CN102973806A - 一种中药组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种消除细菌耐药性质粒的中药组合物及其制备方法。该中药组合物由虎杖、白芨、甘草组成，所述的中药组合物用于防治细菌耐药性质粒的广泛转移。该中药组合物一方面可用于治疗细菌性肠炎、更主要的是用于消除肠道细菌耐药性质粒。从而阻止质粒广泛转移，消除肠道细菌耐药性质粒。本发明对于目前非常严重的广泛耐药具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，以及该中药组合物的提取、制备和用途，属于医药保健品领域。
背景技术
二十世纪以来医学上最大的进步，是抗生素和化学治疗药物的发现、发展和应用。但随着全球性抗微生物药物的大量应用和滥用，耐药菌株也不断地增加。我国国家细菌耐药性监测中心和中国药品生物制品检定所2002年报告显示：沙门菌属的耐药率，1994～1997与1998～2000年相比：氨苄西林为4.4％升至43.5％，氯霉素为0升至28.3％，复方新诺明为16.7％升至49.5％，四环素为0升至50％，环丙沙星为0.6％升至15.9％，头孢噻肟为0.6％升至14.6％，头孢他啶为0升至11.5％；多重耐药的铜绿假单孢菌的耐药率1994与2000年相比：双重耐药菌由10.8％升至15.3％，三重耐药菌由4.5％升至11.6％，四重耐药菌由4.1％升至9.3％。细菌耐药性已成为21世纪全球关注的热点，耐药的速度越来越快，耐药的程度越来越重，耐药的微生物越来越多，耐药的频率越来越高，耐药造成的后果越来越棘手，耐药造成的负担越来越不堪承受。不断研发新型药物所需的时间周期较长，远赶不上细菌产生耐药性的速度。从基因水平上，耐药的机理主要有两类：细菌本身固有特性和后天获得。前者是一种细菌的进化现象，耐药基因存在于其染色体上；后者是基因突变或由R质粒引进新的基因。R质粒是细菌内染色体外具有独立复制能力的对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双链DNA分子，其上携带着的耐药基因赋予了细菌对某些抗生素的耐药，广泛存在于革兰氏阳性和阴性菌中，几乎所有致病菌皆有之。
1959年，Akiba和Ochiai分别试验，将具有多重耐药的大肠埃希菌与敏感的志贺菌混合培养，发现多重耐药性可由大肠埃希菌传递给志贺菌，首次证实了R质粒的接合传递。大量研究表明，它可通过接合、转导和转化等方式使耐药性在微生物同一菌属间或不同菌属间相互传播；而R质粒的接合传递又是细菌耐药性自然转移的最常见方式。R质粒的接合传递可导致耐药性在同一菌属间或不同菌属间迅速传播，使细菌对抗生素的耐药性在世界范围内播散，给人类感染性疾病的治疗带来了很大的困难。因此破坏R质粒、抑制和阻断R质粒的接合传递可以从根本上控制细菌耐药性的产生和蔓延。
近几十年，国内外学者在这方面的研究主要集中于消除R质粒逆转细菌耐药性，纵观他们的研究发现：无论是化学物质还是中草药，都具有一定的质粒消除作用。但无论那种消除剂都不能消除所有的R质粒，并且各种质粒的消除率也相差甚远：比如喹诺酮类对pORF2的消除，氟啶酸为43％、培氟沙星和阿环丙沙星为12％、氨氟沙星为9％、氧氟沙星为7％、多氟哌酸为4％；而对质粒pSC194、pBR322andpMH612消除率很低，对R1、pP1603和pUB110几乎没有影响。国内学者曾报道黄连、黄芩可以产生质粒去除剂样的作用；马齿苋、金银花提取液亦有相应的质粒消除作用。目前比较肯定的一些消除剂普遍存在着两方面的问题：一是很多消除剂对人体有害或方法本身不适用于人体，就如目前比较肯定的化学消除剂十二烷基硫酸钠(SDS)和溴化乙锭(EB)，它们在适当的作用浓度和温度下均可达到100％，但是这些化学试剂在消除质粒的同时，对人体也会产生一定的危害；二是消除剂对耐药质粒的消除率较低，比如我国特有的、天然的中药黄连，虽然其毒副作用小，但是就目前的研究表明最高消除率仅能达到22.57％。而本发明的中药虎杖、白芨、甘草组合物的消除率可以达到90％以上。可以较好的消除肠道“R质粒”，抑制耐药性的传播。
