CN102960537A - 一种动物养殖用乳酸菌液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物养殖用乳酸菌液的制备方法。该方法包括如下步骤：1）将发酵培养基加热至95—100℃灭菌5—20分钟后，冷却至38℃以下；2）将同型乳酸发酵菌的种子液按1:（2—50）的体积比接种至经步骤1）冷却的所述发酵培养基进行液体厌氧发酵；3）收集经步骤2）所述液体厌氧发酵的发酵液，获得所述动物养殖用乳酸菌液。使用本发明所提供的方法制备动物养殖用乳酸菌液的优点如下：对设备的要求低，生产成本低，获得的乳酸菌液质量稳定，有利于乳酸菌液在养殖业中的推广应用，提高动物生产性能的同时可提高动物源性食品的安全。

Description

一种动物养殖用乳酸菌液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物养殖用乳酸菌液的制备方法。

背景技术

乳酸菌是生猪和家禽养殖行业常用的有益菌。液体乳酸菌生产成本比较低，是一种应用比较广泛的活菌制剂，主要通过饮水体系供动物饮用。传统的乳酸菌制剂，不论是固态干粉还是瓶装或者桶装菌液，都是在纯培养环境下生产的，生产过程的无菌条件要求很高，设备投资大，能耗高，原料需要高温消毒灭菌，每吨液体制剂生产成本至少在5000元以上，导致乳酸菌制剂的推广应用存在很大困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物养殖用乳酸菌液的制备方法，包括如下步骤：

1）将乳酸菌发酵培养基加热至95—100℃灭菌5—20分钟后，冷却至38℃以下；

2）将同型乳酸发酵菌的种子液按1:（2—50）的体积比接种至经步骤1）冷却的所述发酵培养基中进行液体厌氧发酵；

3）收集经步骤2）所述液体厌氧发酵的发酵液，获得所述动物养殖用乳酸菌液；

所述发酵培养基为同型乳酸发酵菌的发酵培养基；

在上述方法中，发酵培养基的灭菌温度为95—100℃，不需要使用高压罐等设备；大比例接种同型乳酸发酵菌的种子液使杂菌不易繁殖。

在上述方法中，在进行所述液体厌氧发酵前先将接种所述同型乳酸发酵菌的种子液的所述发酵培养基分装；由于同型乳酸发酵菌发酵不需氧气，且发酵过程中不产生二氧化碳气体，采用先分装后发酵的方式既可提高发酵效率，又可降低污染率。

在上述方法中，所述同型乳酸发酵菌的种子液中的所述同型乳酸发酵菌浓度为2×10¹⁰cfu/L—2×10¹²cfu/L。

在上述方法中，为了进一步降低成本，所述发酵培养基具体可为将去皮豆粕、水、红糖或葡萄糖和糖蜜按35:400:20:20的质量比制成的溶液；具体可按照包括如下步骤的方法进行：将所述去皮豆粕用水浸泡后磨成粉状，再用水提取，收集所有水提液与所述红糖或葡萄糖和所述糖蜜混合制成溶液；所述浸泡的温度可为常温（15—35℃），时间可为20-30小时；另外，由于豆粕中含有丰富的植物蛋白，无抗生素成分，发酵后的产物用于饲喂动物更安全。

在上述方法中，步骤2）所述液体厌氧发酵的温度为18—40℃，如18—28℃或28-40℃。

在上述方法中，步骤2）所述液体厌氧发酵的时间可为4-21天，根据同型乳酸发酵菌种类和发酵温度的不同而不同。

在上述方法中，步骤2）所述同型乳酸发酵菌的种子液是将所述同型乳酸发酵菌用所述发酵培养基进行液体厌氧发酵获得的所有发酵产物。

在上述方法中，所述同型乳酸发酵菌具体可为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）或屎肠球菌（Enterococcus faecom）。

