CN102973581A - 羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及积雪草的用途，尤其涉及积雪草中的单体羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途。本发明还提供了治疗肝纤维化的羟基积雪草苷注射剂 及其制备方法。本发明有效拓宽了肝纤维化和肝硬化患者的选择，而且和现有的治疗肝纤维化药物比较，本发明具备疗效好、不良副作用小的优点。

Description

羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途

技术领域

本发明涉及积雪草的用途，尤其是积雪草在制备治疗肝纤维化药物中的用途，特别涉及羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途。

背景技术

肝纤维化是肝脏纤维结缔组织异常增生的一种病理状态，是慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段。以肝细胞损伤，通过旁分泌作用激活肝星状细胞（Hsc），使其过量合成和分泌细胞外基质（ECM）、促炎症及纤维化细胞因了为特征。随着肝脏病变的发展，肝细胞变性、坏死，再生结节，假小叶和纤维隔形成，肝正常结构遭到破坏，结果使肝脏变硬（肝硬化），进一步可发展为肝癌。西药对肝纤维化尚无有效治疗方法，仅以秋水仙碱为主要治疗药物，但长期应用，毒副反应较大。国外的研究还多集中于基础方面，以期在逐渐明了的肝纤维化形成机理中寻找突破口，而中药抗肝纤维化研究从临床观察和动物实验入手，其初步结果已显示出巨大的潜力。积雪草又名落得打、崩大碗、马蹄等，分布于我国江南各地，为唇形科植物。中医认为其性微寒、味苦、辛、有清热除湿、解毒利尿作用，常用于治疗外感风寒。从临床实践中发现积雪草对预防各种肝炎所致的肝纤维化和肝硬化效果良好。但是积雪草中含有多种成分，具体是哪种成分发挥预防和治疗肝纤维化和肝硬化作用不明，这极大地阻碍了积雪草在治疗肝纤维化和肝硬化中的应用。本发明从积雪草中提取出羟基积雪草苷，并利用肝纤维化大鼠模型对羟基积雪草苷治疗肝纤维化进行了基础研究，结果表明，羟基积雪草苷可明显减少大鼠肝纤维化、肝硬化。

发明内容

本发明的目的在于提供羟基积雪草苷的新用途，即羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种治疗肝纤维化的羟基积雪草苷注射剂及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明利用肝硬化大鼠模型进行羟基积雪草苷阻断肝纤维化病理基础的基础研究，结果表明羟基积雪草苷可明显减少实验大鼠肝纤维化和肝硬化。

羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途。

所述的羟基积雪草苷制备成注射剂。

所述的注射剂为静脉注射剂、动脉注射剂和皮下注射剂。

所述的羟基积雪草苷注射剂剂，由2~15g药物活性成分羟基积雪草苷溶解在1000ml的胶束溶剂系统中制得，所述的胶束溶剂包括15%~30%的表面活性剂和70%~85%的溶剂。

所述的注射剂由2~15g药物溶于1000ml的溶剂中，并通过滤膜制备得到。

所述的表面活性剂包括吐温20、吐温85或两者混合。

所述的溶剂是磷酸缓冲液、生理盐水、羧甲基纤维素溶液、聚乙二醇溶液、丙二醇。

所述的羟基积雪草苷注射剂的制备方法，取表面活性剂，放于量瓶中，加入羟基积雪草苷，震荡至完全溶解，加入pH 7.0 磷酸缓冲液（PBS）至刻度，充分混匀后放于50℃水浴上加热30min，放置6小时至溶液系统平衡，通过滤膜，制成羟基积雪草苷注射液。

所述的羟基积雪草苷注射剂的制备方法，取2~15g羟基积雪草苷，加入到1000ml的溶剂中，搅拌，溶解完全后过滤膜即得。

羟基积雪草苷在酸性条件下的水中溶解，易溶于乙醇、丙烯、吡啶。目前国外积雪草总苷的注射剂多以丙烯或pH3.5左右的注射用水为基质。丙烯会引起注射部位严重疼痛的不良反应，pH3.5超过了注射剂的pH范围4~9，而且过低的pH值出了会带来注射疼痛外，还增加了对脏器、血管等损伤的风险。为增加羟基积雪草苷溶解度，减少注射部位疼痛，我们开发了胶束溶剂系统，包括10%的表面活性剂和90%的磷酸盐缓冲液，pH 7.0（PBS）。这个表面活性剂可以是吐温20和吐温85。当吐温20和吐温85的比例从0:10~10:0之间变化时，积雪草提取物的有效成分单体的溶解度随之上升7~26倍（与单纯在PBS7.0中比较0.7mg/ml），胶束的粒径也随之降低。在吐温20和吐温85的比例为6:4、8:2和10:0时，羟基积雪草苷的溶解度可高达10 mg/ml以上，胶束的粒径低于2μm。在55℃的环境中贮存60天，未发现含量、有关物质等项目发生明显变化。渗透压与以丙烯或pH3.5左右的注射用水为基质的注射剂相比，明显降低，与生理盐水的渗透压更为相似。

