CN102965430A

CN102965430A - 用于检测bmpr2基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒

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Publication number: CN102965430A
Application number: CN2012102555157A
Authority: CN
Inventors: 卢文菊; 张晨婷; 王健
Original assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF GUANGZHOU MEDICAL SCHOOL
Current assignee: Guangzhou Ruineng Precision Medical Technology Co ltd; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2012-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-07-23
Also published as: CN102965430B

Abstract

本发明公开了用于检测BMPR2基因突变的引物组，至少包括BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物组。本发明还公开了所述引物组的用途、包含所述引物组的试剂盒以及使用所述引物组对BMPR2基因进行PCR扩增方法。所述的引物组可以专一性鉴别BMPR2基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。

Description

用于检测BMPR2基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒

技术领域

本发明涉及引物，具体涉及用于检测BMPR2基因突变的引物组，本发明还涉及该引物组的用途，以及包含该引物组的试剂盒。

背景技术

肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压（meanpulmonary arterial pressure，mPAP）≥25mmHg的一组临床病理生理综合征。肺动脉高压可以作为一种疾病而独立存在，更常见的是很多疾病进展到一定阶段的病理生理表现。由于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。这是一种极度恶性的疾病，七成多患者是年轻人，几乎每个人都知道癌症愈后差，但没有人知道肺动脉高压是一种极度恶性疾病，它的病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强，其愈后是灾难性的，可以说，这种病就是心血管疾病中的癌症。这种疾病平均发病年龄是36岁，75%患者集中于20-40岁年龄段，还有15%患者年龄在20岁以下，几岁的孩子也会发病。世界上该病的发病率在1×10^-5～1×10^-6之间，其中约6%为家族性的。多数家族性肺动脉高压和超过26%的散发病例都伴有骨形成蛋白Ⅱ型受体基因（Bonemorphogenetic protein receptorⅡgene，BMPR2）序列改变。BMPR2存在大量不同的突变，但其临床表现和病理学特征与散发例完全一致。因此采用DNA检测寻找BMPR2基因突变有助于识别家系中高风险的成员，以及未出生孩子的患病风险，这对提高人口素质，优生优育有重要的意义。对于散发性病人进行BMPR2基因突变检测，对指导用药，基因评估具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测BMPR2基因突变的引物组。

BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中的任一区域在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为BMPR2基因发生了突变。因而，根据BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别设计出能专一性鉴别BMPR2基因是否突变的特异性引物组，可通过PCR扩增和测序测定BMPR2基因上述区域是否发生改变，以鉴定BMPR2基因是否发生突变，因此，本发明的用于检测BMPR2基因突变的引物组可以是BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的引物组。

本发明第一个目的提供的用于检测BMPR2基因突变的引物组，包括BMPR2基因第1到第13外显子区，3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，即选自BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，具体地，所述引物组选自BMPR2基因的第1外显子区(Exon1)的PCR扩增引物组、第2外显子区(Exon2)的PCR扩增引物组、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物组、第4外显子区(Exon4)的PCR扩增引物组、第5外显子区(Exon5)的PCR扩增引物组、第6外显子区(Exon6)的PCR扩增引物组、第7外显子区(Exon7)的PCR扩增引物组、第8外显子区(Exon8)的PCR扩增引物组、第9外显子区(Exon9)的PCR扩增引物组、第10外显子区(Exon10)的PCR扩增引物组、第11外显子区(Exon11)的PCR扩增引物组、第12外显子区(Exon12)的PCR扩增引物组、第13外显子区(Exon13)的PCR扩增引物组、3’UTR的PCR扩增引物组、5’UTR的PCR扩增引物组和启动子的PCR扩增引物组中的任意一组，所述的上述各PCR扩增引物组为表1所示。

表1：BMPR2基因PCR扩增引物序列

本发明所述的引物组还包括BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的PCR测序引物组，具体地，所述引物组包括选自BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的任意一组。

本发明所述的PCR测序引物组如表2所示。

表2：BMPR2基因PCR测序引物序列

本发明的第二个目的是提供使用上述PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测BMPR2基因是否突变的试剂中的用途。

