CN102964449A

CN102964449A - 重组抗人cd25嵌合抗体

Info

Publication number: CN102964449A
Application number: CN2012104206663A
Authority: CN
Inventors: 胡迪超; 杨晓明; 张爱华
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明公开了一种重组抗人CD25人鼠嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQ ID NO:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID NO:6所示；其完整重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。本发明所公开的嵌合抗体能特异性识别人CD25分子，其平衡解离常数为2.35×10^-10 M，在预防器官移植排斥反应以及治疗某些自身免疫病和肿瘤等方面具有潜在应用价值。

Description

重组抗人CD25嵌合抗体

技术领域

本发明属于抗体药物技术领域，具体涉及一种针对人T细胞表面CD25分子的重组人/鼠嵌合抗体及其编码基因。

背景技术

T细胞活化和细胞免疫应答有赖于IL-2与T细胞膜上的IL-2R结合。高亲和力的IL-2R是由α (CD25)、β (CD75)和γ (CD132)链组成的异源三聚体复合物，其分子质量分别为55 kDa、75 kDa和 64 kDa。α、βγ和αβγ与IL-2的平衡解离常数常数(Kd)分别为10^-8、10^-9和10^-11 M。由此可见，α链在活化T细胞过程中具有核心作用。此外，β和γ链结构与I型细胞因子受体家族成员高度相似，而α链为独立一个家族。

人CD25分子(又称为Tac抗原或IL-2Rα)是由251个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白，其分子质量约为55 kDa，血清中可溶性CD25(s-CD25或s-Tac)分子质量约为45 kDa。正常情况下，未受刺激的T细胞几乎不表达CD25分子。当T细胞接受抗原刺激活化后即可高表达CD25分子，形成高亲和力的IL-2R后与IL-2相互作用进而促进T细胞增殖和分化。然而，当进行器官移植(如肾脏、肝脏、心脏和骨髓)以及患有自身免疫病(如再生障碍性贫血、Crohn's病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、SLE、葡萄膜炎等)和肿瘤(如急性髓样淋巴瘤、CTCL、PTCL、覃样肉芽肿、成年T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/非霍奇金淋巴瘤等) 时，CD25的表达水平也会增高(Waldmann TA, O'Shea J. Current Opinion in immunology, 1998, 10: 507-512. Morris JC, Waldmann TA. Ann Rheum Dis, 2000, 59: i109-i114. Waldmann TA. J Clin Immunol, 2007, 27 (1): 1-18. )。

由此可见，CD25可成为一个预防器官移植排斥反应以及治疗某些自身免疫病和肿瘤的潜在靶标(Church AC. Q J Med, 2003, 96:91-102.)。人鼠嵌合抗体basiliximab和人源化抗体daclizumab获准用于临床以来，在预防急性肾脏移植排斥反应中发挥着重要作用。国产的抗人CD25人源化抗体(daclizumab仿制药)也于2011年获得SFDA颁发的批准文号。WuTac是我所上世纪80年代自主研发的具有自主知识产权的抗人CD25单克隆抗体(IgG1κ)，Ⅰ期临床研究(SFDA批件号：2003L03465)结果表明具有良好的药物耐受性和安全性。然而，毕竟鼠源性单克隆抗体是异源蛋白，因而仍可能存在一些影响药物疗效的问题。鉴于此，采用重组DNA技术将其改造成嵌合抗体或人源化抗体是解决此问题的重要途径之一。

常规的扩增小鼠抗体可变区的方法是使用一组简并引物(Kettleborough CA, Saldanha J, Ansell KH, et al. Eur J Immunol, 1993, 23: 206-211.)。然而，由于抗体可变区基因的巨大多态性，现有的简并引物并不能完全覆盖所有的抗体基因序列，因此存在扩增不出或扩增出的基因序列存在突变等问题。本发明前期采用该法克隆出的序列就有多个碱基发生突变，从而影响了信号肽的活性和抗体的亲和力。RLM-RACE法 (RNA ligase-mediated rapid amplification of 5' cDNA end) 是一种不依赖于DNA模板序列的技术(Liu X, Gorovsky M. Nucleic Acids Research, 1993,21 (21): 4954-4960)，其为准确克隆出抗体可变区和信号肽序列以及与表达调控有关的5'非编码区(5'-UTR)提供了可能。

发明内容

本发明解决问题之一是采用RLM-RACE法准确克隆出WuTac鼠单抗的可变区序列。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明解决问题之二是采用重组DNA技术构建了具有自主知识产权的抗人CD25分子人鼠嵌合抗体IgG1κ。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其重链核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其轻链核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示，其轻链“+4A”突变为“+4G”，终止密码子“TAG”突变为“TGA”。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其重链氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体，其轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。

