CN109971697A - 一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物遗传学相关领域，提供了一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法。本发明通过采用十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)和提高培养温度相结合的方法，有效地消除大肠杆菌中的抗生素抗性质粒，并采用不同的培养条件的传代培养方式，减少了高浓度SDS作用下大肠杆菌致死率的问题，且在传代过程中通过多次抗性平板和非抗性平板划线培养挑选疑似质粒清除菌，最终获得了抗性质粒消除完全的稳定菌株。本方法简单有效，设备要求与成本较低，质粒清除率可达100％。

Description

一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法

技术领域

本发明属于微生物遗传学相关领域，提供了一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法。

技术背景

质粒是共价闭合环状的小型DNA分子，作为独立于染色体外能够自主复制的遗传因子，在细菌细胞内普遍存在。细菌能通过质粒赋予一些特殊的表型特征，诸如抗性和代谢能力等。对质粒进行遗传学研究时，常希望得到其消除质粒的衍生菌株，这样可以方便比较观察质粒的遗传功能，同时完全消除质粒的菌株还可以用于基因工程菌，这在分子生物学研究领域被广泛应用。某些质粒可自发的从细胞中丢失，但大多数质粒在细胞内很稳定，且自然丢失的概率很低，仅为10^-2～10^-8。要想获得消除质粒的菌株，需要使用合适的物理或化学方法干扰质粒复制、或降低质粒的稳定性，人为地提高质粒丢失的频率，以达到质粒消除的目的。

目前质粒消除的方法有物理法、化学处理法和分子生物学法。常用的物理法有高温法和高压电穿孔法，Leavitt等采用高于最适温度5℃培养，成功消除了K.pneumonia 557菌株的内源质粒；Heery等首次用高压电穿孔法消除了大肠杆菌(Escherichia colli)DH1的内源质粒puG2。常用的化学处理试剂有吩噻嗪类、嵌合染料、抗生素类、表面活性剂以及其他化学试剂。Spengler等研究了一系列吩噻嗪及其衍生物对E.coli K12LE140的质粒消除作用，此类试剂的质粒消除效率从0.01％到90％不等；Mathema等利用EB成功消除了肠杆菌(Enterobacter)内源质粒，但此法在消除质粒的同时，易造成细菌染色体突变。利用质粒的不相容性原理，将亲缘关系密切的质粒转化到细胞内，由于亲缘相近的质粒不能稳定共存于同一个宿主菌中，使得细胞在增值过程中将其中一个质粒丢失，也可达到消除目标质粒的目的。

细菌染色体DNA与质粒DNA的一个共同特点是它们均附着于细胞膜上进行复制。SDS是一种常见的离子型表面活性剂，在合适的浓度下它能溶解膜蛋白，破坏细胞膜，SDS可改变质粒在细胞膜上的结合位点，使其不能精确复制，最终导致质粒不能正确地分配到子细胞中，从而达到消除质粒的目的。但是SDS同时对细菌有较强的致死性。

综上，目前现有的大肠杆菌消除质粒的方法中，存在各种物理法以及化学法消除率均比较低，且化学法使用的大量有毒化学试剂，电击法对设备以及电极缓冲液要求较为严苛等问题。

发明内容

本发明提供一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，不会影响细菌本身的特性且有效解决了高浓度SDS致死细菌的不利影响，方法简单有效，对设备以及成本要求低，且消除率高，清除效果稳定。

本发明还提供一种将大肠杆菌传代筛选后获得消除抗生素抗性质粒的稳定的大肠杆菌的方法。

本发明所述一种有效的消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，分别采用含有0.001％-1％SDS的培养基和不含SDS的培养基间隔进行传代培养，培养温度为37-47℃，传代9-20代后挑选在不含抗生素抗性的LB平板中生长，但在含抗生素抗性的平板上不生长的菌落。

本发明还提供一种更为具体的有效的消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，包括如下步骤：

1)将大肠杆菌甘油菌接种到含有0.001％-1％SDS的不含抗生素的LB培养基中，37-47℃高温培养3～8h，记为1代菌液；

2)取1代菌液接种到不含SDS不含抗生素的LB培养基中，37-47℃高温培养12～16h，记为下一代；

3)重复1)～2)传代培养1-2周，将稀释菌液涂布至不含抗生素抗性的LB平板中，33-38℃培养，长出单菌落；

4)挑取步骤3)LB平板长出的单菌落，将相同单菌落分别接种到不含抗生素的LB固体平板和含抗生素抗性的LB固体平板中，标记相应菌落，过夜培养；

5)取在不含抗生素抗性的LB平板中生长，但在含抗生素抗性的平板上不生长的菌落。

进一步的，本发明中含有SDS的培养基中SDS的含量优选为0.01％-0.1％，更优选为0.02％-0.07％，最优选为0.05％。

进一步的，本发明传代培养的温度优选为40℃～47℃，更优选为45℃。

进一步的，本发明传代培养优选传代9-15代。

本发明还提供了一种更为具体的有效的消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法及其验证，包括如下步骤：