所述PCR扩增反应包括第一阶段反应和第二阶段反应，其中，

(1)第一阶段反应：

包括11个扩增循环反应，其条件为：

变性：温度98~94°C，

退火：起始温度为62°C，每两次扩增循环退火温度递减0.5°C，直至扩增循环结束，

延伸：温度为72°C，

(2)第二阶段反应：

包括24个扩增循环反应，其条件为：

变性：温度94~95°C，

退火：温度为57°C，

延伸：温度68~72°C。

本发明中所述的PCR扩增反应中每20μl的反应体系中使用0.2~1μl的各引物和10~100ng模板DNA。

本发明PCR扩增方法还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37°C孵育60min，70°C10min。

本发明的目的之三是提供一种用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，以方便采用DNA测序技术检测导致肺动脉高压发病的BMPR2基因是否突变。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，包括BMPR2基因的第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，PCR扩增引物组为表1所示。

本发明所述的试剂盒还包括如表2所示的BMPR2基因的第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的一组或两组以上的PCR测序引物组。

本发明还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。

所述的PCR扩增试剂包括dNTP、Taq DNA聚合酶等。

所述的PCR产物纯化试剂包括SAP酶、ExoI酶等。

所述的DNA测序试剂包括BigDye mix、EDTA溶液、HIDI溶液等。

本发明的第四个目的是提供使用上述引物组或者试剂盒对BMPR2基因的PCR扩增方法。

本发明第四个目的是通过以下技术方案来实现的：一种使用上述引物组或者试剂盒对BMPR2基因的PCR扩增方法，取表1所述的BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上对BMPR2基因进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应包括第一阶段反应和第二阶段反应：

(1)第一阶段反应：

包括11个扩增循环反应，其条件为：

变性：温度98~94°C，

延伸：温度为72°C，

(2)第二阶段反应：

包括24个扩增循环反应，其条件为：

变性：温度94~95°C，

退火：温度为57°C，

延伸：温度68~72°C。

本发明的有益效果：

(1)本发明根据BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子，共16个区域序列设计特异性引物组，可以专一性鉴别BMPR2基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。

(2)本发明提供的引物组及试剂盒用于检测肺动脉高压的致病基因BMPR2基因的突变体，可以快速的检测患者的基因是否突变，可以用于肺动脉高压的疾病诊断。同时还可以用于BMPR2SNP位点与基因功能之间关系的科学研究上。

(3)本发明PCR采用降落PCR的扩增方法能大幅提高PCR的特异性和效率，而且每个引物扩增的条件类似，可以同时进行扩增。并且扩增的条带为单一目的条带，不需要回收目的片段直接进行测序反应。

附图说明

图1是血液基因组DNA的1%的Agarose电泳图；

M：DNADL1500maker，1、2：血基因组DNA。

图2是本发明实施例五中的血液样本中的BMPR2基因的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一

依据NCBI Gene Bank（NC-000002）公开的BMPR2基因的第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子序列，设计出用于检测BMPR2基因是否发生突变的引物组，该引物组包括对应于以上任一区域的PCR扩增引物组和PCR测序引物组，结果见表1和表2。

实施例二

一种用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，包括以下成分：

（1）BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子序列分别对应的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共34对，每条引物1OD，各对引物序列参见表1和表2。

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例三

一种用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，包括以下成分：

（1）BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子序列的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共34对，每条引物1OD，各对引物序列参见表1和表2。

（2）PCR扩增试剂：2.5mM dNTP混合液40μl、5×扩增缓冲液(含Mg²⁺)100μl、5Units/ul Taq DNA聚合酶5μl。

(3)PCR产物纯化试剂：1U/ul SAP酶20μl、10U/ul ExoI酶10μl。

（4）PCR测序试剂：BigDye3.1mix50μl、0.125M EDTA溶液50μl、无水乙醇1ml、75%乙醇溶液1.5mL、HIDI溶液500μl。

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例四

一人份检测BMPR2基因突变的试剂盒的使用步骤：

（1）一份病人的血液1mL，提取血液基因组DNA，使用QIAamp DNABlood MiniKit(250)Cat.no.51104提取基因组DNA。1%Agarose凝胶电泳，结果见附图1。