 本发明提供了积雪草的一个单体羟基积雪草苷的新用途，在制备治疗肝纤维化药物中的用途，并且提供了一种治疗肝纤维化的羟基积雪草苷注射剂及其制备方法，有效拓宽了肝纤维化和肝硬化患者的选择，而且和现有的治疗肝纤维化药物比较，本发明具备疗效好、不良副作用小的优点。

为了进一步合理利用羟基积雪草苷，我们对羟基积雪草苷做了抗肝纤维化的实验研究，以二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，采用超声波引导下肝脏内注射的方法，观察血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）等指标，研究羟基积雪草苷对实验性大鼠肝纤维化的防治作用。

材料与方法

1、动物及分组：健康SD大鼠84只，雌雄各半，体重（180士20）g, 随机分为6组。分别为正常组（假手术组，给予生理盐水）、模型组、秋水仙碱组（mg/kg）、羟基积雪草苷腹腔注射组（3mg/kg，ip）、羟基积雪草苷大剂量组（6mg/kg）、羟基积雪草苷中剂量组（3mg/kg）、羟基积雪草苷小剂量组（1.5mg/kg）。

2、药物：羟基积雪草苷注射剂，来源于杭州赛利药物研究所有限公司，将药物配制成不同浓度供大、中、小剂量组应用，4℃冰箱保存。

3试剂和仪器：秋水仙碱，由昆明制药集团股份有限公司生产，批号：980732，配制成l0mg/L混悬液，4℃冰箱保存。DMN，上海开明化学厂生产，化学纯，批号：01610720，实验时配制成0.5%的溶液。HA放免试剂盒、LN放免试剂盒，均由上海海军医学研究所提供。Supen1000型全自动生化仪，美国ASCA制造。SN-682型放射免疫X计数器，上海原了能研究所日环仪器厂制造，HitachiEUB-40型超声机，日立公司制造。

4、方法

4.1造模方法：用生理盐水将DMN配成0.5%的溶液，大鼠腹腔注射DMN每次l0mg/kg（2m1/kg），共12次，第1周每天1次，连续3天，第2~4周每周各1次，第5~7周均每天1次，连续2天，至模型建立。

4.2药物肝内直接注射：模型大鼠麻醉后仰卧固定于操作台上，上腹部备皮、消毒，用HitachiEUB-40型超声机3.5MHz探头作肝脏定位导引。穿刺注射采用0.25ml注射器，5号注射针头，注射速度0.6ml/min，分别多点缓慢地注入大鼠肝脏各叶的边缘，间距5mm，进针深度5mm。注射部位用丝线缝合标记。

4.3观察指标及检测方法：2周后，同上麻醉动物，腹主动脉取血制备血清，-20℃冰箱保存，分别检测血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）的含量。采血后取肝脏称重，并取左叶肝脏置10%福尔马林溶液中固定，HE染色，行病理组织学观察肝组织纤维化程度（0~4级）。

5、统计学方法：数据以X 士s表示，采用SPSS11.0软件进行处理。多组资料间比较采用ANOVA分析，肝组织纤维化程度采用等级序值法。

实验结果

1、羟基积雪草苷对肝纤维化大鼠血清TP及ALB的影响 见表1。羟基积雪草苷腹腔注射组、大剂量组、中剂量组、小剂量组与模型组比较，TP及ALB变化均不明显（P>0.05）。

2、羟基积雪草苷对肝纤维化大鼠血清ALT及AST含量的影响  见表1。羟基积雪草苷腹腔注射组、大剂量组、中剂量组、小剂量组及秋水仙碱组与模型组比较，均可降低ALT及AST水平（P<0.01或P<0.05）。

3、羟基积雪草苷对肝纤维化大鼠血清HA及LN含量的影响  见表1。羟基积雪草苷腹腔注射组、大剂量组、中剂量组、小剂量组及秋水仙碱组与模型组比较，HA水平降低，但对LN的影响不明显。

表1 羟基积雪草苷对肝纤维化大鼠血清TP、ALB、ALT、AST、HA及LN的影响(x±s)

组别

n

TP（g/L）

ALB（g/L）

ALT（g/L）

AST（g/L）

HA（g/L）

LN（g/L）

正常

12

70.6±7.8

31.3±3.2

32.7±9.9

107.3±33.4

63.9±12.8

58.7±15.0

模型

12

68.2±5.2

29.6±3.4

126.5±69.1

254.4±78.6

253.4±106.8

75.6±16.4

秋水仙碱

12

71.5±6.2

32.4±4.1

59.5±15.8**

117.0±31.9**

126.5±38.9**

65.2±17.8

腹腔注射

12

72.4±6.4

33.5±3.8

60.5±14.8**

120.0±32.0**

124.5±37.8**

65.5±16.3

大剂量

12

68.5±3.5

34.6±2.5

54.3±12.6*

124.7±39.6*

89.2±39.4*

65.2±14.3

中剂量

12

69.9±3.9

33.5±2.8

59.5±21.2*

148.2±45.1*

102.4±49.6*

68.2±9.9

小剂量

12

70.3±4.8

32.4±3.7

67.4±22.3*

165.4±49.3*

138.4±52.2*

72.5±11.9

 4、各组大鼠肝脏病理组织学结果  正常组大鼠肝小叶结构完整、无炎细胞浸润，无纤维化增生。模型组大鼠肝纤维化程度较明显，肝小叶结构不完善，肝细胞有炎性细胞浸润，汇管区纤维增生包绕肝小叶。秋水仙碱组及羟基积雪草苷腹腔注射组、大剂量组、中剂量组、小剂量组与模型组比较，肝组织炎症细胞浸润、脂肪变性、肝纤维化程度均较模型组减轻（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