实验证明：利用本发明方法制备得到的同型乳酸发酵菌液在17～38℃下保存30天，活菌数量基本不变，存放3个月，活菌残留比例在80%以上，活菌数检测过程中杂菌含量均在5.0cfu/mL以下；在生猪养殖过程中，饲喂含3mL/kg同型乳酸发酵菌液的日粮，可使断奶仔猪粪便中的蛋白残留量减少17%，猪舍氨气浓度明显降低；同时可明显提高仔猪的平均日增重和饲料转化效率。

使用本发明所提供的方法制备动物养殖用乳酸菌液的优点如下：获得的乳酸菌液可应用于生猪和家禽养殖的直接饮用，对设备的要求低，生产成本低（每吨成品的生产成本不超过3000元），获得的乳酸菌液质量稳定，有利于乳酸菌液在养殖业中的推广应用，提高动物生产性能的同时提高动物源性食品的安全。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所使用的乳酸菌来源如下：

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1.101；

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 1.1855；

屎肠球菌（Enterococcus faecom）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1.2025。

下述实施例所采用的原料来源如下：

豆粕：东海粮油集团有限公司，“四海”牌。

葡萄糖：济南德佳化工有限公司，食品级，“西王”牌。

甜菜糖蜜：北京银天使国际贸易有限公司，含糖量46％。

红糖：嘉兴古乡红糖食品科技有限公司，“古乡”牌。

实施例1、动物养殖用粪肠球菌（Enterococcus faecalis）液的制备

方案Ⅰ

取35kg去皮豆粕，加入350kg水，常温（15-35℃）浸泡20小时后用磨浆机磨碎（成粉状），离心去除沉淀，取所有水提液（即上清液）用抽水泵转入到容积为1000升水罐中；再补加50kg水、20kg葡萄糖和20kg甜菜糖蜜，30～36rpm下低速搅拌；通蒸汽加热到95℃灭菌20分钟；在夹套通冷却水降温，同时12～15rpm下低速搅拌使培养基的温度保持均匀；当罐内溶液温度下降到38℃以下时，接入粪肠球菌（Enterococcus faecalis）种子液8升（即按体积比为1:50接种），静置5分钟，然后分装在容积为10升的塑料桶中，每个桶都装满，不留空隙。封闭上部装料口，18～28℃下放置21天后，活菌含量为1.2×10¹²cfu/L，获得动物养殖用粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）液。

本方案中的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）种子液的制备方法如下：

1、制备纯种单菌落

按表1的配比配制1升培养基，加热至80～90℃，充分搅拌，彻底溶解各组分，获得组成均一的培养基。将培养基冷却到70℃，分装在500ml三角瓶中，每瓶250ml，瓶口用棉塞封口，外包牛皮纸。120℃灭菌20～30分钟，待培养基冷却至60℃，在无菌条件下把培养基倒入直径为9.0cm的培养皿中，每皿15～20ml，冷却至室温备用。在上述装有培养基的平皿中分别加入0.5ml经无菌生理盐水稀释至10^-4、10^-5和10^-6倍的粪肠球菌（Enterococcus faecalis），每个稀释倍数3个重复，35～39℃下厌氧恒温培养3天，获得生长良好的纯种单菌落。

表1.固体培养基（以1000ml为基准）组分

组分	含量
		甜菜糖蜜（含糖量36.0%）	100.0ml
蛋白胨（植物来源）	10.0g
		琼脂	16.0g
水	900ml

2、一级液体种子的制备

按表2的配比配制500ml培养基，加热至80～90℃，充分搅拌，彻底溶解各组分。用20个容积为20ml的玻璃管（瓶口有密闭橡胶塞）灌装液体种子培养液，每管装20ml培养液，瓶口用橡胶塞封口，120℃灭菌20～30分钟，冷却至室温后备用。