（2）PCR扩增：34对引物共进行34个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，

PCR扩增反应条件：

62°C-0.5°C是指退火起始温度为62°C，每两次扩增循环退火温度递减0.5°C，直至扩增循环结束。

（3）PCR产物纯化：共进行34个PCR纯化反应，每个反应体系总体积20μl，其中，

PCR反应条件为：37℃孵育60min，70℃10min。

（4）DNA测序反应：共进行34个测序反应。每个反应的体系为2μl BigDye3.1mix，2μl测序引物(0.4μM)，加入2μl纯化的PCR产物。反应条件：96°C1min；96°C10s，50°C5S，60°C4min，28个循环反应。

（5）反应结束后纯化测序产物，即每管加入1μl0.125M的EDTA和15μl的乙醇，常温放置15min，4℃1000g/min离心30min,小心倒去上清，加入75%乙醇溶液，4℃1000g/min离心15min，小心倒去上清；室温放置20min。晾干后在管中加入Hi-Di去离子甲酰胺10μl，放入测序仪中。测序产物上ABI3130XL测序仪，测序文件用Polyphred软件分析，并结合人工校对记录后整理出结果。如果所得测序结果中，BMPR2基因第1到第10外显子区、3’UTR和启动子序列中任一区域的结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，认为ALK-1基因发生了突变，反之则没有发生突变。

实验结果：

此样本的BMPR2基因并未发生突变。

实施例五

与实施例四不同的是：

（2）PCR扩增：34对引物共进行34个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，包含1μl 15ng/μl基因组DNA、1μl 2.5mM dNTP、0.5μl上游引物(10μM)、0.5μl下游引物(10μM)、4μl 5×扩增缓冲液(含Mg²⁺)、0.2μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)、20μl dd H₂O。PCR扩增反应条件：95°C反应15min；94°C反应15s，62°C-0.5°C反应40s，72°C反应1mins，11个循环反应；94°C反应15s，57°C反应30s，72°C反应1mins，24个循环反应；2°C反应2min。

实验结果：

测序结果如图2所示，箭头指出的位置有双峰，说明是此样本的BMPR2基因外显子2在本位点发生突变，即突变碱基为c.178C>T氨基酸突变为Cys60Arg。

本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，本发明的试剂盒还可以是BMPR2基因第1到第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子序列任一序列对应的PCR引物组和PCR测序引物组，每条引物1OD；或者是上述引物组中的两组以上的组合。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.用于检测BMPR2基因突变的引物组，其特征在于，包括BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组包括:

(1)所述启动子的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物P1F和具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列所示的引物P1R的引物组；

(2)所述5’UTR的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的引物P2-1F和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物P2-1R的引物组、具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物P2-2F和具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的引物P2-2R的引物组、具有SEQID NO.7所示的核苷酸序列的引物P3-1F和具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物P3-1R的引物组；

(3)所述Exon1的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物P3-2F和具有SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的引物P3-2R的引物组；

(4)所述Exon2的PCR扩增引物组:具有SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物P4F和具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的引物P4R的引物组；

(5)所述Exon3的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的引物P5F和具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的引物P5R的引物组；

(6)所述Exon4的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的引物P6F和具有SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的引物P6R的引物组；

(7)所述Exon5的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的引物P7F和具有SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的引物P7R的引物组；

(8)所述Exon6的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的引物P8F和具有SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列的引物P8R的引物组；

(9)所述Exon7的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物P9F和具有SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的引物P9R的引物组；

(10)所述Exon8的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物P10F和具有SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物P10R的引物组；

(11)所述Exon9的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物P11F和具有SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物P11R的引物组；

(12)所述Exon10的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的引物P12F和具有SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的引物P12R的引物组；

(13)所述Exon11的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的引物P13F和具有SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的引物P13R的引物组；

(14)所述Exon12的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物P14F和具有SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的引物P14R的引物组、具有SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的引物P15F和具有SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的引物P15R的引物组、具有SEQID NO.35所示的核苷酸序列的引物P16F和具有SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的引物P16R的引物组；

(14)所述Exon13的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的引物P17F和具有SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列的引物P17R的引物组;