本发明提供的重组抗人CD25嵌合抗体基因序列在哺乳动物细胞(如HEK293T、CHO-DHFR^-和COS-7)内进行了表达，并获得了目的抗体。

本发明提供的基因序列在哺乳动物细胞内表达时在重链5'端“ATG”前添加了Kozak序列“GCCGCCACC”， 3'端“TGA”后添加了“GCT”序列。

本发明提供的基因序列在哺乳动物细胞内表达时在轻链5'端“ATG”前添加了Kozak序列“GCCGCCACC”，并将“+4A”突变为“+4G”；且将3'端“TAG”突变成“TGA”后添加了“GCT”序列。

以该序列为模板可以在保持特异性和亲和力的前提下进化成全人源抗体或人源化抗体以及各种具有应用前景的产品，如scFv,Fab等。

所述抗体不仅可用于预防器官移植排斥反应(如肾脏、肝脏、心脏和骨髓等)，而且对于治疗某些肿瘤如HTLV-1相关的成人T细胞淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、蕈样真菌病(MF)、非霍奇金淋巴瘤等以及某些自身免疫病如葡萄膜炎(Uveitis)、银屑病、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、Crohn′s病、多发性硬化症(MS)、再生障碍性贫血(Aplastic anaemia)等具有潜在应用价值。

本发明所提供的重组抗人CD25嵌合抗体能特异性识别人细胞(HEK 293T)表达的重组CD25分子胞外段以及PHA活化的人外周血单核细胞(PBMC)，其亲和力大小为2.35×10^-10 M。其亲本抗体的I期临床研究表现出良好的安全性和耐受性。与其亲本抗体相比，其亲和力和特异性不仅得到保留，而且在人体内的免疫源性将大大降低，半衰期将显著延长，并能发挥抗体Fc区的生物学功能，因而更符合抗体药物应用于人体治疗的要求。

附图说明

附图1所示为采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列以及5'-UTR的琼脂糖凝胶电泳图，1、2分别为含有轻、重链可变区的片段。

附图2所示为采用重组DNA技术构建抗人CD25嵌合抗体重链和轻链基因的琼脂糖凝胶电泳图，3、6分别为完整重、轻链基因片段。

附图3所示为采用Protein A亲和柱从稳定转染含有完整重、轻链基因的CHO-DHFR^-细胞培养上清液中收获抗人CD25嵌合抗体的亲和层析图谱，1、2为目标抗体峰。

附图4所示为抗人CD25嵌合抗体的非还原和还原SDS-PAGE电泳图(图中2和4)，1、3为WuTac鼠单抗对照。

附图5所示为抗人CD25嵌合抗体特异性鉴定的WB和Dot blot图，1、9为WuTac阳性对照，4、12为daclizumab(Roche公司)对照，5、13以及6、14分别为纯化后和未纯化的抗人CD25嵌合抗体；WB结果中两条带分别为单体和双聚体CD25分子。

具体实施方式

一种重组抗人CD25嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，

重链可变区前5'-UTR序列为：

AAACCGCATATGATCAGTATCCTCTTCACAGTCACTGAAAACATTGACTCTAATC；

前导序列为：ATGGAATGTA ACTGGATACT TCCTTTTATT CTGTCGGTAACTTCAGGGGT CTACTCA；

HCDR1为：GGCTACAC CTTTACCAAG TACTGG；

HCDR2为：TTT TATCCTGGAA ATATTGATAC T；

HCDR3为：ACAAG AGACGGTGGT TACTATGCTG TGGACTAC。

其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，

轻链可变区前5'-UTR序列为：AGAGTAATTGAAGTCAAGACTCAGCCTGGAC；

前导序列为：ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCTGTTTTCAAGG TACCAGATGT；

HCDR1为：CA GGACATTAAC AATTATTTA；

HCDR2为：TACTAC ACATCAAGAT TACAC；

HCDR3为：CAACAG GGTAATACGC TTCCTCCGAC G。

其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中：

信号肽为：MET Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe IleLeu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr Ser；

HCDR1为：Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp；

HCDR2为：Phe Tyr Pro Gly Asn Ile Asp Thr；

HCDR3为：Thr Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ala Val Asp Tyr。

其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中：

信号肽为：MET MET Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly LeuLeu Leu Leu Cys Phe Gln Gly Thr Arg Cys；

HCDR1为：Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu；

HCDR2为：Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His；

HCDR3为：Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr。

在获得编码本发明重组抗人CD25嵌合抗体的重链可变区和轻链可变区后，采用下述方法克隆本发明的单克隆抗体：

步骤1：抗人CD25抗体可变区和信号肽序列以及5'-UTR的克隆

5'-Full RACE kit购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为D315；PrimeSTAR® HS DNA Poly-merase with GC Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DR044A；TRIzol为Invitrogen公司产品，货号为15596-026；pMD^®18-T克隆载体试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为D101B；Top 10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为CB104-02。