表2各组大鼠肝纤维化程度比较(只)

 注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01       

实验结果显示：羟基积雪草苷腹腔注射及肝脏直接给药大中小3个剂量均有不同程度的改善肝功能的作用，对ALT及AST均有较明显的抑制作用(P<0.05)。血清HA测定结果显示：羟基积雪草苷腹腔注射及大中小3个剂量均能明显降低HA的含量(P<0.05)。

具体实施方式

实施例1：制备羟基积雪草苷注射剂 ：

取100ml吐温20，放于1000ml量瓶中，加入10g 羟基积雪草苷，震荡至完全溶解，加入pH 7.0 磷酸缓冲液（PBS）至刻度，充分混匀后放于50℃水浴上加热30min。放置6小时至溶液系统平衡，通过0.45μm的滤膜，制成羟基积雪草苷注射液。

实施例2：制备羟基积雪草苷注射剂 ：

取60ml吐温20和40ml吐温85，放于1000ml量瓶中，加入6g 羟基积雪草苷，震荡至完全溶解，加入pH 7.0磷酸缓冲液（PBS）至刻度，充分混匀后放于50℃水浴上加热30min。放置6小时至溶液系统平衡，通过0.45μm的滤膜，制成羟基积雪草苷注射液。

 实施例3：制备羟基积雪草苷注射剂 ：

取80ml吐温20和20ml吐温85，放于1000ml量瓶中，加入14g 羟基积雪草苷，震荡至完全溶解，加入pH 7.0磷酸缓冲液（PBS）至刻度，充分混匀后放于50℃水浴上加热30min。放置6小时至溶液系统平衡，通过0.45μm的滤膜，制成羟基积雪草苷注射液。

实施例4：

取10g羟基积雪草苷，加入到1000ml的0.5%羧甲基纤维素溶液中，搅拌至完全溶解，将液体通过0.45μm的滤膜，即得羟基积雪草苷静脉注射液。

将制得的羟基积雪草苷静脉注射剂经冷冻干燥后得到羟基积雪草苷冻干针剂。

实施例5：

取5g羟基积雪草苷，加入到1000ml的聚乙二醇300溶液中，搅拌至完全溶解，将液体通过0.45μm的滤膜，即得羟基积雪草苷动脉注射液。

将制得的羟基积雪草苷动脉注射剂经冷冻干燥后得到羟基积雪草苷冻干针剂。

 实施例6：

取5g羟基积雪草苷，加入到1000ml注射用水中，搅拌至完全溶解，用盐酸或氢氧化钠将pH调至3.5，将液体通过0.45μm的滤膜，即得羟基积雪草苷皮下注射液。

 将制得的羟基积雪草苷皮下注射剂经冷冻干燥后得到羟基积雪草苷冻干针剂。

实施例7：

取12g羟基积雪草苷，加入到1000ml丙二醇中，搅拌至完全溶解，将液体通过0.45μm的滤膜，即得羟基积雪草苷注射液。

将制得的羟基积雪草苷注射剂经冷冻干燥后得到羟基积雪草苷冻干针剂。

Claims (9)

1.羟基积雪草苷在制备治疗肝纤维化药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的羟基积雪草苷制备成注射剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的注射剂为静脉注射剂、动脉注射剂和皮下注射剂。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的羟基积雪草苷注射剂剂，由2~15g药物活性成分羟基积雪草苷溶解在1000ml的胶束溶剂系统中制得，所述的胶束溶剂包括15%~30%的表面活性剂和70%~85%的溶剂。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的注射剂由2~15g药物溶于1000ml的溶剂中，并通过滤膜制备得到。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的表面活性剂包括吐温20、吐温85或两者混合。

7.根据权利要求4或5 所述的用途，其特征在于所述的溶剂是磷酸缓冲液、生理盐水、羧甲基纤维素溶液、聚乙二醇溶液、丙二醇。

8. 根据权利要求2~4所述的羟基积雪草苷注射剂的制备方法，其特征在于取表面活性剂，放于量瓶中，加入羟基积雪草苷，震荡至完全溶解，加入pH 7.0 磷酸缓冲液（PBS）至刻度，充分混匀后放于50℃水浴上加热30min，放置6小时至溶液系统平衡，通过滤膜，制成羟基积雪草苷注射液。

9.根据权利要求5所述的羟基积雪草苷注射剂的制备方法，取2~15g羟基积雪草苷，加入到1000ml的溶剂中，搅拌，溶解完全后过滤膜即得。