JP7101433B2 - エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、及びそれを製造する方法 - Google Patents

エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、及びそれを製造する方法 Download PDF

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Description

本開示は、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、及びそれを製造する方法に関する。より具体的には、アゴニストまたはアンタゴニストとしての機能が向上したバイパラトピック抗体に関する。
近年において、抗体を用いた医薬は、その標的特異性から非常に魅力的な分子標的医薬として研究がなされている。抗体治療薬は、標的の特定の部分（エピトープ）に結合する。抗体医薬の有用性は、抗体が結合する抗原の種類のみではなく、結合によるタンパク質機能の摂動は、その結合による相互作用がどこで生じるかに依存し、抗原におけるエピトープによって大きく変動する。したがって、抗体が結合するエピトープ領域は、抗体の機能を決める重要な因子であるといえる。
本発明者らは現在までに、ターゲット分子表面のすべての構造を「網羅的」に認識する多数の抗体の反応性プロファイルに基づき、各抗体の認識するエピトープ領域に分離し、ターゲット分子を網羅する各エピトープ領域に対しての抗体を含む、最小総数の抗体より構成される抗体パネルを選択し、その中から機能発現に重要なエピトープ領域を選別することで、抗原分子上のエピトープ領域を網羅して機能抗体を取得する技術であるエピトープ均質化抗体パネル（特許文献１）を開発している。この技術により、抗体の結合するエピトープ領域を同定する労力を減らし、抗体医薬の開発初期からそのエピトープ領域に関連付けられる機能の検討を可能にし、様々な機能を有する抗体の発見と開発に寄与してきた。
国際公開第２０１８／０９２９０７号
本開示ではこのエピトープ均質化抗体パネル技術をさらに発展させ、その機能・効果を最大化した抗体医薬品の創出を可能にし得るエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体作製技術を見出した。すなわち、本開示ではエピトープ均質化抗体パネル技術にさらにエピトープの位置情報を加えることにより、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体をパネルとして作製し、機能分子を探索、その機能メカニズムを明らかにし、これを通じて、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を合理的にデザインするための高度技術を開発した。
したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物であって、標的分子が結合することによって活性化する抗原における第１のエピトープに対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列と、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列とを含み、前記抗原との結合によって抗原：抗体が（ｍ×ｎ）：ｎの構造を有する複合体を形成し、ｎは１またはそれ以上の同一の数であり、ｍはパラトープに対する抗原結合ドメインの数の最大値である、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目２）前記第１のエピトープが前記抗原における複数のエピトープ領域から選択される第１のエピトープ領域に属し、前記第２のエピトープが前記第１のエピトープ領域とは異なる第２のエピトープ領域に属する、項目１に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目３）ｍが１である、項目１または２に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目４）前記抗原との結合によって抗原：抗体が１：１の分子内架橋構造を有する複合体を形成する、項目１～３のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目５）前記抗原との結合によって抗原：抗体がｎ：ｎ（ｎは２またはそれ以上の同一の数）の分子間架橋構造を有する複合体を形成する、項目１～３のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目６）前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに同じ側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、項目１～４のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目７）前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに異なる側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、項目１～３、及び５のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目８）前記抗原と結合するときに、前記抗原上の前記標的分子が結合する側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、項目１～４、及び６のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目９）前記抗原と結合するときに、前記抗原上の前記標的分子が結合する側に存在する前記第１のエピトープと、前記抗原上の前記標的分子が結合しない側に存在する前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、項目１～３、５、及び７のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１０）天然抗体と比較してアンタゴニスト活性が向上している、項目１～４、６、及び８のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１１）天然抗体と比較してアゴニスト活性が抑制されている、項目１～４、６、８、及び１０のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１２）前記抗原は膜タンパク質である、項目１～１１のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１３）前記抗原はＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属するいずれかの膜タンパク質である、項目１～１２のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１４）前記抗原はＴＮＦＲ２である、項目１～１３のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１５）ＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物であって、
（ａ）配列番号１（ＴＲ４５重鎖）、配列番号２（ＴＲ９２重鎖）、配列番号３（ＴＲ９４重鎖）、配列番号４（ＴＲ９６重鎖）、および配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）からなる群から選択される２つの重鎖可変領域のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号６（ＴＲ４５軽鎖）、配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）、配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）、配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）、および配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）からなる群から選択される２つの軽鎖可変領域であって、（ａ）の抗体重鎖と同一の抗体由来の軽鎖可変領域のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１６）（ａ）配列番号２（ＴＲ９２重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、あるいはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、あるいはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、項目１５に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１７）前記エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、
（ｉ）
（ａ１）配列番号１（ＴＲ４５重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３（ＴＲ９４重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ１）配列番号６（ＴＲ４５軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
（ｉｉ）
（ａ２）配列番号１（ＴＲ４５重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４（ＴＲ９６重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ２）配列番号６（ＴＲ４５軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
（ｉｉｉ）
（ａ３）配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４（ＴＲ９６重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ３）配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
（ｉｖ）
（ａ４）配列番号４（ＴＲ９６重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２（ＴＲ９２重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ４）配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
（ｖ）
（ａ５）配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３（ＴＲ９４重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ５）配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、または
（ｖｉ）
（ａ６）配列番号３（ＴＲ９４重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２（ＴＲ９２重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
（ｂ６）配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの機能的等価配列、またはそれらのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
である、項目１５に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目１８）エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を製造する方法であって、
（ａ）抗原に対する抗体の集合をオリジナル抗体パネルとして提供する工程であって、該抗体の集合に含まれる抗体数ｎは、該抗原に対する目標抗体数Ｎ以上である、工程と、
（ｂ）該オリジナル抗体パネルに含まれる抗体の結合データを得る工程と、
（ｃ）該結合データに基づいて、該オリジナル抗体パネルをクラスタリングする工程と、（ｄ）必要に応じて該オリジナル抗体パネルから、１または複数の抗体を除外して、１または複数の部分パネルを生成し、該１または複数の部分パネルの各々について、該結合データに基づいてクラスタリングする工程と、
（ｅ）該オリジナル抗体パネルおよび該１または複数の部分パネルのエピトープグループ数ｅを算出し、ｅ≧該抗原に関する目標エピトープグループ数Ｅを充足するオリジナル抗体パネルまたは部分パネルが存在する場合には、ｅ≧Ｅを充足するオリジナル抗体パネルまたは部分パネルをエピトープ均質化抗体パネルとし、ｅ≧Ｅを充足するオリジナル抗体パネルまたは部分パネルが存在しない場合、該オリジナル抗体または該部分パネルに新たな抗体を加えて新たな抗体の集合を作成し（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程と
（ｆ）前記得られたエピトープ均質化抗体パネルに包含される複数のエピトープのうち、２つのエピトープを選択する工程と、
（ｇ）前記２つのエピトープに結合する抗体のＦａｂ領域を連結する工程と、
を有する、方法。
（項目１９）前記工程（ｆ）は、前記２つのエピトープの位置が、前記抗原上の同じ側に存在するように選択するものである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）前記工程（ｆ）は、前記２つのエピトープの位置が、前記抗原上の反対側に存在するように選択するものである、項目１８に記載の方法。
（項目Ａ１）アゴニスト活性が完全に抑制された、上記項目のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目Ａ２）アゴニスト活性が向上した、上記項目のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目Ａ３）アゴニストとして機能するために必要なエピトープの組合せ、またはアンタゴニストとして機能するために必要なエピトープの組合せに対する、上記項目のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目Ａ４）抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製するための上記項目のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
（項目Ａ５）上記項目のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物から作製された抗体薬物複合体（ＡＤＣ）。
（項目Ｂ１）アゴニスト活性が完全に抑制されたエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を製造するための、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ２）アゴニスト活性が向上したエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を製造するための、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ３）アゴニストとして機能するために必要なエピトープの組合せ、またはアンタゴニストとして機能するために必要なエピトープの組合せに対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を製造するための、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製するためのエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を製造するための、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）上記項目のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を用いて、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製する方法。
本開示において、上記の一つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