细菌的耐药性是临床治疗中的难题。国际学术界对其形成机制并不完全清楚，而中医药理论与实践的发展迫切需要加强对其机制的深入研究，以针对细菌耐药性的多层面、多靶点特点进行治疗，从而发挥中药多靶位治疗的优势。本研究结果表明，中药组合物在体内外具有抑制R质粒接合传递作用，这对寻找治疗耐药细菌的有效药物和中药治疗耐药性细菌感染研究具有重要意义。
本发明的设计人多年从事中药抗病原菌的研究。根据我们的经验，中药的直接抗菌作用，相对西药抗生素而言，一般较弱。但中草药在消除肠道“R质粒”则具有优势，因为中草药来源广泛，价格低廉。因而可以进行广泛的筛选，本发明就是从100多种中草药的单方及复方中筛选出来的。查阅已有的文献，中药组合物中虎杖、白芨、甘草无特别的毒性，临床剂量无毒性，对身体不产生危害。
发明内容
本发明提供一种用于消除细菌耐药性质粒(R质粒)的中药组合物。该中药组合物由虎杖10g、白芨10g、甘草3g组成。
本发明进一步提供了该中药组合物的制备方法：按比例称取原料，浸泡、水煎煮并滤过二次、滤液合并浓缩、加入无水食用酒精、滤过、滤液蒸馏、加蒸馏水定容至1g生药/ml。
进一步地，该制备方法为：按比例称虎杖100g、白芨100g、甘草30g。在蒸馏水中浸泡30min，并加入500ml左右蒸馏水(液面浸没中药饮片2-3cm)武火煮沸，待其沸腾后文火慢煎30min，将药液用三层纱布过滤，得滤液200ml左右；再向生药中继续加入蒸馏水至药材表面再次进行煮沸，得滤液200ml左右，将两次滤液合并后浓缩至100-150ml，并将其放入4℃冰箱冷却，待其完全冷却后向浓缩液中加入无水食用酒精300-500ml，静置过夜，次日纱布过滤，并将滤液蒸馏，得无食用酒精的药液，滤液用蒸馏水定容至230ml，最后浓度为1g生药/ml，分装，消毒，低温冷藏，备用。最后药液用于口服。剂量为：10ml/次，3次/日。
本发明的原料中，虎杖为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根；白芨为伞形科植物白芨的干燥根；甘草为豆科植物甘草、胀果甘草、光果甘草的根及根茎。
本发明的优点：
(1)本发明安全无毒、价廉，具有实用性。该组合物的成分均为临床常用的中草药，用量大，药物本身毒性小，对身体不产生危害。
(2)本发明消除细菌耐药性质粒(R质粒)的功能可靠。本发明通过该中药组合物消除细菌耐药性质粒(R质粒)的体内、外实验研究。结果表明中药组合物能消除90％以上的细菌耐药性质粒(R质粒)，抑制R质粒的广泛转移，增强机体抵抗力。
(3)本发明适用人群广泛。对于细菌性肠炎患者服用本中药组合物，可作为治疗及消除自身细菌耐药性质粒(R质粒)和抑制R质粒转移；对于一般人群可作为预防，用于消除自身细菌耐药性质粒(R质粒)和抑制R质粒转移。
具体实施方式：
中药组合物的提取：按比例称虎杖100g、白芨100g、甘草30g。在蒸馏水中浸泡30min，并加入500ml左右蒸馏水(液面浸没中药饮片2-3cm)武火煮沸，待其沸腾后文火慢煎30min，将药液用三层纱布过滤，得滤液200ml左右；再向生药中继续加入蒸馏水至药材表面再次进行煮沸，得滤液200ml左右，将两次滤液合并后浓缩至100-150ml，并将其放入4℃冰箱冷却，待其完全冷却后向浓缩液中加入无水食用酒精300-500ml，静置过夜，次日纱布过滤，并将滤液蒸馏，得无食用酒精的药液，滤液用蒸馏水定容至230ml，最后浓度为1g生药/ml，分装，消毒，低温冷藏，备用。最后药液用于口服。剂量为：10ml/次，3次/日。
效果实施例1
虎杖、白芨、甘草组合物的提取液抑制R质粒接合传递的体外实验研究
R质粒是细菌染色体外具有独立复制能力的对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双链DNA分子，其携带的耐药基因赋予细菌对某些抗生素耐药。R质粒广泛存在于革兰阳性和阴性菌中，几乎所有致病菌皆有R质粒。R质粒可通过接合、转导、转化等方式使耐药性在同一菌属间或不同菌属间传播，使细菌对抗生素的耐药性在世界范围内播散，给人类感染性疾病的治疗带来了很大困难。因此破坏R质粒、抑制和阻断R质粒的接合传递可以从根本上控制细菌耐药性的产生与蔓延。
一、试验用细菌：
痢疾杆菌氯霉素耐药株(S.flexneri D15 R-plasmid CmR)
大肠埃希菌氯霉素敏感株(E.coil 1485RifR)
二、实验分组：
第一组、药物和痢疾杆菌氯霉素耐药株、大肠杆菌氯霉素敏感株同时作用组——观察中药乙醇提取液阻断R质粒转移的情况：