(15)所述3’UTR的PCR扩增引物组:包括具有SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列的引物P18F和具有SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列的引物P18R的引物组、具有SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列的引物P19-1F和具有SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列的引物P19-1R的引物组、具有SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列的引物P19-2F和具有SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列的引物P19-2R的引物组、具有SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列的引物P20F和具有SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列的引物P20R的引物组、具有SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列的引物P21F和具有SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列的引物P21R的引物组、具有SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列的引物P22-1F和具有SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列的引物P22-1R的引物组、具有SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列的引物P22-2F和具有SEQ ID NO.52所示的核苷酸序列的引物P22-2R的引物组、具有SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列的引物P23F和具有SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列的引物P23R的引物组、具有SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列的引物P24F和具有SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列的引物P24R的引物组、具有SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列的引物P25F和具有SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列的引物P25R的引物组、具有SEQ IDNO.59所示的核苷酸序列的引物P26F和具有SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列的引物P26R的引物组、具有SEQ ID NO.61所示的核苷酸序列的引物P27F和具有SEQ ID NO.62所示的核苷酸序列的引物P27R的引物组、具有SEQ ID NO.63所示的核苷酸序列的引物P28F和具有SEQ IDNO.64所示的核苷酸序列的引物P28R的引物组、具有SEQ ID NO.65所示的核苷酸序列的引物P29F和具有SEQ ID NO.66所示的核苷酸序列的引物P29R的引物组、具有SEQ ID NO.67所示的核苷酸序列的引物P30F和具有SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的引物P30R的引物组。

2.用于检测BMPR2基因突变的引物组，其特征在于，还包括BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子中任一区域对应的PCR测序引物，所述的PCR测序引物包括：

(16)所述启动子的PCR测序引物包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物P1F；

(17)所述5’UTR的PCR测序引物包括具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的引物P2-1F、具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的引物P2-2R和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物P3-1R；

(18)所述Exon1的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物P3-2F；

(19)所述Exon2的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物P4F；

(20)所述Exon3的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的引物P5F；

(21)所述Exon4的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的引物P6R；

(22)所述Exon5的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的引物P7F；

(23)所述Exon6的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的引物P8F；

(24)所述Exon7的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的引物P9R；

(25)所述Exon8的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物P10F；

(26)所述Exon9的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物P11R；

(27)所述Exon10的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的引物P12R；

(28)所述Exon11的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的引物P13R；

(29)所述Exon12的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物P14F、具有SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的引物P15F和具有SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的引物P16F；

(30)所述Exon13的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的引物P17F；

(31)所述3’UTR的PCR测序引物组包括具有SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列的引物P18F、具有SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列的引物P19-1F、具有SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列的引物P19-2F、具有SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列的引物P20F、具有SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列的引物P21F、具有SEQ ID NO.50所示的核苷酸序列的引物P22-1R、具有SEQ IDNO.51所示的核苷酸序列的引物P22-2F、具有SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列的引物P23F、具有SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列的引物P24F、具有SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列的引物P25F、具有SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列的引物P26F、具有SEQ ID NO.61所示的核苷酸序列的引物P27F、具有SEQ ID NO.63所示的核苷酸序列的引物P28F、具有SEQ ID NO.65所示的核苷酸序列的引物P29F和具有SEQ ID NO.67所示的核苷酸序列的引物P30F。

3.权利要求1所述的PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测BMPR2基因是否突变的试剂中的用途。

4.包含权利要求1的引物组的用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，包括BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组如权利要求1所示。

5.根据权利要求4所述的用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，还包含有权利要求2所述的PCR测序引物组。

6.根据权利要求4或5所述的用于检测BMPR2基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。

7.一种使用权利要求1或2所述的引物组或者权利要求4或5所述的试剂盒对BMPR2基因的PCR扩增方法，其特征在于，取权利要求1所述的BMPR2基因第1至第13外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组对BMPR2基因进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应包括第一阶段反应和第二阶段反应：

(1)第一阶段反应：

包括11个扩增循环反应，其条件为：

变性：温度98~94°C，

延伸：温度为72°C，

(2)第一阶段反应：

包括24个扩增循环反应，其条件为：

变性：温度94~95°C，

退火：温度为57°C，

延伸：温度68~72°C。

8.根据权利要求7所述的BMPR2基因的PCR扩增方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应中每20μl的反应体系中使用0.2~1μl的各引物和10-100ng模板DNA。

9.根据权利要求7或8所述的BMPR2基因的PCR扩增方法，其特征在于，还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37°C孵育60min，70°C10min。