図１は、本開示の一実施形態において抗ＴＮＦＲ２バイパラトピック抗体の作製に用いた５つのエピトープの位置を示す抗原－抗体複合体である。各複合体の右部分に位置する略球状のものがＴＮＦＲ２の天然リガンドであるＴＮＦαである。各複合体の左部分に位置する縦長の略棒状のものがＴＮＦＲ２である。それぞれ点線の円で囲った部分がエピトープである。 図２は、ＴＮＦＲ２の４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の存在部位を示す模式図と、本開示の一実施形態におけるエピトープ解析に用いた変異体の置換部位を示す模式図である。ＴＮＦＲ２は４つのＣＲＤを持っており、細胞膜から遠位の細胞外ドメインからＣＲＤ１、２、３、４とよばれている。図２の下部分に示したヒトＴＮＦＲ２のうち、黒く塗りつぶした部分がマウスオルソログ配列に置き換えられている。ＣＲＤ中にはジスルフィド結合により、３次元構造が保持されているモジュールとよばれる構造単位があり、抗体エピトープ領域のマウスオルソログ配列への置き換えは、このモジュール構造を大きく変化させないようにデザインされている。 図３は、５つのモノクローナル抗体（ＴＲ４５、ＴＲ９２、ＴＲ９４、ＴＲ９６、ＴＲ１０９）と、図２で作製した各変異体との反応性を示すフローサイトメーター（ＦＣＭ）の解析結果である。各ＴＮＦＲ２変異体は、各変異体をコードする発現プラスミドベクターを一過性発現させることにより、２９３Ｔ細胞上へ発現させた。これらの発現ベクターでは、ＴＮＦＲ２変異体と同じｍＲＮＡ上でＩＲＥＳを介してＴａｇＢＦＰを発現するようにデザインされており、ＴａｇＢＦＰ蛍光として抗原の発現レベルをモニターできる（図の縦軸）。また抗体の結合はＰＥラベルの２次抗体で検出し、ＴａｇＢＦＰと異なる蛍光Ｃｈａｎｎｅｌで検出しており（図の横軸）、得られた結果はＢＦＰ対ＰＥの２Ｄでプロットできる。抗体が特異的に結合する場合には、結合レベルは、抗原の発現レベルと相関し、右肩上がりのドット分布が確認できる。一方、太枠で囲った抗原－変異体の組み合わせでは結合喪失がみられ、細枠で囲ったものは結合減弱がみられた。これらの変異体に対する抗体の反応性の消失は、各変異体で、各抗体の認識するエピト－プ構造が変化していることを示しており、この消失パターンからエピトープの構造上の位置を特定した。 図４は、図３のＦＣＭによる抗原－抗体結合性解析結果を、各変異体の置換部位と関連付けて表した模式図である。いずれの配列においても、黒く塗りつぶした部分がマウスオルソログ配列に置き換えられている。符号－で示した箇所は、抗体との結合喪失がみられたものであり、符号±で示した箇所は、抗体との結合減弱がみられたものである。 図５は、本開示の一実施形態におけるレポーターアッセイの結果である。１０個のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体および５個のモノクローナル抗体を用いて、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を吸光度で測定した結果を棒グラフで示した。アゴニスト活性は、ＴＮＦＲ２を発現させたＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅレポーター細胞を用い、各抗体刺激により誘導されるＮＦｋＢ依存性シグナルをレポータータンパク質の分泌性アルカリフォスファターゼの発現として、ＰＮＰＰ基質を用いて検出した。アンタゴニスト活性は、ＴＮＦＲ２およびＴＮＦＲ１を発現しているＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅレポーター細胞を、各抗体の存在下でＴＮＦαで刺激し、誘導されるＮＦｋＢ依存性シグナルを検出した。各抗体の濃度は、いずれも０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、及び１００ｎＭとした。濃い矢印で示した抗体は強いアゴニストまたはアンタゴニスト、薄い矢印で示した抗体は中程度のアゴニストまたはアンタゴニスト、白抜きの矢印で示した抗体は弱いアゴニストまたはアンタゴニストである。 図６は、本開示の一実施形態におけるエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体およびモノクローナル抗体のＴＮＦＲ２強制発現細胞への結合能を評価したＦＣＭ解析結果である。各抗体の濃度は、いずれも０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、及び１０００００ｎｇ／ｍＬとした。縦軸は各抗体の結合を、ＰＥラベルの２次抗体で検出し、Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙとして示した。 図７は、本開示の一実施形態におけるエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体およびモノクローナル抗体のＴＮＦＲ２単量体抗原およびＴＮＦＲ２二量体抗原へのそれぞれの結合能を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で評価した結果である。黒丸（●）で示したものがバイパラトピック抗体と二量体抗原との結合、黒四角（■）で示したものがエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体と単量体抗原との結合、黒三角（▲）で示したものがモノクローナル抗体と二量体抗原との結合、及び×で示したものがモノクローナル抗体と単量体抗原との結合である。いずれも上に位置するほど結合が速く、左に位置するほど解離が遅いことを示すため、左上に位置するほど親和性が高いことを示す。 図８は、本開示の一実施形態におけるＴＮＦＲ２単量体抗原およびＴＮＦＲ２二量体抗原の作製手順を示す模式図である。エタネルセプトを酵素で消化することにより二量体を得て、さらにその二量体を還元再酸化反応に供することによって単量体を得た。 図９は、図５、図６、図７に示した、各抗体のアゴニスト活性、アンタゴニスト活性、ＴＮＦＲ２強制発現細胞へのＦＣＭによる結合活性、並びにＳＰＲによる単量体抗原および二量体抗原への結合活性のそれぞれについて、抗体ごとにまとめたグラフである。抗体間の比較評価が可能である。 図１０は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）とを接続し、各抗原－抗体複合体の態様を調べた結果である。上段がＢｐ１０９－９２（左パネル：抗原あり、右パネル：抗原なし）、下段がＴＲ１０９（左パネル：抗原あり、右パネル：抗原なし）の結果である。いずれも抗原ありの場合には溶出するピークが２つあり、先に溶出する抗原－抗体複合体と、後に溶出する抗原のみのそれぞれの分子量を示している。各々の溶出位置から、分子量が算出できるので、抗原－抗体複合体における抗原と抗体の分子数比が推定できる。算出された抗体と抗原の結合比を各図の下に示した。 図１１は、Ｂｐ１０９－９２、Ｂｐ９４－９６、Ｂｐ４５－９６、及びＢｐ９４－９２についてのＳＥＣ－ＭＡＬＳの解析結果である。いずれも８当量または０．２５当量のＴＮＦＲ２抗原を添加している。上段および下段のそれぞれ中央に示す模式図は、非アゴニストおよびアゴニストのそれぞれの場合の結合様式を示す。 図１２は、本開示の一実施形態において、アゴニストとなる６個のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体（Ｂｐ４５－９６、Ｂｐ９４－９２、Ｂｐ１０９－９６、Ｂｐ１０９－９４、Ｂｐ４５－９４、及びＢｐ９６－９２）が結合する２つのエピトープ位置の組み合わせを示す模式図である。複合体の右部分に位置する略球状のものがＴＮＦＲ２の天然リガンドであるＴＮＦαである。複合体の左部分に位置する縦長の略棒状のものがＴＮＦＲ２である。いずれもＴＮＦＲ２表面において、それぞれのエピトープ位置は反対側に存在している。 図１３は、本開示の一実施形態において、アゴニストとならない４個のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体（Ｂｐ９６－９４、Ｂｐ１０９－９２、Ｂｐ１０９－４５、Ｂｐ４５－９２）が結合する２つのエピトープ位置の組み合わせを示す模式図である。複合体の右部分に位置する略球状のものがＴＮＦＲ２の天然リガンドであるＴＮＦαである。複合体の左部分に位置する縦長の略棒状のものがＴＮＦＲ２である。いずれもＴＮＦＲ２表面において、それぞれのエピトープ位置は同じ側に存在している。 図１４は、本開示の一実施形態に係るエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の作製に用いたエピトープおよびそのエピトープが属するエピトープ群を示す抗体パネルである。 図１５は、本開示の一実施形態に係るエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体のＴＮＦＲ２依存性細胞内在化能を比較したグラフである。各抗体の濃度は、いずれも１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬとした。吸光度の低下は細胞傷害性が起きていることを示し、よって抗体内在化が生じていることを示す。 図１６は、本開示の一実施形態に係るエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置が、「同じ側」にあるのか、または「反対側」にあるのかを判定するための模式図の作製法を例示した図であるである。 図１７は、本開示の一実施形態に係るエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置が、「同じ側」にあるのか、または「反対側」にあるのかを判定するための模式図である。例えば、ＴＲ９４とＴＲ９６またはＴＲ１０９とＴＲ９２を用いてエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製した場合には、投影図におけるベクトル間のなす角度が９０°未満であるため、「同じ側」と判定することができる。一方、例えばＴＲ９４とＴＲ１０９またはＴＲ９２とＴＲ９６を用いてエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製した場合には、投影図におけるベクトル間のなす角度が９０°以上であるため、「反対側」と判定することができる。 図１８は、本開示の一実施形態に係るエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製する際のＣ側およびＮ側を示す模式図である。材料となる抗体について、Ｆｃ領域をもつＦａｂ領域をＣ側、Ｆｃ領域をもたないＦａｂ領域をＮ側としてバイパラトピック抗体を作製した場合に、作製されたバイパラトピック抗体においては、元のＦｃ領域をもつＦａｂ領域をＣ側、Ｆｃ領域をもたないＦａｂ領域をＮ側と呼ぶことができる。
以下に、本開示に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。したがって、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
本明細書において、「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上の部分を指す。エピトープは、抗原の特定の一部分であり、抗原がタンパク質またはポリペプチドの場合には、その抗原のアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基、またはその範囲として表現することができる。または、エピトープを構成するアミノ酸に含まれる一部の原子の集合としても表現できる。エピトープは数個～十数個からなるアミノ酸配列等の、抗原分子全体より小さい領域でありうることが理解される。
本明細書において、「パラトープ」とは、抗体のＦｖに由来し、抗原の１つのエピトープと特異的に結合するための構造をいう。天然ＩｇＧ型抗体は、１分子中に同一のパラトープ（Ｆｖ）を２つ含み、抗体としては２価であるがパラトープの数は１つ（１種類）である。
本明細書において、「抗原結合部位」とは、各抗体分子が、抗原標的に結合するためのパラトープを１つ含む構造をいう。天然ＩｇＧ型抗体は、パラトープは１つ（１種類）であるが、１分子中に同一のパラトープを含む抗原結合部位を２つ有しているため、２価となる。
本明細書において、「バイパラトピック抗体」（ＢｐＡｂ）とは、抗原標的に対する２つの異なる抗体に由来し、それぞれ固有のエピトープに特異結合能を示す２種類のパラトープを有し、この２種類のパラトープをそれぞれ単独で認識する抗原結合ドメインを、各パラトープにつき各々１つ以上一分子中に有する人工抗体をいう。バイパラトピック抗体は抗原上の異なる２つのエピトープに結合できる。
本明細書において、「エピトープ領域」とは、あるエピトープに対する抗体と、同じエピトープ領域に属する別のエピトープに対する他の抗体とが、同時には結合できないような、抗原上のエピトープが存在し得る部分の全体を指し、抗原がタンパク質またはポリペプチドである場合は、アミノ酸の位置の範囲またはそれらのアミノ酸に含まれる一部の原子の集合として示すことができる。すなわち、あるエピトープ領域に属するエピトープに対するある抗体と、同一のエピトープ領域に属するエピトープに対する別の抗体とは同時に抗原に結合せず、または互いの抗原への結合を阻害する場合もある。エピトープ領域は、実験的に結合アッセイを用いて定められるが、結合のシミュレーションによって推定することができる。また、本明細書において、「エピトープ群」とは、上記のような同一のエピトープ領域に属する１または複数のエピトープの集合をいい、同一のエピトープ群に属するエピトープに結合する抗体は同様の反応性プロファイルを示すこととなる。
本明細書において、エピトープ均質化抗体パネル法によって同定される異なるエピトープ領域に結合する２つの抗体由来の、２つの異なるパラトープを有するバイパラトピック抗体を、「エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体（Ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｇｉｏｎ－ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＥＲＢＢＡ）」という。エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、分子内または分子間でエピトープを橋渡しして、多様な免疫複合体を形成することができる。例えば、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が単一の抗原分子上の異なる２つのエピトープに結合する場合には、分子内架橋構造を有する免疫複合体を形成する。またエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が２つの抗原分子上のそれぞれのエピトープに結合する場合には、分子間架橋構造を有する免疫複合体を形成する。
本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を発現またはそれを増強する物質をいう。天然のアゴニスト（リガンドとも称される）のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。抗体がアゴニスト活性を有する場合「アゴニスト抗体」という。
本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用の発現を抑制または阻害する物質をいう。天然のアンタゴニストのほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。アゴニスト（またはリガンド）と競合的に抑制または阻害するもののほか、非競合的に抑制または阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を抑制または阻害することから、アンタゴニストは抑制剤（阻害剤）または抑制（する）因子の概念に包含され得る。抗体がアンタゴニスト活性を有する場合、「アンタゴニスト抗体」という。
本明細書において「生物学的作用」とは、ある分子が本来有する作用、効果、または機能をいい、またはその作用の結果、生体に生じる活動または変化を指すこともある。生物学的効果、生物効果、または生物作用と同義であり、例えば抗体であれば上記のようなアゴニスト活性やアンタゴニスト活性が含まれ、酵素であればその触媒する化学反応の抑制効果や促進効果も含まれる。
本明細書において、「オルソログマッピング」とは、抗原が由来する動物（例えばヒト）と異なる他の動物種（例えばマウス）において、抗原と同一の祖先遺伝子を有する分子（すなわち、オルソログ）から抗原の類似構造を抽出し、変異体作製に用いる手法をいう。オルソログは異種動物の中で、抗原と類似の生体機能を示すことから明らかなように、機能を有するコンフォーメショナル構造が保証された分子であるため、オルソログマッピングにより抗原変異体を作製した場合には、分子全体の構造が壊れる可能性が通常のオルソログを考慮しない変異体作製方法に比べて著しく低くなる。結果として、オルソログマッピングで用いる変異体は分子全体として、正しいコンフォメーション構造を提示している可能性が高いためデータの信頼性を増すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、長さがｎの全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、１～ｎ－１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本開示の範囲内に入ることが理解される。
本明細書において「機能的等価配列」とは、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＴＮＦＲ２または本開示のバイパラトピック抗体のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。
したがって、「エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはそのフラグメント」の「機能的等価物」には、例えば、抗体の場合、ＴＮＦＲ２の結合活性、必要であれば抑制活性を有する抗体自体およびそのフラグメント自体のほか、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃなども包含されることが理解される。またこのような「機能的等価物」は、「バイパラトピック抗体、またはそのフラグメント」が結合するエピトープと同じエピトープに結合することができる。