无菌条件下，打开玻璃管，分别接入一个步骤1得到的单菌落，封闭管口。35～39℃恒温厌氧条件下静止培养72小时，得到一级种子液。

表2.一级液体种子培养基（以1000ml培养液为基准）组分

组分	含量
		甜菜糖蜜	50ml
蛋白胨（植物来源）	20.0g

葡萄糖	80.0g
		水	950ml

3、二级液体种子的制备

按表3的配比配制10升培养液，配制方法如下：

取1kg豆粕用8kg清水浸泡24小时，磨浆，得到均匀的溶液后，再加入1升甜菜糖蜜和200g葡萄糖，充分搅拌均匀后，分装在1升容积的玻璃瓶中，每瓶980ml，留出20ml空间接种，瓶口用橡胶塞封口。120℃灭菌20～30分钟，冷却至室温备用。无菌条件下打开玻璃瓶，每瓶分别接入20ml步骤2得到的一级液体种子，封口，35～38℃恒温静息培养36小时，即得到成熟的培养液（活菌浓度1.1×10¹²cfu/L）。将该成熟的培养液在低温下（2～5℃）存放5天，活菌存活数量保持50%以上，可作为扩大培养的二级种子液。

表3.二级液体种子培养基（以1000ml培养液为基准）组分

组分	含量
		甜菜糖蜜	100ml
豆粕	100.0g
		葡萄糖	20.0g
水	800ml

方案Ⅱ

将方案Ⅰ中的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）种子液替换为方案Ⅰ获得的活菌含量为1.2×10¹²cfu/L动物养殖用粪肠球菌液，其它与方案Ⅰ相同，获得活菌含量为2×10¹²cfu/L粪肠球菌液。

实施例2、动物养殖用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）液的制备

方案Ⅰ

取35kg去皮豆粕，加入350kg水，常温（15—35℃）浸泡25小时后用磨浆机磨碎（成粉状），离心去除沉淀，取所有水提液（即上清液）用抽水泵转入到容积为1000升水罐中；再补加50kg水、20kg红糖和20kg甜菜糖蜜，30～36rpm下低速搅拌；通蒸汽加热到100℃灭菌5分钟；在夹套通冷却水降温，同时12～15rpm下低速搅拌使培养基的温度保持均匀；当罐内溶液温度下降到38℃以下时，接入嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）种子液200升（即按体积比为1:2接种），静置5分钟，然后分装在容积为10升的塑料桶中，每个桶都装满，不留空隙。封闭上部装料口，18～28℃放置10天后，活菌含量达到1.8×10¹²cfu/L，获得动物养殖用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）液。

本方案中嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）种子液的制备方法与实施例1的方案Ⅰ中的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）种子液的制备方法相同。

方案Ⅱ

将方案Ⅰ中的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）种子液替换为方案Ⅰ获得活菌含量为1.8×10¹²cfu/L的动物养殖用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）液，其它与方案Ⅰ相同，获得活菌含量为2×10¹²cfu/L的动物养殖用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）液。

实施例3、动物养殖用屎肠球菌（Enterococcus faecom）液的制备

方案Ⅰ

取35kg去皮豆粕，加入350kg水，常温（15—35℃）浸泡30小时后用磨浆机磨碎（成粉状），离心去除沉淀，取所有水提液（即上清液）用抽水泵转入到容积为1000升水罐中；再补加50kg水、20kg葡萄糖和20kg甜菜糖蜜，30～36rpm下低速搅拌；通蒸汽加热到95～100℃灭菌10分钟；在夹套通冷却水降温，同时12～15rpm下低速搅拌使培养基的温度保持均匀；当罐内溶液温度下降到38℃以下时，接入屎肠球菌（Enterococcus faecom）种子液20升（即按体积比为1:20接种），静置5分钟，然后分装在容积为10升的塑料桶中，每个桶都装满，不留空隙。封闭上部装料口，40℃放置4天后，活菌含量为2×10¹⁰cfu/L，获得动物养殖用屎肠球菌（Enterococcus faecom）液。