中药组合物乙醇提取液(100mg/ml)0.2ml+S.flexneri D15R-plasmid CmR(7-8小时培养菌)+E.coil 1485RifR(7-8小时培养菌)各0.1ml于1.6ml营养肉汤；置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
第二组、痢疾杆菌氯霉素耐药株对照组——观察R质粒是否自动丢失情况：
S.flexneri D15R-plasmid CmR(7-8小时培养菌)0.2ml于1.8ml营养肉汤，24、48小时37℃细菌培养箱后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对白色菌落(S.flexneri D15 R-plasmid CmR)进行计数。
第三组、大肠杆菌氯霉素敏感株培养基对照组——观察敏感株在麦康凯氏培养基生长情况：
(1)E.coil 1485 RifR(7-8小时培养菌)0.2ml于1.8ml营养肉汤，置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
第四组、R质粒正常转移对照组(R质粒接合传递试验[19])——观察R质粒在S.flexneri D15R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR之间转移情况：
(1)S.flexneri D15 R-plasmid CmR(7-8小时培养菌)+E.coil 1485RifR(7-8小时培养菌)各0.1ml于1.8ml营养肉汤，置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。第五组、药物和痢疾杆菌氯霉素耐药株作用组——考察中药乙醇提取液消除S.flexneri D15R-plasmid CmR R质粒的情况：
(1)中药组合物乙醇提取液(100mg/ml)0.2ml+S.flexneri D15 R-plasmid CmR(7-8小时培养菌)0.2ml于1.6ml营养肉汤；置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对白色(S.flexneri D15R-plasmid CmR)菌落进行计数。
第六组、药物和大肠杆菌耐氯霉素株作用组——考察中药乙醇提取液消除E.coil 1485CmRR质粒的情况。
(1)中药组合物乙醇提取液(100mg/ml)0.2ml+E.coil 1485CmR(7-8小时培养菌)0.2ml于1.6ml营养肉汤；置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
第七组、消除剂和痢疾杆菌氯霉素耐药株、大肠杆菌氯霉素敏感株同时作用组——观察消除剂阻断R质粒转移的情况：
消除剂(溴化乙锭30ug/ml、300ug/ml)0.2ml+S.flexneri D15 R-plasmid CmR(7-8小时培养菌)+E.coil 1485RifR(7-8小时培养菌)各0.1ml于1.6ml营养肉汤；置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
第八组、消除剂对照组——观察R质粒消除情况：
消除剂(溴化乙锭30ug/ml、300ug/ml)0.2ml+S.flexneri D15R-plasmid CmR(7-8小时培养菌)0.2ml于1.6ml营养肉汤；置37℃细菌培养箱中24小时、48小时后稀释10-3，用100ul的移液器吸取50ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂平板各10只，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对白色(S.flexneri D15 R-plasmid CmR)菌落进行计数。
三、观察指标
R质粒转移率％＝转移接合子数/受体菌落数×100％
有效药R质粒转移抑制率％＝(1-药物作用后的转移接合子数/没有药物作用的转移接合子数)×100％
四、数据的统计
所得数据以
表示，应用两样本t检验，采用SPSS 11.0版软件进行统计学处理，以p＜0.05为差别有统计意义，p＜0.01为差异极显著。