本開示において「活性」とは、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
本明細書において、活性の「減少」、「減弱」、または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。減少のうち「喪失」した場合は、活性、発現産物等が検出限界未満になることをいう。本明細書では、「喪失」は「減少」または「抑制」に包含される。
本明細書において、活性の「増加」、「増強」、または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。本明細書において、「活性化」という語句は、活性、発現産物等が検出限界未満であった状態より、活性、発現産物等が検出限界以上になる状態も含まれる。
本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物は、ある標的（例えば、ＴＮＦＲ２など）に対してこのような抑制または活性化の機能を有し得る。
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体
以下に、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体について説明する。本開示の一実施形態において、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物であって、標的分子が結合することによって活性化する抗原における複数のエピトープ領域群の、各々のエピトープ領域に含まれるエピトープ群から選択される第１のエピトープ群に属する第１のエピトープと、前記第１のエピトープ群が含まれるエピトープ領域とは異なるエピトープ領域に含まれる第２のエピトープ群に属する第２のエピトープとに対して抗原特異性を有し、前記抗体は、前記第１のエピトープに対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列と、前記第２のエピトープに対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列とを含む、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物が提供される。
したがって、本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が１つのパラトープに対してｍ個（ｍはパラトープに対する抗原結合ドメインの数の最大値）の抗原結合ドメインを有する場合には、抗原と結合することにより、抗原：抗体がｍ×ｎ：ｎ（ｎは１またはそれ以上の同一の数）の構造を有する複合体を形成することが好ましい。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が１つのパラトープに対して１つの抗原結合ドメインを有する場合には、抗原と結合することにより、抗原：抗体がｎ：ｎ（ｎは１またはそれ以上の同一の数）の構造を有する複合体を形成することが好ましい。モノクローナル（モノパラトピック）抗体は特定のタンパク質を標的とし、単一の抗原エピトープに特異性を有する抗体であるため、抗原と結合した場合には、抗原：抗体が２：１の免疫複合体を形成する。一方で、バイパラトピック抗体は単一種類の１またはそれ以上の抗原上の異なる２つのエピトープに結合できるため、単一の抗原分子上の異なる２つのエピトープに結合して分子内架橋構造を有する免疫複合体を形成する場合には、抗原：抗体が１：１となる。また２つの抗原分子上のそれぞれのエピトープに結合する場合には、抗原：抗体がｎ：ｎ（ｎは２以上の同一の数）となる。本開示の一実施形態において、好ましくは抗原：抗体が１：１であり、分子内架橋構造を有する免疫複合体を形成する。また、分子間架橋構造を有する免疫複合体を形成する場合には、好ましくは抗原：抗体が２：２、３：３、４：４、５：５、６：６、または７：７であり、本開示のバイパラトピック抗体として機能し得る限りｎは限られるものではなく、また整数に限られるものでもないが、個別に数を数える場合には整数として数えることもできる。
本開示の他の実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、１つのパラトープに対して２つ以上の抗原結合ドメインを有し、かつ２つのパラトープに対応する抗原結合ドメインの数が同一である場合、すなわち、２つの異なる可変領域が２つずつ、あるいは３つずつあるような構造、たとえばＩｇＧ－ｓｃＦｖやＤＶＤ－Ｉｇなどのような構造とすることもできる。このような場合には、それぞれの抗原結合ドメインの数をｍとして、本開示のバイパラトピック抗体は、抗原と結合することにより、抗原：抗体が（ｍ×ｎ）：ｎ（ｎは１以上の同一の数）の構造を有する複合体を形成することができる。例えば、２つの可変領域が２つずつある４価抗体の場合には、抗原：抗体＝２：１、４：２、６：３などとすることもできる。また、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が、２つのパラトープに対して異なる数（つまり、２以外）の抗原結合ドメインを有する場合には、その数が多い方について、その数をｍ（つまり、各パラトープに対する抗原結合ドメインの数の最大値）として、上記の例と同様に、抗原と結合することにより、抗原：抗体が（ｍ×ｎ）：ｎの構造を有する複合体を形成することができる。例えば、２つの可変領域が２つずつある４価抗体の場合には、抗原：抗体＝２：１、４：２、６：３などとすることもできる。なお、ｈｅｔｅｒｏ－Ｆｃ ＩｇＧ型、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ型などの場合には、ｍ＝１となるため、上記のような抗原：抗体がｎ：ｎ（ｎは１またはそれ以上の同一の数）の構造を有する複合体を形成することとなる。
理論に束縛されることを望まないが、本開示の一つの好ましい実施形態において、２つの可変領域を１つずつもつバイパラトピック抗体で１：１の複合体が得られることが一つの重要な点であり、その構造の複合体が、抗体が抗原２分子間を架橋するような複合体とは異なる性質を示し、好ましくは分子間架橋に由来する、望まない活性を喪失させることができることが重要であり得る。本開示の一つの好ましい実施形態において、完全にアゴニズムを有意に減少ないし喪失させることができることが重要であり得る。一実施形態において、例えば抗体をＡＤＣとして用いる場合、アゴニスト活性の完全抑制は有用であり得る。例えば、がん増殖を促進するシグナルを介在するレセプターに対する抗体は、がん細胞を増殖させてしまうが、本開示の方法によって得られる完全にアゴニスト活性が抑制されたバイパラトピック抗体であれば、ＡＤＣ化した場合にも安全であり、抗腫瘍効果を期待できる。また抗体医薬は投与量が多く、半減期も長いため、弱いアゴニスト活性であったとしてもその危険性を排除できないものの、本開示の方法によって得られるバイパラトピック抗体であれば、完全にアゴニスト活性を抑制することができるため有用である。
本開示の一実施形態において、抗原－抗体複合体の分子量サイズおよび分子形状は、本分野で公知の種々の分子量および／または分子形状の測定法によって測定することができる。例えばサイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）は、静的光散乱法による粒径解析を行うことができ、より絶対的な分子量や、分子形状に関する情報も得ることができる。分子量は数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、またはピーク分子量（Ｍｐ）のいずれであってもよい。またこれらの分子量はサイズ排除クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技法、静的光散乱法、超遠心法を用いて測定することもできる。また本開示の一実施形態において、抗原－抗体複合体の分子形状は電子顕微鏡を用いて撮影することもできる。
本開示の一実施形態において、標的分子が結合することによって活性化する抗原としては、神経伝達物質、ホルモン、または細胞増殖因子などの物質（リガンド）を結合することによって細胞の反応を開始させる受容体や、生体内における化学反応に対して触媒として機能する酵素などが挙げられる。本開示の一実施形態において、受容体が抗原となる場合には、活性の種類の限定を意図するものではないが、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原である受容体に結合することにより、その受容体の本来の生物学的作用を発現または増強するアゴニスト活性を有するか、またはその受容体の生物学的作用の発現を抑制または阻害するアンタゴニスト活性を有する。本開示の一実施形態において、酵素が抗原となる場合には、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、その酵素が本来触媒する化学反応を抑制または阻害するものであることが好ましい。あるいは、本開示の一実施形態において、酵素が抗原となる場合には、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、その酵素が本来触媒する化学反応を促進または増強することもできる。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が結合する２つのエピトープは、それぞれ異なるエピトープ領域を認識するエピトープ群に属する。
本開示の一実施形態において、アンタゴニストとなる本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、少なくとも一方の可変領域が、結合する抗体がアンタゴニストとなるエピトープ群に結合する抗体由来のものである。他方、アゴニストとなる本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、結合する２つのエピトープ間の相対位置関係に依存し、各エピトープに結合する元の抗体がアゴニストであるかどうかには実質的に影響されない。例えば、本開示の一実施形態において、あるバイパラトピック抗体の結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置が、当該抗原上の反対側に存在する場合、当該バイパラトピック抗体はアゴニストとなる。他方、あるバイパラトピック抗体の結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置が、当該抗原上の同じ側に存在する場合、当該バイパラトピック抗体はアゴニストとならないか、または２つの異なるパラトープをそれぞれ１つずつ有するバイパラトピック抗体においては、有意にアゴニズムを小さくすることができる。
ここで、あるバイパラトピック抗体の結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置が「反対側」または「同じ側」にあるようにすることにより、バイパラトピック抗体が結合する抗原上における２ヶ所のエピトープ位置と、抗体の２つの可変領域との相対的な関係を制御し、所望の結合様式を実現し得る。例えば、２ヶ所のエピトープ位置として抗原上の「同じ側」に存在するものを選択することにより、単一の抗体の２つの可変領域が、単一の抗原上の当該２ヶ所のエピトープに結合できるようにし得る。一方、２ヶ所のエピトープ位置が抗原上の「反対側」に存在する場合には、単一の抗体の２つの可変領域が、２つの抗原上のそれぞれ１ヶ所ずつ計２ヶ所のエピトープ（つまり、一方のエピトープは抗原Ａ１に存在し、他方のエピトープは抗原Ａ２に存在し、抗原Ａ１とＡ２は同一種類の抗原である場合）に結合できるようにすることができる。本開示の一実施形態において、バイパラトピック抗体が結合する抗原上における２ヶ所のエピトープの選択に際して、その２ヶ所のエピトープの位置が距離的にどの程度離れているか、またはどの程度近いのかといった要素を考慮することもできる。
例えば、本開示の一実施形態において、「同じ側」または「反対側」としては、ＴＮＦＲ２抗原分子の立体構造から、４つのＣＲＤドメインに属する全ての原子を任意の平面上に投影した際に、投影図を全て含む最小の円を定義することでも判定することができる。この場合には、その円の面積が最小となるような投影図を選択する。この投影図から、エピトープの方向を以下の手順によって決定する。まず、各変異体で、オルソログ由来のアミノ酸配列に置き換えた領域に含まれる全ての原子について、それぞれの原子が最近接する円周上の点Ｂを求める（円は上述の定義による）。次に円周上の点Ｘを抗体ごとに定義し、弧ＢＸ間の長さを計算する。この時、抗体ごとに、反応性喪失が見られた変異体由来の弧ＢＸの長さには2倍の重み付けを行い、反応性減弱が見られた変異体由来の弧ＢＸの
長さには１倍の重み付けを行う（すなわち図４で「－」となっている領域に由来する点Ｂにおける弧ＢＸの長さを×２、「±」となっている領域に由来する点Ｂにおける弧ＢＸの長さを×１とする）。変異体における反応性減弱が見られなかった領域に由来する点Ｂにおける弧ＢＸの長さは０とする。また各変異体でオルソログ由来のアミノ酸配列に置き換えた領域に相当する天然型ＴＮＦＲ２抗原におけるアミノ酸残基がArg,Tyr, Phe, Trpである場合は、そのアミノ酸に属する原子由来の弧ＢＸの長さは２倍に、他のアミノ酸に属する原子由来の弧ＢＸの長さは１．５倍に重みづける。すべてのＢにおける弧ＢＸの総和が最小となるような点Ｘを、その特定の抗体のエピトープの中心点Ａとする。このようにして各抗体について定義されたエピトープの中心点Ａと先に定義された最小の円の中心Ｏを通るベクトルＯＡをエピトープごとに得る（図１６）。２つのエピトープについてのベクトルの内積が正の値となった場合、すなわちＴＮＦＲ２抗原を円筒に見立てると、その円筒の底面から見た場合に、投影図におけるベクトル間のなす角度が９０°未満であれば、２つのエピトープが「同じ側」にあると判定する。ベクトルの内積が０または負の値となった場合は「反対側」にあると判定することもできる（図１７）。
本開示の一実施形態において、２ヶ所のエピトープの位置またはそのエピトープが属する２つのエピトープ領域が距離的に近い場合、２ヶ所のエピトープ位置として抗原上の「同じ側」に存在するものを選択したとしても、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の２ヶ所の可変領域が競合して同時結合を阻害してしまい、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が単一の抗原上に結合することができなくなる。この場合は、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置が「同じ側」にあるように選択した効果を得ることができない。また他の実施形態において、２ヶ所のエピトープ位置として抗原上の「同じ側」に存在するものを選択したい場合には、このようにバイパラトピック抗体分子に配置した場合、競合阻害を生じ得るエピトープに対する抗体可変領域の組み合わせを除外することもできる。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原に対して、抗原の本来の標的分子（例えば天然リガンド）が結合する側に存在する２つのエピトープに結合することができる。すなわち、このような場合には、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置は当該抗原上の同じ側に存在することとなる。他方、本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原に対して、抗原の本来の標的分子が結合する側に存在する第１のエピトープと、標的分子が結合しない側に存在する第２のエピトープとに結合することもできる。すなわち、このような場合には、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が結合する抗原上の２ヶ所のエピトープ位置は当該抗原上の、リガンド結合部位とは反対側に存在することとなる。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、その元となるモノクローナル抗体と比べて、アゴニスト活性が増強しているものである。上記のとおり、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体において、その元となるモノクローナル抗体が結合する２つのエピトープ位置が、お互いに抗原上の反対側に存在する場合、そのエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体はアゴニスト抗体となり、この場合、そのアゴニスト活性は元のモノクローナル抗体におけるアゴニスト活性よりも顕著に増強することができる。
天然のモノクローナル抗体の場合、アゴニスト活性とアンタゴニスト活性の両方の活性を保持している。例えば、図５に示したＴＮＦＲ２に対するモノクローナル抗体（ＴＲ９２、ＴＲ１０９、ＴＲ４５、ＴＲ９４、及びＴＲ９６）のうち、ＴＲ１０９は強いアンタゴニスト活性を有する一方で、中程度のアゴニスト活性をも保持している。このように、天然のモノクローナル抗体の場合、「ある抗体がアンタゴニストであり、同時にアゴニストでもある」ことが生じ、両活性のバランスで複雑な挙動を示すこともある。本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、アゴニストまたはアンタゴニストとしての性質を持たないようにすることができる。そのため、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、例えばアゴニスト活性が抑制され、アンタゴニスト活性が顕著に増強した抗体とすることができる。