本方案中屎肠球菌（Enterococcus faecom）种子液的制备方法与实施例1的方案Ⅰ中的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）种子液的制备方法相同。

方案Ⅱ

将方案Ⅰ中的屎肠球菌（Enterococcus faecom）种子液替换为方案Ⅰ获得活菌含量为2×10¹⁰cfu/L的动物养殖用屎肠球菌（Enterococcus faecom）液，其它与方案Ⅰ相同，获得活菌含量为2.5×10¹⁰cfu/L的动物养殖用屎肠球菌（Enterococcus faecom）液。

实施例4、乳酸菌液的稳定性分析

环境温度越高，成熟所需要的时间越短，但是存放的有效时间也会随着温度的升高而缩短。为了确保应用过程中产品的有效性，在库房进行存放试验，环境温度为17～38℃。从实施例1、2和3中获得的含粪肠球菌液、嗜热链球菌液或屎肠球菌液的每个密封桶中每隔10天吸取100ml菌液（采完样以后，剩余的菌液不再留作以后采样，以确保采样的一致性），平板稀释法测定活菌数，并计算相对于存放0天的活菌残留比例。实施例1—3中每个方案为1个重复，每个处理（即存放时间）3—4桶，结果取平均值。如表4所示。

表4.乳酸菌液储存的稳定性分析

结果表明，实施例1—3获得的乳酸菌液在17—38℃下存放3个月，有效活菌数基本都在80%以上，特别是嗜热链球菌，有效活菌数保持在90%以上。另外，在试验开始的30天内，活菌数量基本没有变化。活菌数检测过程中杂菌含量均在5cfu/mL以下。

实施例5、乳酸菌液在动物养殖中的应用

一、乳酸菌液对断奶仔猪生长性能的影响

1、实验方法

实验以平均体重为8.9kg的180头断奶仔猪为样本，按照体重和性别将样本随机分为5个处理组，每个处理组6个重复，每个重复6头猪。每个处理组仔猪分别自由采食如下5种不同组成的日粮（添加的抗生素和乳酸菌液的量均以基础日粮的重量计算），并按照常规方法进行饲养管理：

1）空白对照组：基础日粮；

2）抗生素组：基础日粮+50%洛克沙胂100ppm（百万分之一）+50%吉他霉素100ppm；

3）益生菌组：基础日粮+3ml/kg实施例1方案Ⅱ获得的粪肠球菌液；

4）抗生素益生菌组：基础日粮+50%洛克沙胂100ppm+50%吉他霉素100ppm+3ml/kg实施例1方案Ⅱ获得的粪肠球菌液；

5）抗生素减半益生菌组：基础日粮+50%洛克沙胂50ppm+50%吉他霉素50ppm+3ml/kg实施例1方案Ⅱ获得的粪肠球菌液。

表5.基础日粮配方

原料成分

质量含量（%）

玉米	60.41
		去皮豆粕	22
鱼粉	4
		乳清粉	8
豆油	2
		石粉	0.68
磷酸氢钙	1.12
		食盐	0.35
赖氨酸盐酸盐	0.41
		蛋氨酸	0.06
苏氨酸	0.17
		色氨酸	0.05
预混料1	0.5
		Cr2O3	0.25
合计	100

注：¹.每公斤预混料提供:维生素A,11,000IU；维生素D3，1503IU；维生素E，44.1IU；维生素K，4.0mg；核黄素，5.22mg；泛酸，20.0mg；烟酸，26.0mg；维生素B12，0.01mg；锰，35.0mg；铁，100.0mg；锌，90.0mg；铜，16.5mg；碘，0.30mg；硒，0.30mg。

2、实验数据采集

实验全期4周，在实验开始后的前两周、实验结束的前两周及实验结束时的早晨，将猪个体空腹称重，试验期间准确记录给料量和剩料量，分别统计各组每个仔猪的平均日增重（ADG）、日采食量（ADFI）和饲料增重比（F:G），同时对不同处理组间的统计结果进行多重比较，结果如表6所示。