A初次传代培养

1)取含抗生素抗性质粒的大肠杆菌甘油菌200ul，接种到含有0.001％-1％SDS的10ml不含抗生素的LB培养基中，37-47℃高温培养3～8h，记为1代；

2)取1代培养3～8h菌液200ul，接种到不含SDS的10ml不含抗生素的LB培养基中，37-47℃高温培养12～16h，记为下一代；

3)重复1)～2)传代培养至一周，将稀释菌液涂布至不含抗生素抗性的LB平板中，37℃培养，待长出单菌落。

B挑取疑似质粒消除菌落

1)用灭菌的牙签挑取LB平板长出的菌落，将相同单菌落分别接种到不含抗生素的LB固体平板和含抗生素抗性的LB固体平板中，标记相应菌落，过夜培养；

2)取在不含抗生素抗性的LB平板中生长，但在含抗生素抗性的平板上不生长的菌落，此菌落记为疑似质粒消除菌落，接种至10ml不含抗生素的LB培养基中30℃过夜活化；

3)活化培养后，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳初步检测质粒是否消除。C再次筛选传代培养

1)根据电泳结果，挑取2～4株疑似消除菌落，重复A步骤筛选至第二周。D挑取疑似质粒消除菌落

1)重复B步骤，筛选疑似质粒消除菌落；

2)PCR验证质粒疑似消除菌落，确定得到质粒消除菌落。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1)本发明提供一种将大肠杆菌传代筛选后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法。相比于其他质粒消除方法，本方法简单有效，对设备需求较低，采用常用的表面活性剂SDS，结合高温培养、不同培养条件传代的方法，所述方法较为温和，既不会影响细菌本身的特性且有效解决了SDS致死细菌的不利影响，同时也极大提高了质粒消除率，使质粒清除率达100％。

2)本方法简单有效，设备要求与成本较低，最终获得了质粒消除完全的稳定菌株，经多次传代验证，质粒均已完全消除，传代稳定。

附图说明

图1.含有抗生素抗性质粒PET-23(a)的大肠杆菌BL21初步筛选琼脂糖凝胶电泳结果图。

图2.初筛选取④号菌落和⑨号菌落继续筛选琼脂糖凝胶电泳结果图。

图3.初筛选取④号菌落和⑨号菌落继续筛选PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图。

图4.质粒完全消除菌连续传代稳定性验证结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例详细说明本发明，这些具体实施例均为说明性的，不以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1：

大肠杆菌BL21含有抗生素抗性质粒PET-23(a)属于革兰氏阴性菌，因PET-23(a)质粒上有一个氨苄抗性基因，含该质粒的大肠杆菌可在含氨苄抗性的抗性平板上生长。

一种经过SDS结合高温培养、不同培养条件的间歇性传代培养方式和多次抗性平板和非抗性平板划线培养挑选疑似质粒清除菌的方法筛选后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法，其步骤如下：

A初次传代培养

1)取含氨苄(50ug/ml)抗性质粒的大肠杆菌甘油菌200ul，接种到含有0.05％SDS的10ml不含氨苄抗生素LB培养基中，45℃高温培养4h，记为1代；

2)取1代培养4h菌液200ul，接种到含有0.05％SDS的不含氨苄抗生素LB培养基中，45℃高温培养4h，记为2代；

3)取2代培养4h菌液200ul，接种到不含SDS的LB培养基中，45℃高温培养16h，记为3代；

4)重复1)～3)传代培养至9代，稀释菌液涂布至不含氨苄抗性的LB平板中，37℃培养，待长出单菌落。

B挑取疑似质粒消除菌落

1)用灭菌的牙签挑取LB平板长出的菌落，将相同菌落分别接种到不含氨苄的LB固体平板和含氨苄的抗性平板中，标记相应菌落，过夜培养；

2)将在不含氨苄的LB平板中生长，但是在含氨苄的抗性平板上不生长的菌落挑出，此菌落记为疑似质粒消除菌落，接种至10ml不含氨苄的LB培养基中过夜活化。

3)活化培养后，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳初步检测质粒消除情况。

经初步筛选传代，随机挑取了18个LB固体平板长出的单菌落，分别转接到LB固体平板和含抗生素抗性平板中，结果筛选出9株不可在氨苄抗性平板生长可在LB固体平板生长的菌落，经活化培养提取质粒，琼脂糖凝胶电泳初步检测。电泳检测结果见附图1。