また本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原が有する本来の生物学的作用を増強し、または抑制することができるため、例えば抗原が酵素となる場合には、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、その酵素が本来触媒する化学反応を完全に抑制または阻害することもできる。
エピトープ均質化抗体パネルの作製方法
本明細書に記載のエピトープ均質化抗体パネルについて、本開示に用いるものとしては、ＷＯ２０１７／１４３８３８に記載されているもののほか、その記載に基づき以下の改良を加えてもよい。例えば、抗原の配列解析に基づき、抗体結合機能に必要な抗原の高次構造を保持する単位で、抗原の全長配列をクラスター化する。次に、オルソログ、パラログ等の抗原ホモログの配列で各クラスターを置換することにより、論理的にエピトープ領域を網羅するように、限られた数の部分変異抗原シリーズを作製する。各抗体の各変異体に対する結合強度の変化を、親和性損失の程度として定量化し、ＷＯ２０１７／１４３８３８に記載されている「エピトープ均質化抗体パネル」技術と同じように各抗体の親和性を標準化したパラメータを得る。ここでは、親和性でなくエピトープ位置だけを反映する情報を得るために利用されるものである。得られた反応性のプロファイルを様々な解像度でグルーピングする。これを用いて、ＷＯ２０１７／１４３８３８に記載されている「エピトープ均質化抗体パネル」と同じように機能エピトープの単位で解像度を設定することで、位置情報を含んだ「エピトープ均質化抗体パネル」とすることができる。
このように、本開示で用いられる「エピトープ均質化抗体パネル」としては、位置情報を含んだものを用いてもよく、このパネルの製造法は、本開示の一部を構成することが理解される。
まず抗原の配列解析に基づき、抗体結合機能に必要な抗原の高次構造を保持する単位で、抗原の全長配列をクラスター化する。次に、オルソログ、パラログ等の抗原ホモログの配列で各クラスターを置換することにより、論理的にエピトープ領域を網羅するように、限られた数の部分変異抗原シリーズを作製する。各抗体の各変異体に対する結合強度の変化を、親和性減弱の程度として定量化することで各抗体の親和性を標準化したエピトープ位置に関するパラメータを得る。得られた反応性のプロファイルを様々な解像度でグルーピングすることで、「エピトープ均質化抗体パネル」に位置情報を加えることができる。
一つの具体的な実施形態では、本明細書に記載のエピトープ均質化抗体パネルにおいて本明細書に記載されるようなオルソログマッピングを用いる場合、親和性喪失の程度はマウスオルソルグでドメインサイズの変異体を使うと、すべての抗体でほぼ１か０となり明確に確認することができる。パネル抗体のエピトープ領域の区分と、各抗体の変異体への親和性減弱のパターンは一致する。例えば、本明細書に記載のエピトープ均質化抗体パネルから抗体を選択する際には、高親和性や抗体分子の安定性が高いなどの物質としての利点を有するもの、またはヒト化を行っている、Ｆｖ配列が他に先行して先行して決定されているなどの基準により、リファレンス抗体として選択し、その抗体を本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の材料とすることができる。この場合、エピトープ均質化抗体パネルにおける抗体は、すべてのエピトープ領域の位置が適切に分散し、ある程度の距離を開けて存在すれば、それらのパラトープを利用してエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製した場合に新しい相互作用を創出し得ることが予想することができるため、望ましい。
また本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の設計に際しては、その結合対象となる抗原の高次構造が判明しているか、またはある精度で推定できることが好ましい。また本開示の一実施形態において、抗原のエピトープの位置情報として、その「方向」（例えば、本明細書において記載される「同じ側」や「反対側」）や距離情報が得られることが好ましい。
本開示の一実施形態において、オルソログマッピングを用いる場合、ホモログ（オルソログとパラログ）マッピング法の一部で、オルソログの全長を使うこともできる。または他の実施形態において、変異体の由来するオルソログに対して、測定しようとする抗体の結合性がない場合、かつ抗原のドメイン構造がはっきりしている場合には、抗原性のない免疫ホストのオルソログ（すなわちマウスオルソログ）を部分交換用に用いることもできる。この場合には、すべての抗体がマウスオルソログに対して結合性を示さないこととなる。
本明細書に記載のエピトープ均質化抗体パネルについて、本開示に用いることができるものとしては、抗体群に特有の逐次結合パターンを指標に、標的上の多数のエピトープ領域を均質に認識する複数の抗体から構成される抗体パネルを用いることができる。この認識エピトープ領域が均質化された抗体群を用いれば、抗原の抗体による機能発現の可能性を漏れなく効率的に調べることができる。この場合、抗原結合部位の位置情報が得られず、また抗体間のペア逐次アッセイが必須となるが、ホモログマッピングを用いることにより、この問題点が解決されることが理解される。すなわち、抗体相互間のペア逐次アッセイ反応値の代わりに、新たに抗原のオルソログ（抗原と共通祖先の遺伝子から種分化によって生じた異なる生物に存在する相同な機能を持つ遺伝子群）やパラログ（抗原と共通祖先の遺伝子から進化によって派生し、抗原が由来する生物に、別個分子として存在するようになった相同な構造を持つ遺伝子群）への各抗体の反応性データを取得し、それらを各抗体特性値として用いて、エピトープの均質化パネルを作製することができる。このように、本開示の一実施形態においては、従来のエピトープ均質化抗体パネル法を改良することができ、このような改良されたエピトープ均質化抗体パネル法もまた、本開示の範囲内にある。理論に束縛されることを望まないが、エピトープ均質化抗体パネル法のこのような改良によれば、逐次結合アッセイが必要なく、抗体の反応性データのみで抗体パネルを完成させることができ、エピトープ領域の抗原構造上の位置の推定もすることができるという利点をもつ。
抗体を開発する場合、動物実験を行うため、交差反応性を示すかトポロジー的に同じエピトープ領域に結合するサロゲート抗体が必要になる場合が多く、本明細書において例示されるようなオルソログマッピングは有用である。本開示の一実施形態において、エピトープ均質化パネルを作製するための反応値を得るには、ホモログの全長を用いることができる。オルソログやパラログを用いることにより、抗原の正常なコンフォメーションを保証し、同時に複数箇所の変異が入っている変異体を用いることにより、エピトープの均質化を判定するために、必要な変異体個数が実用的なレベルまで少なくすることができる。ホモログへの反応性で得られるパラメータはすぐに位置情報と結びつけることはできないことが理解される。例えば、抗原にＡ－Ｂ－Ｃ－Ｄというエピトープ領域があり、マウスのオルソログにはＡ－ｂ－Ｃ－ｄという領域がある場合、反応性の異なる領域（Ｂ≠ｂ、Ｄ≠ｄ）を検出できるが、それだけでは位置情報はわからない。そのため、まずクラスタリングに用いる推定値を得るために、ホモログでの変異の頻度と場所の変化の範囲を規定する必要がある。そこで本開示の一実施形態においては、抗体と各変異体の結合性について、野生型抗原と、変異体抗原との比を考慮した親和性ロスの概念を導入することで、エピトープの位置情報を得ることができる。
本開示の一実施形態において、バイパラトピック抗体は、種々の手法によって作製可能であり、例えばＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７， ８３６０ （２０１７）や国際公開第２０１７／１４３８３号に記載の手法などで作製することができる。この手法では、スプリットインテインのタンパク質トランススプライシング反応により抗体のヒンジ領域（重鎖／重鎖および軽鎖／重鎖を連結する４つのジスルフィド結合）に２つの親抗体フラグメントを組み入れ、重鎖／重鎖および軽鎖／重鎖の誤対合のないバイパラトピック抗体を作製することができる。この手法では、バクテリアタンパク質であるＤｎａＥが有するペプチド鎖組換え配列であるインテインを利用することにより、産物に組み換えタグが残ることなく、そのまま使える抗体を作製することができる。
バイパラトピック抗体は２つの抗体のＦａｂ領域を連結して作製するものであるため、Ｆｃ領域はいずれか一方の抗体由来のものとなり、リンカー部分が非対称となる。本開示の一実施形態において、本開示のバイパラトピック抗体では、Ｆｃ領域はいずれの抗体由来のものとしてもよい。そのため、元の２つの抗体のいずれがＮ側であってもＣ側であってもよく、Ｎ側とＣ側を入れ替えたとしても、同じ性質を示すことができる。材料となる抗体について、Ｎ側またはＣ側とは、例えば図１８に示すように、Ｆｃ領域をもつＦａｂ領域をＣ側、Ｆｃ領域をもたないＦａｂ領域をＮ側としてバイパラトピック抗体を作製した場合に、作製されたバイパラトピック抗体においては、元のＦｃ領域をもつＦａｂ領域をＣ側、Ｆｃ領域をもたないＦａｂ領域をＮ側と呼ぶことができる。
本開示の一実施形態において、バイパラトピック抗体が結合する２つのエピトープの位置関係はオルソログマッピングなどの手法によって決定されることができる。抗原上のエピトープ位置を特定することができるものであれば特に限られるものではない。実際に抗体が結合するエピトープのサイズはかなり限局された範囲であり、オルソログマッピングではこのサイズに基づく変異体を作製し、抗体の反応性を分類する。そのため、同じエピトープ群に分類される抗体は、同様の反応性プロファイルを示すこととなる。他方、アラニンスキャニングなどでは、変異箇所が抗体の認識範囲に比べて、細かすぎる変異体を用いてマッピングを行うこととなるため、同じエピトープ群の中に存在する抗体であっても、個々の抗体はそれぞれ異なる反応性を示してしまい、すべての抗体の物理エピトープが異なるという当然の結論となる。逆にマッピングの際に、エピトープのサイズを超えて欠失変異体などの大きな変異体を使うと、いくつものエピトープ群が同じ反応性を示すこととなり、本来であれば別個のエピトープ群に分類されるべきエピトープが同一のエピトープ群に含まれてしまう。すなわち、本開示の一実施形態においては、変異体のサイズを適切にコントロールすることによって、エピトープ群の適切な位置情報を与えるデータとしてオルソログマッピングのデータを利用することができる。
通常のすべての抗体は動物の生体内で作られる。免疫ホストは自己抗原に対する免疫寛容を示すため、得られる抗体のレパトアは自己抗原に反応しない部分にバイアスがかかっていることとなる。本開示の一実施形態において、オルソログマッピングではこの自己寛容が生じているエピトープの類似構造を用いて変異体シリーズを作ることができる。すなわち、抗体の反応性の消失を指標とするために、もっとも効率のよい変異体パネルを作製することとなり、他の方法よりも飛躍的に、効率よく機能エピトープ群の位置情報を得ることができる。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原として膜タンパク質、特にＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属するいずれかの膜タンパク質に対するものとすることができる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、膜糖タンパク質グループの一つであり、種々の細胞機能の調節に働いている。ＴＮＦＲＳＦは細胞外領域にシステインの豊富なシステインリッチドメイン（ＣＲＤｓ）を１つまたは複数有し、これらのＣＲＤは構造的に互いに類似している。さらに各ＣＲＤにはモジュール構造と呼ばれるシステイン間のシスルフィド結合に基づく構造ユニットを特徴として構成され、これらの受容体は、全体の相同性の約２０～３０％を共有している。多くのＴＮＦＲＳＦは、Ｉ型膜タンパク質（細胞外にＮ末端があり、細胞内にＣ末端がある）である。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原としてＴＮＦＲ２に対するものとすることができる。ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦＲスーパーファミリー（ＳＦ）の一種であり、ＴＮＦαをリガンドとする受容体である（Croft M1, Benedict CA, Ware CF. Clinical targeting of the TNF andTNFR superfamilies. Nat Rev Drug Discov. 12(2), 147-68. (2013).;Grell M, DouniE, Wajant H, Lohden M, Clauss M, Maxeiner B, et al. The transmembrane form oftumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumornecrosis factor receptor. Cell. 83(5),793-802. (1995).）。ＴＮＦαは、２つの受容体であるＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２に結合し、生体における様々な生理機能に重要な役割を示すことが知られている（下記＃１～＃１８）。
#1 Lubrano di Ricco M, Ronin E, Collares D,Divoux J, Gregoire S, Wajant H, Gomes T, Grinberg-Bleyer Y, Baud V, Marodon G,Salomon BL, Tumor necrosis factor receptor family co-stimulation increasesregulatory T cell activation and function via NF-kappaB, Eur J Immunol 2020
#2 Chou CK, Chen X, Preferential Expansionof CD4(+)Foxp3(+) Regulatory T Cells (Tregs) In Vitro by Tumor Necrosis Factor,Methods Mol Biol 2111(71-78, 2020
#3 Atretkhany KN, Gogoleva VS, DrutskayaMS, Nedospasov SA, Distinct modes of TNF signaling through its two receptors inhealth and disease, J Leukoc Biol 2020
#4 Wajant H, Beilhack A, TargetingRegulatory T Cells by Addressing Tumor Necrosis Factor and Its Receptors inAllogeneic Hematopoietic Cell Transplantation and Cancer, Front Immunol10(2040, 2019
#5 Torrey H, Khodadoust M, Tran L, Baum D,Defusco A, Kim YH, Faustman DL, Targeted killing of TNFR2-expressing tumorcells and Tregs by TNFR2 antagonistic antibodies in advanced Sezary syndrome,Leukemia 33(5):1206-1218, 2019
#6 Tam EM, Fulton RB, Sampson JF, Muda M,Camblin A, Richards J, Koshkaryev A, Tang J, Kurella V, Jiao Y, Xu L, Zhang K,Kohli N, Luus L, Hutto E, Kumar S, Lulo J, Paragas V, Wong C, Suchy J, GrabowS, Dugast AS, Zhang H, Depis F, Feau S, Jakubowski A, Qiao W, Craig G, RazlogM, Qiu J, Zhou Y, Marks JD, Croft M, Drummond DC, Raue A, Antibody-mediatedtargeting of TNFR2 activates CD8(+) T cells in mice and promotes antitumorimmunity, Sci Transl Med 11(512):2019
#7 Medler J, Wajant H, Tumor necrosisfactor receptor-2 (TNFR2): an overview of an emerging drug target, Expert OpinTher Targets 23(4):295-307, 2019
#8 Chen X, Plebanski M, Editorial: The Roleof TNF-TNFR2 Signal in Immunosuppressive Cells and Its TherapeuticImplications, Front Immunol 10(2126, 2019
#9 Al-Hatamleh MAI, E ARE, Boer JC, FerjiK, Six JL, Chen X, Elkord E, Plebanski M, Mohamud R, Synergistic Effects ofNanomedicine Targeting TNFR2 and DNA Demethylation Inhibitor-An Opportunity forCancer Treatment, Cells 9(1):2019
