48～52℃搅拌提取100～140分钟，提取1～2次，经过滤、抽滤，得绿豆萌芽提取液；

回流提取法为：将绿豆萌芽压紧，加入乙醇，料液比1:(9～11)，48～52℃回流多次，每次40～80分钟，经过滤，合并多次滤液，回收乙醇，得绿豆萌芽提取液；

超声提取法为：将绿豆萌芽压紧，加入乙醇或水，料液比1:(9～11)，功率150～250W，温度48～52℃提取40～80分钟，经过滤、抽滤，得绿豆萌芽提取液。

2.根据权利要求1所述的绿豆萌芽提取液的制备方法，其特征在于：第三步中，所述的在光照培养箱中常温萌发的时间为45～50小时。

3.根据权利要求1所述的绿豆萌芽提取液的制备方法，其特征在于：第三步中，对常温萌发的绿豆每隔12小时用无菌水喷淋一次，每隔24小时用去离子水冲洗一次。

4.根据权利要求1所述的绿豆萌芽提取液的制备方法，其特征在于：所述提取方法为水浴提取法，包括下述步骤：

第一步：将绿豆萌芽压紧，加入水，料液比1:(9～11)；

第二步：先闪式提取2～5分钟，再在48～52℃搅拌提取100～140分钟，常温静置5～20分钟；     第三步：用150～250目纱布过滤，取清液离心，取上清液抽滤，得绿豆萌芽提取液；

或进一步将绿豆萌芽提取液旋转蒸发浓缩5～15倍，得绿豆萌芽浓缩提取液。

5.一种针对权利要求1至4之一所述的绿豆萌芽提取液的用途，用于制备舒缓皮肤过敏的药品或化妆品，所述的药品或化妆品包含由绿豆萌芽提取液及赋形剂复配而成的绿豆萌芽舒敏剂，该舒敏剂中绿豆萌芽的固含量为0.1%～15.1%。

6.根据权利要求5所述的绿豆萌芽提取液的用途，其特征在于：所述的舒敏剂由绿豆萌芽提取液:海藻糖:甘油=(0.06～10)mL:(0.4～0.6)g:(0.8～1.2)mL复配而成。

7.根据权利要求6所述的绿豆萌芽提取液的用途，其特征在于：所述复配而成的舒敏剂经灭菌及防腐处理，其中，灭菌为在80～100℃灭菌20～40分钟，防腐为加入质量百分比0.5～0.7%的防腐剂桑普LGP。

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