五、结果及分析
1、结果：中药组合物的MIC。
中药对S.flexneri D15和E.coil 1485的MIC
注：“-”表示最小抑菌浓度小于0.039g/ml，或MIC未测出。
2、各对照组结果
(1)S.flexneri D15 R-plasmid CmR在麦康凯(不含氯霉素)琼脂平板和麦康凯(含氯霉素)琼脂平板上菌落均生长良好，此两种平板菌落数差别无统计学意义(p＞0.05)。这一结果说明本课题的R质粒自然消失率可忽略不计。
(2)E.coil 1485RifR在麦康凯(不含氯霉素)琼脂平板上生长良好，在麦康凯(含氯霉素)琼脂平板上未见菌落生长。这一结果说明本课题E.coil 1485RifR菌株对氯霉素敏感。
(3)药物对痢疾杆菌耐氯霉素株作用组，S.flexneri D15 R-plasmid CmR在麦康凯(不含氯霉素)琼脂平板和麦康凯(含氯霉素)琼脂平板菌落数差别无统计学意义(p＞0.05)。这一结果说明本课题S.flexneri D15 R-plasmid CmR菌株对氯霉素耐药。
(4)药物对转移接合子E.coil 1485CmR作用组，E.coil 1485CmR在麦康凯(不含氯霉素)琼脂平板和麦康凯(含氯霉素)琼脂平板菌落数差别无统计学意义(p＞0.05)。这一结果提示药物对本课题菌株耐氯霉素的R质粒的消除作用不受麦康凯琼脂平板的影响。
在上述各对照组正常的条件下，对虎杖、白芨、甘草组合物组的药效作出判断：
3、虎杖、白芨、甘草组合物对S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR之间的R质粒转移率(％)
S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR之间的R质粒转移率(％)
分析：与未加药对照组比较，P＜0.01。虎杖、白芨、甘草组合物的R质粒转移率明显降低，和R质粒自然转移率之间有极明显的统计学差异(p＜0.01)。说明虎杖、白芨、甘草组合物能抑制CmR质粒在S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR间的接合传递。24h减少了91％的质粒，48h减少了96％的质粒。
4、虎杖、白芨、甘草组合物对S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR间的R质粒转移抑制率(％)
S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR间的R质粒转移抑制率
分析：与溴化乙锭组对照组比较，P＞0.05。说明虎杖、白芨、甘草组合物抑制R质粒在S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR间接合传递的作用与溴化乙锭相似。可以使90％以上的R质粒消除。24h抑制了91.2％的质粒转移，48h抑制了95.9％的质粒转移。
效果实施例2
虎杖、白芨、甘草组合物的提取液抑制R质粒接合传递的体内实验研究
1、实验操作
分组：
第一组：中药组合物乙醇提取液(100mg/ml)1ml+S.flexneri D15 R-plasmid CmR(18-24小时培养菌)1ml+E.coil 1485RifR(18-24小时培养菌)1ml于7ml营养肉汤；摇匀；用2ml灭菌注射器抽取1ml注入小白鼠腹腔，共20只。分别于24小时和48小时(各10只)后处死，用5ml灭菌注射器抽取3ml灭菌生理盐水行腹腔冲洗，取出腹腔冲洗液于2ml营养肉汤，再用200ul的移液器吸取200ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时后观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
第二组、体内R质粒正常转移对照组——观察体内细菌生长和R质粒转移情况：
S.flexneri D15 R-plasmid CmR(18-24小时培养菌)+E.coil 1485RifR(18-24小时培养菌)各1ml于8ml营养肉汤；摇匀；用2ml灭菌注射器抽取1ml注入小白鼠腹腔，共20只。分别于24小时和48小时(各10只)后处死，用5ml灭菌注射器抽取3ml灭菌生理盐水行腹腔冲洗，取出腹腔冲洗液于2ml营养肉汤，再用200ul的移液器吸取200ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