#10 Zou H, Li R, Hu H, Hu Y, Chen X, Modulation of Regulatory T Cell Activity by TNF ReceptorType II-Targeting Pharmacological Agents, Front Immunol 9(594, 2018Sheng Y, Li F, Qin Z, TNF Receptor 2 MakesTumor Necrosis Factor a Friend of Tumors, Front Immunol 9(1170, 2018
#11 Shaikh F, He J, Bhadra P, Chen X, SiuSWI, TNF Receptor Type II as an Emerging Drug Target for the Treatment ofCancer, Autoimmune Diseases, and Graft-Versus-Host Disease: CurrentPerspectives and In Silico Search for Small Molecule Binders, Front Immunol9(1382, 2018
#12 Salomon BL, Leclerc M, Tosello J, RoninE, Piaggio E, Cohen JL, Tumor Necrosis Factor alpha and Regulatory T Cells inOncoimmunology, Front Immunol 9(444, 2018
#13 Nie Y, He J, Shirota H, Trivett AL,Yang, Klinman DM, Oppenheim JJ, Chen X, Blockade of TNFR2 signaling enhancesthe immunotherapeutic effect of CpG ODN in a mouse model of colon cancer, SciSignal 11(511):2018
#14 Fischer R, Proske M, Duffey M, StanglH, Martinez GF, Peters N, Kraske A, Straub RH, Bethea JR, Kontermann RE, PfizenmaierK, Selective Activation of Tumor Necrosis Factor Receptor II InducesAntiinflammatory Responses and Alleviates Experimental Arthritis, ArthritisRheumatol 70(5):722-735, 2018
#15 Faustman DL, TNF, TNF inducers, andTNFR2 agonists: A new path to type 1 diabetes treatment, Diabetes Metab Res Rev34(1):2018
#16 Torrey H, Butterworth J, Mera T, OkuboY, Wang L, Baum D, Defusco A, Plager S, Warden S, Huang D, Vanamee E, Foster R,Faustman DL, Targeting TNFR2 with antagonistic antibodies inhibits proliferationof ovarian cancer cells and tumor-associated Tregs, Sci Signal 10(462):2017
#17 Williams GS, Mistry B, Guillard S,Ulrichsen JC, Sandercock AM, Wang J, Gonzalez-Munoz A, Parmentier J, Black C,Soden J, Freeth J, Jovanovic J, Leyland R, Al-Lamki RS, Leishman AJ, Rust SJ,Stewart R, Jermutus L, Bradley JR, Bedian V, Valge-Archer V, Minter R,Wilkinson RW, Phenotypic screening reveals TNFR2 as a promising target forcancer immunotherapy, Oncotarget 7(42):68278-68291, 2016
#18 Okubo Y, Torrey H, Butterworth J, ZhengH, Faustman DL, Treg activation defect in type 1diabetes: correction with TNFR2 agonism, Clin Transl Immunology 5(1):e56,2016
一方で、ＴＮＦＲ２の機能については、その詳細な機能が明らかにされておらず、どのような機能を持つのか、その役割の解明に関する研究が精力的に行われている。ＴＮＦＲ２の発現は、血管内皮細胞やリンパ球を含むＴ細胞集団などに限定されており（Ware, C.F. et al. Tumor necrosis factor (TNF) receptor expressionin T lymphocytes. Differential regulation of the type ITNF receptor duringactivation of resting and effector T cells. J. Immunol. 147, 4229-4238 (1991).）、ＴＮＦＲ２の活性化に依存したＴ細胞の増殖や細胞生存の亢進が報告されている（Kim EY, Priatel JJ, Teh SJ, Teh HS. TNF receptor type 2 (p75)functions as a costimulator for antigendriven T cell responses in vivo. Journalof immunology. 176(2), 1026-35. (2006).）。これらのことからＴＮＦＲ２は、炎症の制御や生体防御機構に大きな役割を持つことが予測されているものの、その詳細な機能の解明が、病態の発症や悪化、さらにはＴＮＦＲ２を治療薬の標的としての利用することに繋がると期待されている（＃７）。
ＴＮＦＲ２は、免疫抑制に働く制御性Ｔ細胞（以下Ｔｒｅｇ）に高発現している膜型受容体で、Ｔｒｅｇの増殖と機能にＴＮＦＲ２を介したシグナルが重要なことが知られている。ＴＮＦＲ２は内在性リガンド（ＴＮＦα）の結合により活性化されると、転写因子ＮＦκＢを通じ、Ｔｒｅｇの増殖と免疫抑制の発現に働くことが知られており、これらの生物学的活性も代表的に含まれることができる。
本明細書において「腫瘍壊死因子レセプター２（ＴＮＦＲ２）」とは、ＴＮＦＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ、ＴＢＰＩＩ、ＴＮＦ－Ｒ－ＩＩ、ＴＮＦ－Ｒ７５、ＴＮＦＢＲ、ＴＮＦＲ１Ｂ、ＴＮＦＲ８０、ｐ７５、ｐ７５ＴＮＦＲ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １Ｂなどとも表示される、レセプターの一種である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αが結合しシグナル伝達を媒介する。その遺伝子情報について述べると、ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）はＮＭ＿００１０６６（ヒト）およびＮＭ＿０１１６１０（マウス）であり、その遺伝子産物は、ＮＣＢＩに記載されているアクセッションナンバーについてみると、ＲｅｆＳｅｑ（Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＮＰ＿００１０５７．１（ヒト）、ＮＰ＿０３５７４０（マウス）またはＮＰ＿０３５７４０．２（マウス）である。ＴＮＦの生理作用は、赤血球を除いた生体内の細胞に広く存在しているＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を介して発現する。ＴＮＦＲにはＴＮＦＲ１（ｐ６０）とＴＮＦＲ２（ｐ８０）が存在するが、ＴＮＦＲ２に対する親和性がＴＮＦＲ１に対するものよりも５倍高いことが報告されている。ＴＮＦＲもＴＮＦと同様に３量体を形成して存在しており、ＴＮＦＲ１は全身の多くの組織に構成的に発現しているのに対して、ＴＮＦＲ２は何らかの刺激を介して免疫系の細胞に発現する誘導型の受容体である。抗体産生の亢進を行うことにより感染防御や抗腫瘍作用に関与し、他方で、関節リウマチ、乾癬などの自己免疫疾患などに関与する。
上述のように、免疫抑制に働く制御性Ｔ細胞（以下Ｔｒｅｇ）の増殖と機能にＴＮＦＲ２を介したシグナルが重要なことが知られている。ＴＮＦＲ２は内在性リガンド（ＴＮＦα）の結合により活性化されると、転写因子ＮＦκＢを通じ、Ｔｒｅｇの増殖と免疫抑制の発現に働くことが知られているので、抗ＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体の投与により、がん組織に浸潤しているＴｒｅｇを障害して患者の抗腫瘍免疫を促進させることが、新たながん治療法として有望である。
またＴｒｅｇ以外にも、ＴＮＦＲ２はｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ （ＭＤＳＣｓ）などの異なるタイプの免疫抑制担当細胞にも特異的に高発現しており、重要な増殖シグナルを介在している。抗ＴＮＦＲ２抗体は、これらの細胞の増殖を抑制し、結果的に免疫抑制を解除することで、がん免疫を促進させ、がん治療に有用であると考えられる。
またさらに、多発性骨髄腫、大腸がん、卵巣がんなど多種類のがん細胞に、ＴＮＦＲ２が高いレベルで発現する場合があり、ＴＮＦＲ２下流のＮＦｋＢの活性化を通じて、がん細胞の増殖を促進していることがよく知られているので、抗ＴＮＦＲ２抗体で、これらのがん細胞を障害すれば、抗腫瘍効果を示すことが考えられる。
ＴＮＦＲ２を発現するＴｒｅｇ、ＭＤＳＣ，がん細胞などを障害するには、抗体結合により内在性リガンドの結合を阻害し、且つ細胞内シグナルを生じないアンタゴニストとしての機能を示す抗体が有用である。また蓋然性の高い抗体のエフェクター機能として、抗体が抗原と結合したのち、さらにＮＫ細胞などの免疫細胞上のＦｃ受容体と結合することで誘導されるＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）やＡＤＣＰ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などの細胞障害作用が考えられる。または抗原に結合した抗体が、Ｆｃ領域を介して補体を結合することで、引き起こされる補体依存性細胞障害作用も期待される。
したがって、抗ＴＮＦＲ２アンタゴニスト抗体は、内在性リガンドであるＴＮＦαとの競合により、ＴｒｅｇやＭＤＳＣ、ＴＮＦＲ２陽性のがん細胞などの増殖や機能を阻害するだけでなく、抗体のエフェクター作用によりこれらの細胞を傷害して、ＴＮＦＲ２を発現している制御性Ｔ細胞やＭＤＳＣを障害するがん免疫を促進する治療薬への応用が考えられ、またＴＮＦＲ２陽性のがん細胞そのものを障害する、抗体医薬への応用も考えられる。
自己免疫疾患などの過剰な免疫による疾患ではＴｒｅｇの増殖や機能を増強して免疫を抑制する治療が有望である。Ｔｒｅｇの増殖や機能を増強するには、抗体結合により内在性リガンドと同様の細胞内シグナルを誘導するアゴニストな機能を示す抗体が有用である。
例えば、アゴニスト抗体はＴＮＦ関連疾患の中でも、自己免疫難病に対する治療効果が期待される。例として、クローン病、シェーグレン症候群、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ループスエリトマトーデス（ＳＬＥ）、強直性脊椎炎、慢性リウマチ性関節炎、等の疾患が挙げられる。その他、ある種の神経疾患に対する保護的な作用が期待される疾患（例として、海馬修復、網膜神経保護、等）に利用することができると期待される。またＴＮＦＲ２アゴニストは１型糖尿病の病態において、Ｔｒｅｇの機能不全を補正し、自己免疫を抑制することで病態の改善に有用である可能性が示されている（Ｒｅｆ＃１８）
抗ＴＮＦＲ２アゴニスト抗体を利用したＴｒｅｇの増殖を、体内のＴｒｅｇを体外に取り出し細胞培養中でおこない、増幅した免疫抑制Ｔｒｅｇ細胞を、患者体内に戻す自己細胞移入療法、養子免疫療法、に用いることが出来る可能性がある（Ｒｅｆ＃２）。
本開示の一実施形態において、ＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の元になるモノクローナル抗体としては、ＴＮＦＲ２を抗原として、いずれかのエピトープ領域に結合することができるモノクローナル抗体であれば特に限られるものではなく、例えば図１４に示したＴＲ９２、ＴＲ１０９、ＴＲ４５、ＴＲ９４、及びＴＲ９６などが挙げられる。図１４にＴＲまたはＣで示される抗体はいずれもＴＮＦＲ２に対するモノクローナル抗体であり、例えばＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製する場合には、このモノクローナル抗体のうち異なるエピトープ領域に属するいずれの組み合わせを用いてもよい。
本開示の一実施形態において、例えば抗原としてＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、ＴＮＦＲ２に対する異なるエピトープ領域を認識する２つのモノクローナル抗体を用いて作製することができ、その組み合わせはどのようなものであってもよい。またバイパラトピック抗体は上記のとおり、由来となる抗体が２つあるため、非対称となるものであるが、元の２つの抗体に由来するパラトープのいずれがＮ側であってもＣ側であってもよい。例えば、ＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体では、Ｎ側の配列としてＴＲ９６、及びＣ側の配列としてＴＲ９４を用いて得たエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体（Ｂｐ９６－９４）と、Ｎ側及びＣ側を入れ替えて作製したエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体（Ｂｐ９４－９６）とでは、同じ性質を示す。
本開示の一実施形態において、ＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、例えばＴＲ９２、ＴＲ１０９、ＴＲ４５、ＴＲ９４、及びＴＲ９６から選択される２つの抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。また他の実施形態において、ＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、例えばＴＲ９２、ＴＲ１０９、ＴＲ４５、ＴＲ９４、及びＴＲ９６から選択される２つの抗体の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含むこともできる。
本開示の一実施形態において、上記のとおり、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の由来となる２つのモノクローナル抗体はいずれの組み合わせでもよいが、その選択される２つのモノクローナル抗体に応じて、作製されるエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の性質は変化する。例えば、本開示の一実施形態において、ＴＲ９２とＴＲ１０９からエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製した場合、極めてアンタゴニスト活性が増強している一方で、アゴニスト活性は著しく減弱または除去されたものとなる。これはそれぞれのモノクローナル抗体が結合するエピトープ同士の相対的位置に関連する。また、ＴＲ４５とＴＲ９４、ＴＲ４５とＴＲ９６、ＴＲ１０９とＴＲ９６、ＴＲ９６とＴＲ９２、ＴＲ１０９とＴＲ９４、ＴＲ９４とＴＲ９２からエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製した場合、アゴニスト活性が増強しているものとなる。これもそれぞれのモノクローナル抗体が結合するエピトープ同士の相対的位置に関連する。
各抗体の重鎖および軽鎖、並びにそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列は以下のとおりである（Ｋａｂａｔの定義による）。
Figure 0007101433000001
本開示の一実施形態において、各モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖、並びにそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列は、それぞれ表１に記載した配列と少なくとも約５０％以上の配列同一性を有し、または約６０％以上の配列同一性を有し、または約７０％以上の配列同一性を有し、または約８０％以上の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約９０％以上の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有し、もっとも好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列であり、これらは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって、本明細書において、「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲ、３つの軽鎖ＣＤＲ、またはすべての重鎖および軽鎖ＣＤＲを意味する。