图1中泳道1～9为疑似消除质粒菌落1号～9号，泳道10为含有质粒的大肠杆菌对照，泳道M为DNA Marker。对比10号对照泳道，9个疑似消除菌落大部分质粒已经消除，但10000bp上方有一浅色条带，可能尚未完全消除。

C再次筛选传代培养

根据步骤B电泳结果，挑取2株疑似消除菌落(图1中4号菌落和9号菌落)，标记为④号菌和⑨号菌，重复A步骤筛选至15代。

D再次挑取疑似质粒消除菌落

1)步骤C获得的菌落，再次重复B步骤中1)和2)，筛选疑似质粒消除菌落；

2)活化培养后，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳初步检测质粒消除情况。

经过再次筛选传代培养，④号菌和⑨号菌各随机挑取了18个LB固体平板长出的单菌落，分别转接到LB固体平板和含抗生素抗性平板中，结果所有单菌落均不可在氨苄抗性平板生长且可在LB固体平板生长。各随机挑取5个菌落经活化培养提取质粒，琼脂糖凝胶电泳初步检测。电泳检测结果见图2。

图2中泳道1～5为④号菌疑似消除质粒菌落1号～5号，泳道6～10为⑨号菌疑似消除质粒菌落1号～5号，泳道11为含有质粒的大肠杆菌对照，泳道M为DNA Marker。对比11号对照泳道，所选取10个疑似菌落视野内无明显条带，大部分质粒均已消除。

3)PCR验证质粒疑似消除菌落，确定质粒消除情况。

取上步骤再次筛选所得到的10株菌落的质粒进行PCR扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见附图3。图3中泳道1～4为④号菌疑似消除质粒菌落1号～4号提取质粒PCR产物，泳道5～9为⑨号菌疑似消除质粒菌落1号～5号提取质粒PCR扩增产物，泳道10号为提取的质粒PET-23(a)PCR扩增产物，泳道11为PCR扩增阴性对照，泳道M为DNAMarker。通过图可以看出对比10号对照泳道，所选取9个疑似菌落视野内无明显条带，质粒均已完全消除，质粒消除率达到100％。

4)抗性基因的引物序列如下：

Forward primer:5’-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3’

Reverse primer:5’-CTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCG-3’

5)实施例中所涉及的引物的合成工作由南京金斯瑞有限公司完成。

6)为了进一步考察其稳定性，选取其中6个菌落接入10ml LB培养基进行活化，37℃，250rpm培养，记为1代。培养3h后转接200ul至10ml LB培养基中，37℃，250rpm培养，记为下一代。循环此步骤，连续培养至20代，提取质粒进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4。图4中泳道1～6为6个菌落无选择压力传代至20代提取质粒后经PCR扩增产物，泳道7为提取的质粒PET-23(a)PCR扩增产物，泳道8为PCR扩增阴性对照，泳道M为DNA Marker。通过图可以看出对比7号对照泳道，所选取6个菌落传代至20代，视野内均无明显条带，质粒均已完全消除，清除效果稳定，且质粒消除率达到100％。

Claims (8)

1.一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于分别采用含有0.001％-1％SDS的培养基和不含SDS的培养基间隔进行传代培养，培养温度为37-47℃，传代9-20代后挑选在不含抗生素抗性的LB平板中生长，但在含抗生素抗性的平板上不生长的菌落。

2.根据权利要求1所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将大肠杆菌甘油菌接种到含有0.001％-1％SDS的不含抗生素的LB培养基中，37-47℃高温培养3～8h，记为1代菌液；

2)取1代菌液接种到不含SDS不含抗生素的LB培养基中，37-47℃高温培养12～16h，记为下一代；

3)重复1)～2)传代培养1-2周，将稀释菌液涂布至不含抗生素抗性的LB平板中，33-38℃培养，长出单菌落；

4)挑取步骤3)LB平板长出的单菌落，将相同单菌落分别接种到不含抗生素的LB固体平板和含抗生素抗性的LB固体平板中，标记相应菌落，过夜培养；

5)取在不含抗生素抗性的LB平板中生长，但在含抗生素抗性的平板上不生长的菌落。

3.根据权利要求2所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于含有SDS的培养基中SDS的含量为0.01％-0.1％。

4.根据权利要求3所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于含有SDS的培养基中SDS的含量为0.02％-0.07％。

5.根据权利要求4所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于含有SDS的培养基中SDS的含量为0.05％。

6.根据权利要求2所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于传代培养的温度为40℃～47℃。

7.根据权利要求6所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于传代培养的温度为45℃。

8.根据权利要求2所述有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于传代培养为传代9-15代。