第三组、阳性药物对照组——观察阳性药物溴化乙锭在体内消除R质粒的情况：
溴化乙锭(30ug/ml)1ml+S.flexneri D15 R-plasmid CmR(18-24小时培养菌)1ml+E.coil 1485RifR(18-24小时培养菌)各1ml于7ml营养肉汤；摇匀；用2ml灭菌注射器抽取1ml注入小白鼠腹腔，共20只。分别于24小时和48小时(各10只)后处死，用5ml灭菌注射器抽取3ml灭菌生理盐水行腹腔冲洗，取出腹腔冲洗液于2ml营养肉汤，再用200ul的移液器吸取200ul接种至麦康凯(含氯霉素/不含氯霉素)琼脂，涂布棒涂匀，置37℃细菌培养箱，24小时观看结果，对紫红色菌落(E.coil 1485)进行计数。
结果及分析
昆明小白鼠各组R质粒转移率
分析：与未加药对照组比较，P＜0.01，虎杖、白芨、甘草组合物的R质粒转移率明显降低，和R质粒自然转移率之间有极明显的统计学差异(p＜0.01)。说明虎杖、白芨、甘草组合物在动物体内能较好地抑制R质粒的转移。24h减少了92.8％的质粒，48h减少了96.3％的质粒。
4、虎杖、白芨、甘草组合物对S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR之间的R质粒转移抑制率(％)
昆明小白鼠各组R质粒转移抑制率
分析：虎杖、白芨、甘草组合物与溴化乙锭组对照组比较，P＞0.05。中药组合物S.flexneriD15 R-plasmid CmR和E.coil 1485RifR间的R质粒抑制率与溴化乙锭对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明中药组合物抑制R质粒在S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coil1485RifR间接合传递的作用与溴化乙锭相似，具有非常高的抑制率，说明中药组合物在体内可以抑制R质粒的接合传递。24h抑制了92.1％的质粒转移，48h抑制了96.3％的质粒转移。
Claims (4)
1.一种用于消除细菌耐药性质粒的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由由虎杖、白芨、甘草组成，其重量比例为虎杖10g、白芨10g、甘草3g。
2.根据权利要求1所述的用于消除细菌耐药性质粒的中药组合物制备方法，其特征在于：按比例称取原料，浸泡、水煎煮并滤过二次、滤液合并浓缩、加入无水食用酒精、滤过、滤液蒸馏、加蒸馏水定容至1g生药/ml。
3.根据权利要求2所述的用于消除细菌耐药性质粒的中药组合物的制备方法，其特征在于，按比例称虎杖100g、白芨100g、甘草30g。在蒸馏水中浸泡30min，并加入500ml蒸馏水，武火煮沸，待其沸腾后文火慢煎30min，将药液用三层纱布过滤，得滤液200ml左右；再向生药中继续加入蒸馏水至药材表面再次进行，得滤液200ml左右，将两次滤液合并后浓缩至100-150ml，并将其放入4℃冰箱冷却，待其完全冷却后向浓缩液中加入无水食用酒精300-500ml，静置过夜，次日纱布过滤，并将滤液蒸馏，得无食用酒精的药液，滤液用蒸馏水定容至230ml，最后浓度为1g生药/ml，分装，消毒，备用。
4.权利要求1所述的中药组合物在制备用于预防或治疗由耐药菌株“R质粒”引起的肠炎的药物中的用途。
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| Title |
|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109971697A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 江苏万邦医药科技有限公司 | 一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法 |
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