本開示の一実施形態において、重鎖、軽鎖、または可変ドメイン配列などの抗体配列のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング規則に従って付番することができる。または、他の実施形態において、Ｋａｂａｔナンバリング規則以外のナンバリング規則を用いることもでき、例えばＣｈｏｔｈｉａ、Ａｈｏ、ＩＭＧＴなどの本技術分野において周知のナンバリング規則を用いることもできる。よって、本開示の一実施形態において、抗体配列のアミノ酸残基は、いずれかのナンバリング規則に従った配列を用いることができ、または２つ以上のナンバリング規則に従う最小の重複領域を最小結合単位として使用することもできる。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、抗原に対する高い親和性や長い半減期を利用して、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）として細胞内に内在化（インターナリゼーション）することもできる。本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体をＡＤＣ化することで、細胞内に内在化し、低分子化合物がリソソームなどの代謝系において活性をもつ形で放出され、細胞を殺傷することができるため、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は細胞内タンパク質を標的化することもできる。
本開示の抗体は、二つ以上の機能を有する抗体として提供され得る。このような二つ以上の機能を有するパイパラトピック抗体は、多機能バイパラトピック抗体とも呼ばれる。本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、その元となるモノクローナル抗体が備える内在化能を維持したまま作製することができる。そのため、例えば、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、顕著に増強したアンタゴニスト活性を有するとともに、内在化能をも備えることができ、ＡＤＣ化などの内在化を必要とする場合であっても、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は有用である。
一つの特定の実施形態では、本開示の抗体は、二つ以上の機能を有する抗体として提供され得る。このような二つ以上の機能を有するパイパラトピック抗体は、多機能バイパラトピック抗体とも呼ばれる。
本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、アゴニスト活性が増強または抑制したものや、アンタゴニスト活性が増強または抑制したものなど、目的の生物学的作用を発揮し得るように、その結合する２つのエピトープの位置を選ぶことで（例えばエピトープ位置の「同じ側」もしくは「反対側」、または抗原抗体複合体の「分子内架橋」もしくは「分子間架橋」など）、目的の生物学的作用を有する抗体とすることができる。このような本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が有する目的の生物学的作用は、ＡＤＣ化による内在化には影響しないため、本開示の一実施形態において、本開示のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、標的たんぱく質の内在化を必要とする生物学的作用を有する抗体とすることもできる。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、バイオインフォマティクスは、当該分野において公知であり、周知でありまたは慣用される任意のものが使用され得る。
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本開示の理解を容易にするために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。したがって、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例）
以下に、実施例を用いて、本開示をより詳細に説明するが、本開示はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下に、本開示において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。また試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライテスク、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
（実施例１：抗ＴＮＦＲ２エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の作製のためのオルソログマッピング）
ＴＮＦＲ２に対するエピトープ均質化抗体パネルはＷＯ２０１８／０９２９０７の実施例４に開示される手法で作製した（図１４）。本実施例では、得られた７つのエピトープ領域のうち、各領域を代表するリファレンス抗体を選択し、５つのエピトープを標的とするリファレンスモノクローナル抗体の配列を同定した。同定したＦｖ配列を用いて、ひとＩｇＧ１の定常領域配列より抗ＴＮＦＲ２エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体を作製した。５つのリファレンスモノクローナル抗体の内訳は、Ｅｐ２に属するＴＲ４５、Ｅｐ３に属するＴＲ９４、Ｅｐ４に属するＴＲ９６、Ｅｐ５に属するＴＲ９２、及びＥｐ７に属するＴＲ１０９である（図１４）。抗ＴＮＦＲ２バイパラトピック抗体の作製に用いた５つのエピトープを図１に示す。それぞれ点線の円で囲った部分がエピトープである。
図２の模式図に示すとおり、ＴＮＦＲ２は４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を持っており、細胞膜から遠位の細胞外ドメインからＣＲＤ１、２、３、４とよばれている（Croft M, Benedict CA, Ware CF. Clinical targeting of the TNF andTNFR superfamilies. Nat Rev Drug Discov. 12(2), 147-68. (2013).; Mukai Y,Nakamura T, Yoshikawa M, Yoshioka Y, Tsunoda S, Nakagawa S, Yamagata Y,Tsutsumi Y. Solution of the structure of the TNF-TNFR2 complex. Sci Signal.3(148), ra83. (2010).）（以降、ドメイン１、２、３、４とする）。ＴＮＦＲ２のリガンドＴＮＦαは、ドメイン２とドメイン３に結合することで活性化される（Grell M, Douni E, Wajant H, Lohden M,Clauss M,Maxeiner B,Georgopoulos S, Lesslauer W, Kollias G, Pfizenmaier K, Scheurich P. Thetransmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand ofthe 80 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell. 83(5), 793-802.(1995).）。活性化によって、ＮＦκＢ（ｐ５０／ＲｅｌＡ）を細胞質に留めているＩＫＢの分解が誘導され、ＮＦκＢ（ｐ５０／ＲｅｌＡ）が核内移行する古典的経路と、ＮＦκＢ（ｐ１００／ＲｅｌＢ）のｐ１００がリン酸化を受けることでプロセシングが誘導され、ＮＦκＢ（ｐ５２／ＲｅｌＢ）となり核内移行する非古典的経路が活性化されることが知られている（Ｎａｕｄｅ ＰＪ， ｄｅｎ Ｂｏｅｒ ＪＡ， Ｌｕｉｔｅｎ ＰＧ， Ｅｉｓｅｌ ＵＬ．Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ． ＦＥＢＳ Ｊ．２７８（６）， ８８８－９８． （２０１１）．）。一方、抗ＴＮＦＲ２抗体シリーズはＴＮＦＲ２の細胞外部分の全長を免疫と特異抗体分離のためのスクリーニングに用いているため、リガンド結合部位以外にも結合する可能性があった。どのエピトープを認識する抗体がどのような機能を持つかは不明であった。
用いる５つのモノクローナル抗体が標的とするエピトープのＴＮＦＲ２上での位置関係を調べるため、オルソログマッピングを行った。図２のヒトＴＮＦＲ２の黒く塗りつぶした部分をマウスオルソログ配列に置き換えたＤＮＡ配列を作製した。このＤＮＡ配列を細胞にトランスフェクトしたものに抗体を結合させ、天然型モノクローナル抗体との反応性を比較した。天然型モノクローナル抗体と比較して、オルソログマッピングによる変異体の反応性が減弱していることを指標に、その置換部分を抗体のエピトープ部位とした。
変異体作製においては、大きくはＣＲＤドメインを１単位としてマウスオルソログ配列へ置き換えたＤＮＡ配列とした。小さくは１つ以上のターンで構成された領域、あるいは２つのターンに挟まれたシート領域をマウスオルソログ配列に置き換えたＤＮＡ配列とした。１０アミノ酸以内の置き換えはＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡）によって行い、これ以上の長鎖への置き換えはマウス配列ＤＮＡとヒト配列ＤＮＡをＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（東洋紡）を用いたＰＣＲによって増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって組み込むことで作製した。
（実施例２：変異体による反応性試験）
１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（以下ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を継代培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、６穴平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に２ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。ＰＥＩ ＭＡＸ （Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．） の手法に従って、ＴＮＦＲ２－ＩＲＥＳ－ＴａｇＢＦＰをＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトし、一晩３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。０．０５％ＥＤＴＡを含む０．５３ｍＭトリプシンで処理したＨＥＫ２９３ＴをＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（０．１％ アジ化ナトリウム、２．５％ＦＢＳ、ＰＢＳ溶液）を用いて８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、９６穴Ｖ底プレート（Ｖｉｏｌａｍｏ）に２５μｌ／ｗｅｌｌ添加した。さらに、一過性発現細胞を分離した後、１．５μｇ／ｍｌに調整した各ＴＮＦＲ２抗体を２５μｌ／ｗｅｌｌ添加し、氷上で１時間静置して相互作用させた。１２００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄後、２００倍希釈したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＰＥ を２５μｌ／ｗｅｌｌ添加し、氷上、暗所で３０分静置した。１２００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去した。ＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒで１回洗浄後、２００μｌ／ｗｅｌｌで懸濁を行い、フローサイトメーター（ＦＣＭ）によって解析を行った。
ＦＣＭの解析結果を図３に示す。またこのデータをオルソログマッピングの位置データと相関させたものを図４に示す。図３及び４に示したとおり、ＴＲ４５モノクローナル抗体では、ＣＲＤ３領域の一部を置換したＭＣ３Ｂ変異体において抗原との反応性が消失していた。このことから、ＴＲ４５モノクローナル抗体が結合するＴＮＦＲ２上のエピトープ部位はＣＲＤ３領域に存在することがわかった。同様にして、ＴＲ９２、ＴＲ９４、ＴＲ９６、及びＴＲ１０９の各モノクローナル抗体が結合するＴＮＦＲ２上のエピトープ部位を特定した。各エピトープ部位は図１の点線の円で囲った部分に相当する。
（実施例３：バイパラトピック抗体の作製）
以上のようにして特定した各エピトープ部位に結合する５つのモノクローナル抗体（ＴＲ４５、ＴＲ９４、ＴＲ９６、ＴＲ９２、ＴＲ１０９）を用いて、Ｈａｎ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ７，８３６０ （２０１７）．およびＷＯ２０１７／１４３８３８に記載の方法を改変した手法により、バイパラトピック抗体を作製した。すなわち、上記文献では、スプリットインテインのタンパク質トランススプライシング反応により抗体のヒンジ領域に２つの親抗体フラグメントを組み入れ、重鎖／重鎖および軽鎖／重鎖の誤対合のないバイパラトピック抗体を作製している。この手法では、バクテリアタンパク質であるＤｎａＥが有するペプチド鎖組換え配列であるインテインを利用することにより、産物に組み換えタグが残ることなく、そのまま使える抗体を作製している。
まず「Ｎ側」フラグメントは以下のように作製した。「Ｎ側」Ｆａｂ領域重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）の下流に、Ｃｆａ ＤｎａＥ ＩｎｔＮ（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ａ．Ｊ．， Ｂｒｏｗｎ，Ｚ．Ｚ．， Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｈ．， Ｓｅｋａｒ，Ｇ．， Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｄ．，Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３８， ２１６２－２１６５ （２０１６））、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、６×Ｈｉｓタグを導入したＤＮＡ配列を組み込んだプラスミドと、「Ｎ側」軽鎖をコードしたプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に導入し、６日間もしくは７日間３７℃、８％ＣＯ２条件下で振盪培養した。ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって培地上清からＮ側フラグメントを回収し、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００２６／６００ ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってこれを精製した。
また「Ｃ側」は以下のように作製した。Ｆｃのヘテロ二量化には、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｚ．， Ｙｕａｎ，Ｊ．Ｑ．， Ｇｏｄｄａｒｄ，Ａ．， Ａｄａｍｓ，Ｃ．Ｗ．， Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ． ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ． Ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６，６７７－６８１ （１９９８）に報告されている変異体を利用した。Ａｋｉｂａ，Ｈ．，Ｓａｔｏｈ，Ｒ．， Ｎａｇａｔａ，Ｓ．， Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．， Ａｎｔｉｂ． Ｔｈｅｒ．， ２， ６５－６９ （２０１９）に報告されているのと同様に、ｋｎｏｂ鎖には「Ｃ側」Ｆａｂ領域重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）、ヒンジと変異体Ｆｃを含む遺伝子を作製した。Ｈｏｌｅ鎖には、６×Ｈｉｓタグ、ＭＢＰ、Ｃｆａ ＤｎａＥ ＩｎｔＣ、ヒンジと変異体Ｆｃを含む遺伝子を作製した。この２つのプラスミドに、「Ｃ側」軽鎖をコードしたプラスミドを加え、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に導入し、６日間もしくは７日間３７℃、８％ＣＯ２条件下で振盪培養した。ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって培地上清からＣ側フラグメントを回収し、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００２６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってこれを精製した。