扩增含重链可变区核酸序列的引物：

(1) MGOuter：5'- ACCKYGGTSYTGCTKGCYGGGTG -3'；

(2) MGInner：5'- GCACACYRCTGGACAGGGATCCAG-3'。

扩增含轻链可变区核酸序列引物：

(3) MKOuter：5'- CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC-3'；

(4) MKInner：5'- GATACAGTTGGTGCAGCATCAGC -3'。

5′RACE Outer Primer：5'- CATGGCTACATGCTGACAGCCTA -3'；

5′RACE Inner Primer：5'- CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCA GTCGATG -3'。

收集5-10×10⁶个对数生长期的WuTac杂交瘤细胞，使用TRIzol法提取总mRNA。然后，分别对此mRNA进行去磷酸化处理和烟草酸焦磷酸酶(TAP)去掉5'帽子结构。在T4 RNA连接酶的作用下，将5'-RACE Adaptor连接在上述处理后的mRNA的5'端。继而使用逆转录酶合成cDNA后联合巢氏PCR和递减PCR法进行扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行鉴定。将所获得的目的大小的PCR片段纯化后与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞Top 10后挑取鉴定为阳性的克隆进行测序鉴定。

步骤2：抗人CD25嵌合抗体的构建

质粒pMD18-CH和pMD18-CK分别包含IgG1κ恒定区cDNA序列，其来源为前期采用PCR法从本人外周血中克隆出；质粒pcDNA3.3-stuff和pOptiVEC-stuff载体部分购自Invitrogen公司，本实验室在其克隆位点为别引入EcoR I和Xho I酶切位点并保存。

采用基因拼接法分别将抗体重、轻链可变区基因与抗体重、轻链恒定区进行拼接。纯化回收拼接后的基因片段后将其分别克隆至pcDNA3.3和pOptiVEC上，挑选阳性克隆进行测序鉴定。

步骤3：抗人CD25嵌合抗体稳定细胞株的构建

CHO-DHFR^-细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，资源编号为3115CNCB00292，由本实验室保存；IMDM培养基 (货号为12200-036)，Opti-MEM® Reduced Serum Medium (货号为31982-070)，透析FBS (货号为26400-036)，Geneticin® Selective Antibiotic (货号为10131-027，50 mg/mL)，Lipofectamine™ 2000 (货号为11668-019)， 0.25% Trypsin with EDTA 4Na (货号为25200-056) 均购自Invitrogen公司；HT media supplement [50×] (货号为H0137)为Sigma公司产品；其它细胞培养耗材购自Corning公司或Nunc公司。

常规传代培养CHO-DHFR^-细胞。使用pvu I酶切分别酶切质粒pcDNA3.3-VTacL和pOptiVEC-VTacH后纯化回收并采用脂质体法将其共稳定转染CHO-DHFR^-细胞。转染48小时后，使用含500 μg/mL Geneticin的无HT IMDM培养基进行筛选。约14天后采用有限稀释法进行克隆化筛选表达水平高的克隆。获得表达水平高的克隆后采用逐级提升MTX浓度的方法进行加压筛选，直至表达水平不再增高而细胞生长速度无明显减缓。扩大培养获得的稳定细胞克隆到一定细胞密度后，更换为无血清培养基。然后，使用Protein A亲和层析法从含有目的抗体的无血清培养上清液中纯化回收抗人CD25嵌合抗体。

步骤4：抗人CD25嵌合抗体的鉴定

以SDS-PAGE和WB分析CD25嵌合抗体的纯度、分子量和来源；以FCM、WB和Dot Blot来评估嵌合抗体的结合活性和特异性；使用IEF测定其等电点；采用质谱分析法来分析CD25嵌合抗体的肽质量指纹；使用Edman化学降解法测定其N端氨基酸序列；并使用生物分子相互作用仪来测定chTac和WuTac的平衡解离常数(KD)。结果表明：WB和FCM结果表明抗CD25嵌合抗体与亲本抗体一样能特异识别人CD25分子；IEF测定其等电点约为7.98；质谱分析法表明所获得的蛋白为目的抗体；N端测序表明与理论氨基酸序列完全一致且信号肽在预期的位点成功进行了剪切；生物分子相互作用仪测定抗人CD25嵌合抗体和亲本抗体的平衡解离常数(KD)分别为：2.35×10^-10 M和1.88×10^-10 M。结论：获得了具有自主知识产权且具备一定实用潜力的抗人CD25嵌合抗体。

Claims

1.一种重组抗人CD25嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种重组抗人CD25嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种DNA分子，编码了权利要求1或2所述的重组抗人CD25嵌合抗体。

4.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人CD25嵌合抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

5.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人CD25嵌合抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。