表6.粪肠球菌液对断奶仔猪生长性能的影响

注：同一项目不同处理组结果间有相同的标记字母表示差异不显著，没有相同的标记字母表示在α=0.05水平上差异显著。

表6的结果表明：抗生素+益生菌组的饲养效果最好。全期平均日增重达到453克，比空白对照组（392克）高出15.6%；饲料转化效率56.8%（1.76的倒数），比对照组高出4.7%，效果很显著。

同时，按照步骤一的方法，将实施例1方案Ⅱ获得的粪肠球菌液分别替换为实施2方案Ⅱ获得的嗜热链球菌液和实施例3方案Ⅱ获得的屎肠球菌液，结果与粪肠球菌液的结果无显著差异。

在常规的饲养过程中，饲料中的抗生素通常是不变的，所以本技术的应用推广比较方便，不需要对原来的饲料配方做出调整，只要在原有饲料的基础上添加本发明获得的乳酸菌液即可。

二、乳酸菌液对猪舍环境的影响

1、实验方法

实验以平均体重为8.9kg的180头断奶仔猪为样本，按照体重和性别将样本随机分为2个处理。每个处理3个重复，每个重复30头猪。试验期为14天。基础日粮如表5所示。在一个处理的基础日粮中添加3ml/kg实施例1方案Ⅱ获得的粪肠球菌液作为试验组，在另一个处理组不添加上述乳酸菌液的处理为对照组。每个处理组均自由采食日粮，并按照常规方法进行饲养管理。

2、实验数据采集

实验第1天和实验第14天，分别用泵吸式氨气检测仪（型号GT901-NH3）并参照仪器使用说明书检测每个猪舍内的氨气浓度，并按照GB/T6432-1994方法分别检测每头猪粪便中的蛋白残留量，结果如表7所示。

表7.实验前后氨气和粪便蛋白残留量检测结果

同时，按照步骤二的方法，将实施例1方案Ⅱ获得的粪肠球菌液分别替换为实施2方案Ⅱ获得的嗜热链球菌液和实施例3方案Ⅱ获得的屎肠球菌液，结果与粪肠球菌液的结果无显著差异。

Claims (10)

1.一种动物养殖用乳酸菌液的制备方法，包括如下步骤：

1）将乳酸菌发酵培养基加热至95—100℃灭菌5—20分钟后，冷却至38℃以下；

2）将同型乳酸发酵菌的种子液按1:（2—50）的体积比接种至经步骤1）冷却的所述发酵培养基中进行液体厌氧发酵；

3）收集经步骤2）所述液体厌氧发酵的发酵液，获得所述动物养殖用乳酸菌液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在进行所述液体厌氧发酵前先将接种所述同型乳酸发酵菌的种子液的所述发酵培养基分装。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述同型乳酸发酵菌的种子液中的所述同型乳酸发酵菌浓度为2×10¹⁰cfu/L—2×10¹²cfu/L。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基是将去皮豆粕、水、红糖或葡萄糖和糖蜜按35:400:20:20的质量比制成的溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基按照包括如下步骤的方法制成：将所述去皮豆粕用水浸泡后磨成粉状，再用水提取，收集所有水提液与所述红糖或葡萄糖和所述糖蜜混合制成溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述浸泡的温度为15—35℃，时间为20—30小时。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤2）所述液体厌氧发酵的温度为18—40℃。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤2）所述液体厌氧发酵的时间为4—21天。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：步骤2）所述同型乳酸发酵菌的种子液是将所述同型乳酸发酵菌用所述乳酸菌发酵培养基进行液体厌氧发酵获得的所有发酵产物。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述同型乳酸发酵菌为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）或屎肠球菌（Enterococcus faecom）。