バイパラトピック抗体は、Ｎ側フラグメント１５μＭ、Ｃ側フラグメント１０μＭ、ジチオスレイトール２ｍＭを混合し、３７℃、２時間インキュベートした。Ａｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に通し、未反応体および副生成物を除去したものをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってこれを精製した。
上記のようにして作製したバイパラトピック抗体におけるモノクローナル抗体の組み合わせは以下の表２のとおりである。
Figure 0007101433000002
バイパラトピック抗体（Ｂｐで示す抗体）は２つの抗体のＦａｂ領域を連結するものであるため、Ｆｃ領域についてはいずれか一方の抗体由来となる。そのため厳密にはリンカー部分が非対称となるが、ＴＲ９４とＴＲ９６を用いて作製したＢｐ９４－９６とＢｐ９６－９４では、そのＮ側とＣ側とを入れ替えたとしても、予想どおり活性に差はなかった。以下の実施例においては、Ｂｐ９４－９６を用いた。
（実施例４：レポーターアッセイ）
以上のようにして作製した１０個のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、および比較例として元のモノクローナル抗体を用いて、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を測定した。
まずアゴニスト活性の測定は以下のように行った。ＴＮＦＲ２を発現させたＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅレポーター細胞を用い、各抗体を添加することによって誘導されるＴＮＦＲ２下流のＮＦｋＢ依存性シグナルをレポータータンパク質の分泌性アルカリフォスファターゼの発現として、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質とした発色法で検出した。抗体はバイパラトピック抗体およびモノクローナル抗体ともにＥｘｐｉ２９３細胞株を用いて得た組換えヒトキメラ抗体を用いた。
２×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭに１００μｌになるように懸濁し、９６－ｗｅｌｌ培養プレートの各ウェルに添加した。各ウェルに各抗体を０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００ｎＭの濃度で加え、一晩培養した。翌日、各抗体の刺激により、ＮＦｋＢ依存性に細胞の培養上清中に分泌されたアルカリフォスファターゼの酵素活性による、発色基質としてのｐＮＰＰの加水分解を吸光度変化によって測定した。３回の吸光度測定値の平均を算出し、アゴニスト活性の場合には「抗体なし、ＴＮＦαなしでの吸光度」、またはアンタゴニスト活性の場合には「抗体なし、ＴＮＦαありでの吸光度」から、各抗体を添加して得られる測定結果を評価した。以上の実験を独立して３回行い、平均と標準偏差を棒グラフとして表示した。アゴニスト活性の測定結果を図５の上段に示した。
次に同様の実験系で、ＴＮＦＲ２を発現させたＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅレポーター細胞を用い、ＴＮＦＲ２の内在性リガンドであるＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、ＴＮＦαの存在下での各抗体のＮＦｋＢ依存性シグナルの抑制を調べることで、各抗体の機能的アンタゴニスト活性を検討した。
Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅレポーター細胞は、発現導入したＴＮＦＲ２に加え、内在性のＴＮＦＲ１を発現しているので、内在性リガンドであるＴＮＦαで刺激した場合に、ＴＮＦＲ２とＴＮＦＲ１の両方の活性化が起こる。したがって、抗ＴＮＦＲ２抗体による機能的アンタゴニスト効果はＴＮＦＲ２のみを介した部分的なものになる。アンタゴニスト活性の測定結果を図５の下段に示した。
アゴニスト活性については、用いたモノクローナル抗体のすべてが中程度アゴニストを示した。一方で、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体では、強いアゴニスト活性を示すものと、弱いアゴニスト活性を示すものとにわかれることがわかった。具体的には、Ｂｐ４５－９４、Ｂｐ４５－９６、Ｂｐ１０９－９６、Ｂｐ９６－９２、Ｂｐ１０９－９４、及びＢｐ９４－９２の計６つのバイパラトピック抗体は極めて強いアゴニスト活性を示し、モノクローナル抗体の中でもっとも強いアゴニスト活性を示すＴＲ９４に比べて１０倍以上の強いアゴニスト活性を示した。すなわち、これらの６つのエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は低濃度でもアゴニスト抗体として有効であることがわかる。
一方、アンタゴニスト活性については、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体では、その元となるモノクローナル抗体におけるアンタゴニスト活性に依存した。すなわち、バイパラトピック抗体の元となる２つのモノクローナル抗体のうち少なくとも一方がアンタゴニスト抗体でなければ、作製されたバイパラトピック抗体はアンタゴニスト抗体とはならなかった。アンタゴニスト抗体となるエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の中でもＢｐ１０９－９２については、アゴニスト活性を完全に抑えているため、アンタゴニスト抗体として、元のＴＲ１０９よりも有効であることがわかる。
（実施例５：強制発現細胞への結合評価）
続いて、ＴＮＦＲ２を発現させたＲａｍｏｓ－Ｂｌｕｅレポーター細胞を用いて、各抗体の結合能を評価した。レポーターアッセイで用いたＴＮＦＲ２－Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ細胞に、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、及び１０００００ｎｇ／ｍＬの濃度の各抗体を添加し、氷上で１時間インキュベートした。１２００ｒｐｍで５分間遠心し
た後、上清を除去した。ＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒで１回洗浄後、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ＰＥ を各ウェルに添加し、氷上、暗所で３０分静置した。１２００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄後、フローサイトメーター（ＦＣＭ）によって蛍光解析した。
蛍光強度の平均値を結合量に相当する値とした。独立して同条件の実験を２回行った。
ＴＲ９４の可変領域を有するもの（Ｂｐ４５－９４、Ｂｐ９４－９６、Ｂｐ１０９－９４、Ｂｐ９４－９２、及びＴＲ９４）以外の抗体１０点について、高濃度側３点（プラトー領域）の蛍光強度平均値をＡｉとして（ｉ＝１，２，…１０。各抗体に相当）、Σｉ（ｋＡｉ１回目－Ａｉ２回目）２が最小となるｋを求め、この値を用いて２回の実験データを平準化した。各プロットについて、平均値と標準偏差を図６に示した。ＴＲ９４（一番下の線）を除いて、いずれの抗体においても、抗原への親和性はほぼ同程度であることがわかった。
（実施例６：組み換え抗原への反応性評価）
各抗体の単量体抗原および二量体抗原への結合キネティクス分析と評価を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法で行った。単量体および二量体抗原を準備し、その単量体および二量体抗原に対する各抗体の結合性を評価し、分子内架橋活性の有無を調べた。ＳＰＲ技術は、金コーティングバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化抗体と、溶液中に注入された単量体または二量体抗原との相互作用により起こる表面上での質量変化を示す。分子が表面上に固定化された抗体に結合する場合に質量が増加し、逆に固定化抗体から分析物が解離する場合に質量が減少する。バイパラトピック抗体と、その元となるモノクローナル抗体をＳＰＲで解析することにより、各抗体の性能を評価するだけでなく、多価結合の影響をみることができる。すなわち、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体の場合には、図７に示す■から●で大きく変化するもの、およびモノクローナル抗体の場合には、図７に示す×から▲で大きく変化するものについて多価結合が重要といえる。
単量体抗原および二量体抗原は図８の模式図のように準備した。まずＴＮＦＲ２細胞外領域のＦｃ ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎであるエタネルセプト（Ｐｆｉｚｅｒ）を準備し、酵素分解と還元再酸化反応によってＴＮＦＲ２抗原分子を取得した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔをプロトコルどおりに用いて抗体をセンサーチップに固定化した。上記２種類の抗原を分析物として相互作用を解析した。各抗体のＳＰＲパラメータを表３に、またグラフにまとめた結果を図７に示す。
Figure 0007101433000003
図７から、モノクローナル抗体ＴＲ９４は二量体抗原への結合活性が弱く、ＴＲ９６は単量体抗原への結合活性が高いことがわかった。これはモノクローナル抗体の中でも例外的な結合活性を示す。またバイパラトピック抗体は多くの場合、二量体抗原への結合活性が十分に強く、特にＢｐ９４－９２、Ｂｐ１０９－９２、及びＢｐ９４－９６では、顕著に強い結合活性を示していた。さらに、多くのモノクローナル抗体と同様に、Ｂｐ４５－９２は単量体抗原への結合活性が弱い一方、他のバイパラトピック抗体はその由来となるモノクローナル抗体よりも高親和性を示していた。またこの結果は、上記のＦＣＭによる評価結果と矛盾しないこともわかった。エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は天然型抗体と比べて、遜色ないか改善された抗原特異結合親和性を有していた。
（実施例７：濃度依存性比較）
続いて、実施例４のレポーターアッセイによって得た各抗体のアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性、並びに実施例５のフローサイトメトリーによるＴＮＦＲ２発現細胞への結合活性、さらに実施例６のＳＰＲ結果を各抗体それぞれについて同じグラフにプロットし、抗原への結合活性とアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性とが濃度依存的にどのように変化するかを調べた。その結果を図９に示す。
（実施例８：ＳＥＣ－ＭＡＬＳによる架橋能評価）
作製したバイパラトピック抗体が抗原とどのような割合で結合するのかを評価するため、より絶対的な分子量測定法であるサイズ排除クロマトグラフィー－多角度光散乱検出（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）（ＳＥＣ： Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， ＭＡＬＳ： Ｄａｗｎ ８， ＷｙａｔｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、構造解析を実施した。組換え抗体・抗原タンパク質を混合し、ＳＥＣ－ＭＡＬＳにかけることで、複合体の分子量サイズがわかる。分析は常法に従い行った。図１０の各パネルはＢｐ１０９－９２とＴＲ１０９のＳＥＣ－ＭＡＬＳの結果を示しており、上段２パネルがＢｐ１０９－９２、また下段２パネルがＴＲ１０９の結果である。それぞれ左側のパネルでは各抗体に対して８当量のＴＮＦＲ２－ＥＣＤを混合している。
図１０の左側の上下パネルに示されるとおり、ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロフィールが先に溶出するピークと後に溶出するピークを含有することがわかる。各ピークを横断する線は、の溶出時間は、検出された分子種の分子量を表す。左上のＢｐ１０９－９２（アゴニスト活性なし）パネルに示された結果は、抗原であるＴＮＦＲ２と混合すると１８０ｋＤａのピーク分子量（第１のピーク）が検出され、抗体と抗原とが１：１で結合していることがわかった。また左下パネルから、ＴＲ１０９（アゴニスト活性あり）では、抗原であるＴＮＦＲ２と混合すると２１５ｋＤａのピーク分子量（第１のピーク）が検出され、予想どおり抗体と抗原とが１：２で結合していることがわかった。すなわち、ＴＲ１０９は２価の天然型モノクローナル抗体であることがここからもわかる。
同様にして、他のバイパラトピック抗体（Ｂｐ９４－９６、Ｂｐ４５－９６、Ｂｐ９４－９２）についてもＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いてその結合の態様を解析した。その結果を図１１に示す。図１１の右上パネルに示したＢｐ９４－９６（アゴニスト活性なし）では、８当量のＴＮＦＲ２と混合すると１９０ｋＤａのピーク分子量（第１のピーク）が検出され、抗体と抗原とが１：１で結合していることがわかった。また図１１の下段パネルに示したＢｐ４５－９６（アゴニスト活性あり）およびＢｐ９４－９２（アゴニスト活性あり）では、それぞれ０．２５当量のＴＮＦＲ２と混合すると、３５０ｋＤａ以上または３１０ｋＤａのピーク分子量（第１のピーク）が検出され、抗体と抗原とが２：２で結合していることがわかった。
各抗体のＳＥＣ－ＭＡＬＳの結果を表４にまとめた。また各抗体および抗原－抗体複合体の大まかな分子量をまとめた結果を表５に示す。
Figure 0007101433000004
Figure 0007101433000005
１：１の複合体を形成するのはＴＲ９４、Ｂｐ１０９－９２、Ｂｐ９４－９６、Ｂｐ１０９－４５であり、このうちＢｐ１０９－９２とＢｐ１０９－４５はアゴニスト活性がなく、Ｂｐ９４－９６は弱いアゴニスト活性を示した。ＴＲ９４は測定濃度条件で細胞上結合が飽和しておらず（図６）、特殊な結合を示すために、複合体が完成していないと考えられる。また、１：２の複合体を形成するのは、ＴＲ１０９、ＴＲ４５、ＴＲ９２、ＴＲ９６、及びＢｐ４５－９２であり、このうちＴＲ１０９、ＴＲ４５、ＴＲ９２、ＴＲ９６はモノクローナル抗体であり、いずれも中程度のアゴニスト活性を示し、Ｂｐ４５－９２は弱いアゴニスト活性を示した。Ｂｐ４５－９２については、ＴＲ４５とＴＲ９２が結合するエピトープが近接しており、バイパラトピック抗体に両者の抗原結合部位が配置されたときに、競合阻害を起こし、単一の抗原に結合できていない可能性がある。また２：２の複合体を形成するＢｐ４５－９６、Ｂｐ９４－９２、Ｂｐ１０９－９６、Ｂｐ４５－９４、及びＢｐ９６－９２と、濃度依存性のある挙動を示すＢｐ１０９－９４は強いアゴニスト活性を示した。
これらの結果から、抗原と抗体が結合して多量体を形成するものは強力なアゴニストとなることがわかった。このアゴニストとなる（抗体－抗原が２：２またはそれ以上で複合体を形成する）６個のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体が結合する２つのエピトープ位置の組み合わせを調べた結果を図１２に示す。いずれもＴＮＦＲ２表面において、それぞれのエピトープ位置は反対側に存在していることがわかる。またアゴニストとはならない（抗体－抗原が１：１または１：２で複合体を形成する）４個のバイパラトピック抗体が結合する２つのエピトープ位置の組み合わせを調べた結果を図１３に示す。図１３の点線は弱いアゴニスト活性を示すエピトープ位置の組み合わせである。いずれもＴＮＦＲ２表面において、それぞれのエピトープ位置は同じ側に存在していることがわかる。
これらの結果から、ＴＮＦＲ２抗原の「反対側」にエピトープがある、つまり、Ｆａｂが結合する際に、Ｆａｂの、抗原から見て反対側（付け根）が、遠ざからないような配置になる場合には、必ず２つ以上のＴＮＦＲ２分子を架橋する複合体となることがわかり、この場合には、必ずアゴニストになることがわかった。また、ＴＮＦＲ２抗原の「同じ側」にエピトープがある場合には、アゴニストにならないことがわかった。
（実施例９：種々の抗ＴＮＦＲ２バイパラトピック抗体と抗ＴＮＦＲ２天然型抗体のＴＮＦＲ２依存性細胞内在化の比較）
作製した抗ＴＮＦＲ２バイパラトピック抗体と、天然の抗ＴＮＦＲ２モノクローナル抗体との細胞内在化能について比較した。作製したバイパラトピック抗体、およびそれらの親キメラ抗体を、ＴＮＦＲ２／Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ細胞またはＣＤ３０／Ｒａｍｏｓ－Ｂｌｕｅ細胞と２次ＡＤＣの存在下で培養した。生細胞数を４日後にＷＳＴ－８法で測定し、抗体の内在化による細胞傷害性を測定した。吸光度の低下は細胞障害性が起きていることを示し、よって抗体内在化が生じていることを示す。その結果を図１５に示す。
作製したバイパラトピック抗体はいずれも一様にＴＮＦＲ２抗原依存性の内在化能を示した。この内在化能は天然型抗体と同程度であり、各バイパラトピック抗体の強いアゴニスト活性や、強いアンタゴニスト活性と無関係であった。このことから、アゴニズムとアンタゴニズムを規定する分子間架橋と分子内架橋の違いは、内在化に影響しないと考えられる。ＡＤＣ化などの内在化を必要とする抗体改変はアンタゴニストの場合でも有効であると考えられた。
（実施例１０：免疫応答性マウス腫瘍モデルにおけるエピトープ領域架橋型抗ＴＮＦＲ２バイパラトピックアンタゴニスト抗体の強力な抗腫瘍活性）
マウスゲノム上のＴＮＦＲ２遺伝子をヒトＴＮＦＲ２遺伝子に置き換えたＴＮＦＲ２ヒト化マウスを用い、天然型抗ＴＮＦＲ２抗体ＴＲ１０９と、強力なアンタゴニスト活性を有するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体ＴＲ９２－ＴＲ１０９の抗腫瘍活性を比較評価する。ＴＮＦＲ２ヒト化マウスでは、野生型マウスにおけるマウスＴＮＦＲ２遺伝子の発現パターンと同様に、置き換えたヒトＴＮＦＲ２が制御性Ｔ細胞に局在し、マウスＴＮＦＲ２の代わりにヒトＴＮＦＲ２が機能している。すなわち、ＴＮＦＲ２ヒト化マウスにおいては、ヒトＴＮＦＲ２が内在性ＴＮＦからの刺激を受け取り、制御性Ｔ細胞の増殖と機能を制御している。このＴＮＦＲ２ヒト化マウスに、マウス癌細胞（例えば大癌由来細胞ＭＣ３８細胞）を皮下に移植すると、経時的に移植細胞が生着し腫瘍が増大する。移植腫瘍が、約１００ｍｍ３に増大した時点でマウスを４群に分け、１群は無処理、１群は陰性コントロールのヒトＩｇＧ１、１群には天然型抗体ＴＲ１０９、１群にはエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体ＴＲ９２－ＴＲ１０９を腹腔内投与する。投与後の腫瘍の増大を経時的に観察すると、未処理群および陰性コントロールのヒトＩｇＧ１投与群では持続的な腫瘍の増大が観察されるが、天然型抗体ＴＲ１０９投与群では弱い腫瘍増殖の抑制が検出され、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体ＴＲ９２－ＴＲ１０９の投与群では腫瘍増殖の停止が観察される。各マウスの腫瘍組織に浸潤した制御性Ｔ細胞を、組織染色によって確認すると、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体ＴＲ９２－ＴＲ１０９投与群の腫瘍組織には制御性Ｔ細胞はほとんど浸潤していない。したがって、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体では、天然型抗体では達成できない強いレベルのアンタゴニスト効果が得られ、制御性Ｔ細胞を抑制し、強い抗腫瘍効果を示す。
その他、本開示は、様々に変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２０年３月３０日に出願された特願２０２０－６１０１４に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
配列番号１：ＴＲ４５重鎖
配列番号２：ＴＲ９２重鎖
配列番号３：ＴＲ９４重鎖
配列番号４：ＴＲ９６重鎖
配列番号５：ＴＲ１０９重鎖
配列番号６：ＴＲ４５軽鎖
配列番号７：ＴＲ９２軽鎖
配列番号８：ＴＲ９４軽鎖
配列番号９：ＴＲ９６軽鎖
配列番号１０：ＴＲ１０９軽鎖
配列番号１１：ＴＲ４５重鎖ＣＤＲ１
配列番号１２：ＴＲ４５重鎖ＣＤＲ２
配列番号１３：ＴＲ４５重鎖ＣＤＲ３
配列番号１４：ＴＲ９２重鎖ＣＤＲ１
配列番号１５：ＴＲ９２重鎖ＣＤＲ２
配列番号１６：ＴＲ９２重鎖ＣＤＲ３
配列番号１７：ＴＲ９４重鎖ＣＤＲ１
配列番号１８：ＴＲ９４重鎖ＣＤＲ２
配列番号１９：ＴＲ９４重鎖ＣＤＲ３
配列番号２０：ＴＲ９６重鎖ＣＤＲ１
配列番号２１：ＴＲ９６重鎖ＣＤＲ２
配列番号２２：ＴＲ９６重鎖ＣＤＲ３
配列番号２３：ＴＲ１０９重鎖ＣＤＲ１
配列番号２４：ＴＲ１０９重鎖ＣＤＲ２
配列番号２５：ＴＲ１０９重鎖ＣＤＲ３
配列番号２６：ＴＲ４５軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２７：ＴＲ４５軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２８：ＴＲ４５軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２９：ＴＲ９２軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３０：ＴＲ９２軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３１：ＴＲ９２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３２：ＴＲ９４軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３３：ＴＲ９４軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３４：ＴＲ９４軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３５：ＴＲ９６軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３６：ＴＲ９６軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３７：ＴＲ９６軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３８：ＴＲ１０９軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３９：ＴＲ１０９軽鎖ＣＤＲ２
配列番号４０：ＴＲ１０９軽鎖ＣＤＲ３

Claims (17)

  1. エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物であって、標的分子が結合することによって活性化する抗原における第１のエピトープに対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列と、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列とを含み、前記抗原との結合によって抗原：抗体が（ｍ×ｎ）：ｎの構造を有する複合体を形成し、ｎは１またはそれ以上の同一の数であり、ｍはパラトープに対する抗原結合ドメインの数の最大値であり、前記抗原はＴＮＦＲ２であり、前記バイパラトピック抗体は、前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに同じ側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有するか、または前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに異なる側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  2. 前記第１のエピトープが前記抗原における複数のエピトープ領域から選択される第１のエピトープ領域に属し、前記第２のエピトープが前記第１のエピトープ領域とは異なる第２のエピトープ領域に属する、請求項１に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  3. ｍが１である、請求項１または２に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  4. 前記抗原との結合によって抗原：抗体が１：１の分子内架橋構造を有する複合体を形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  5. 前記抗原との結合によって抗原：抗体がｎ：ｎ（ｎは２またはそれ以上の同一の数）の分子間架橋構造を有する複合体を形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  6. 前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに同じ側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  7. 前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに異なる側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、請求項１～３、及び５のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  8. 前記抗原と結合するときに、前記抗原上で前記標的分子の結合部位と同じ側に存在する前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、請求項１～４、及び６のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  9. 前記抗原と結合するときに、前記抗原上で前記標的分子の結合部位と同じ側に存在する前記第１のエピトープと、前記抗原上で前記標的分子の結合部位と反対側に存在する前記第２のエピトープとに対する抗原特異性を有する、請求項１～３、５、及び７のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  10. 前記第１のエピトープに対する抗体および／または前記第２のエピトープに対する抗体と比較してアンタゴニスト活性が向上している、請求項１～４、６、及び８のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  11. 前記第１のエピトープに対する抗体および／または前記第２のエピトープに対する抗体と比較してアゴニスト活性が抑制されている、請求項１～４、６、８、及び１０のいずれか一項に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物。
  12. ＴＮＦＲ２に対するエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、
    （ａ）配列番号１（ＴＲ４５重鎖）、配列番号２（ＴＲ９２重鎖）、配列番号３（ＴＲ９４重鎖）、配列番号４（ＴＲ９６重鎖）、および配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）からなる群から選択される２つの重鎖可変領域のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ）配列番号６（ＴＲ４５軽鎖）、配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）、配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）、配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）、および配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）からなる群から選択される２つの軽鎖可変領域であって、（ａ）の抗体重鎖と同一の抗体由来の軽鎖可変領域のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と
    を含む、エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  13. （ａ）配列番号２（ＴＲ９２重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ）配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と
    を含む、請求項１２に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  14. 前記エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体は、
    （ｉ）
    （ａ１）配列番号１（ＴＲ４５重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３（ＴＲ９４重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ１）配列番号６（ＴＲ４５軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｉｉ）
    （ａ２）配列番号１（ＴＲ４５重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４（ＴＲ９６重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ２）配列番号６（ＴＲ４５軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｉｉｉ）
    （ａ３）配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４（ＴＲ９６重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ３）配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｉｖ）
    （ａ４）配列番号４（ＴＲ９６重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２（ＴＲ９２重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ４）配列番号９（ＴＲ９６軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｖ）
    （ａ５）配列番号５（ＴＲ１０９重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３（ＴＲ９４重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ５）配列番号１０（ＴＲ１０９軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、または
    （ｖｉ）
    （ａ６）配列番号３（ＴＲ９４重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２（ＴＲ９２重鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    （ｂ６）配列番号８（ＴＲ９４軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号７（ＴＲ９２軽鎖）に示すアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有するアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    である、請求項１２に記載のエピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  15. エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは機能的等価物を製造する方法であって、
    （ａ）抗原に対する抗体の集合をオリジナル抗体パネルとして提供する工程であって、該抗体の集合に含まれる抗体数ｎは、該抗原に対する目標抗体数Ｎ以上である、工程と、
    （ｂ）該オリジナル抗体パネルに含まれる抗体の結合データを得る工程と、
    （ｃ）該結合データに基づいて、該オリジナル抗体パネルをクラスタリングする工程と、（ｄ）該オリジナル抗体パネルから、１または複数の抗体を除外して、１または複数の部分パネルを生成し、該１または複数の部分パネルの各々について、該結合データに基づいてクラスタリングする工程と、
    （ｅ）該オリジナル抗体パネルおよび該１または複数の部分パネルのエピトープグループ数ｅを算出し、ｅ≧該抗原に関する目標エピトープグループ数Ｅを充足するオリジナル抗体パネルまたは部分パネルが存在する場合には、ｅ≧Ｅを充足するオリジナル抗体パネルまたは部分パネルをエピトープ均質化抗体パネルとし、ｅ≧Ｅを充足するオリジナル抗体パネルまたは部分パネルが存在しない場合、該オリジナル抗体または該部分パネルに新たな抗体を加えて新たな抗体の集合を作成し（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程と
    （ｆ）前記得られたエピトープ均質化抗体パネルに包含される複数のエピトープのうち、２つのエピトープを選択する工程と、
    （ｇ）前記２つのエピトープに結合する抗体のＦａｂ領域を連結する工程と、
    を有し、前記抗原はＴＮＦＲ２であり、前記工程（ｆ）は、（ｉ）前記バイパラトピック抗体が、前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに同じ側に存在する第１のエピトープと第２のエピトープとに対する抗原特異性を有するように前記２つのエピトープを選択するか、または（ｉｉ）前記バイパラトピック抗体が、前記抗原と結合するときに、前記抗原上で互いに異なる側に存在する第１のエピトープと第２のエピトープとに対する抗原特異性を有するように前記２つのエピトープを選択することを特徴とする、方法。
  16. 前記工程（ｆ）は、前記２つのエピトープの位置が、前記抗原上の同じ側に存在するように選択するものである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記工程（ｆ）は、前記２つのエピトープの位置が、前記抗原上の反対側に存在するように選択するものである、請求項１５に記載の方法。
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