CN102946713A - 用于增强植物出苗和生长的生氮假单胞菌种的新的荧光假单胞菌 - Google Patents

用于增强植物出苗和生长的生氮假单胞菌种的新的荧光假单胞菌 Download PDF

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Abstract

本发明描述了生氮假单胞菌种的荧光假单胞菌的分离株，菌株F30A，其已保藏在德意志微生物保藏中心，分配的保藏号为DSM 22077，该菌株能够增强其处理的作物的种子萌发、成苗、植物出苗、植物生长和/或产量。因此，本发明还包括该假单胞菌用于增强植物出苗和生长的用途以及包含该假单胞菌的农业组合物。

Description

用于增强植物出苗和生长的生氮假单胞菌种的新的荧光假单胞菌
技术领域
本发明涉及促进植物出苗和植物生长的领域。更特别地，本发明涉及一种标记为F30A的生氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)新菌株，及其作为植物出苗和植物生长促进剂的用途以及用于该用途的组合物和方法，该菌株已被保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)且分配有保藏号DSM 22077。
背景技术
对植物生长具有有利影响的根际细菌(rhizobacteria)通常被称为PGPR(植物生长促进根际细菌)，并且从作物植物的播种/种植生长直到收获的各个阶段均有利于作物植物。在土壤和根际的荧光假单胞菌已在许多研究中被证明在一些农作物中发挥植物生长促进作用(Kloepper等，1980 a，b；Brisbane等，1989；DeFreitas和Germida 1991)，并且也阻抑植物疾病(Hemning，1990，O′Sullivan和O′Gara，1992，Weller，1988，
Figure BPA00001620916500011
等，1997)。
在实验条件下，几种荧光假单胞菌已被证实为提高农作物出苗和产量的潜在剂，农作物例如小麦(Kropp等，1996)，芥(Deshwal等，2006)，糖用甜菜(Suslow和Schroth，1982)，马铃薯(Kloepper等，1980；Howie和Echandi，1983)，萝卜(Kloepper和Schroth，1978；Davies和Whitbread，1989)和菠菜(Urashima等，2006)。深入研究和描述了与其植物生长促进活性相关的几个机制。它们尤其包括根定植能力(Benizri等，2001)，产生广泛的酶和激素的能力(Vivekananthan等，2004；Lucy等，2004，Patten和Glick 1996；García de Salamone等，2001)以及通常具有抗微生物活性的其他代谢物(Loper和Buyer，1991；Dowling和O′Gara，1994)。涵盖它们的不同活性领域的专利/专利申请的实例也是可得的，并且大多涉及具有生物防治特性的菌株/分离株(isolate)。有关具有植物生长促进性质的荧光假单胞菌的专利/专利申请大多通常涵盖发明的活性组分(细菌菌株)连同为选择需要的分离株所需要的筛选和测试方法的描述。本文合并的以下专利申请提供一些关于包括具有植物生长促进和/或生物防治性质的荧光假单胞菌的发明的实例：WO/1987/000194、US1996/5503652、W00051435、US1996/5503651、US2002/6447770和US2002/6495362。
尽管上面列出的文献和专利/专利申请，但是到目前为止，没有属于生氮假单胞菌种的其他分离株，已显示和证明在数年的田间试验期间能够一贯地提高许多重要农作物的出苗、生长和产量。相反，以前研究的来源于土壤的生氮假单胞菌分离株在水稻试验中没有显示出任何显著的生长促进作用(Piao等，2005)。有关生氮假单胞菌分离株的植物生长促进特性的仅有的简短信息并未基于任何证实其植物生长促进特性的实验数据，所述分离株涉及匈牙利LakeVelencei 健康芦苇丛的根茎相关细菌群落(Micsinai等，2003)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的荧光假单胞菌株，其在几种重要农作物中显示植物出苗和/或植物生长促进。此目的通过来自生氮假单胞菌种的荧光假单胞菌的异常分离株(标记为菌株F30A)实现。以前从未报道生氮假单胞菌株用于植物生长促进特性。将该分离株施用于栽培在温室和田间条件下的不同作物后，其提供了显著的植物出苗和生长促进。此外，根据可得到的文献数据，其作用一贯比任何其他先前记录的植物生长促进微生物剂更加稳定和可重复。一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株(菌株F30A)，已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配有保藏号DSM 22077。
因此，本发明涉及一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株，菌株F30A，其已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配有保藏号DSM 22077。本发明还涉及一种获自生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的培养物的上清液，该菌株已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配有保藏号DSM 22077。
本发明还涉及生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或其上清液用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的用途。所述种子和/或植物可为例如双子叶或单子叶的。
本发明还涉及一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的发酵产物。
本发明还涉及一种农业组合物，其包含任选与一种或多种液体和/或固体载体组合的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或其上清液。农业组合物还可包含一种或多种其他植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品。
本发明还涉及一种用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的方法，该方法包括将本文定义的发酵产物或农业组合物施用于种子、植物和/或所述种子或植物的周围环境的步骤。可以施用于例如植物的根。可在植物的根出现之前和/或之后施用。发酵产物或农业组合物可备选地施用于植物无性繁殖个体(vegetative propagation unit)。发酵产物或农业组合物也可施用于植物无性繁殖个体或施用于种子和/或植物周围的植物栽培介质中。该植物可为或该种子可发育成单子叶植物或双子叶植物。
本发明还涉及一种用于制备本文定义的农业组合物的方法，该方法包括以下步骤：将所述生氮假单胞菌菌株F30A或所述上清液与一种或多种液体或固体载体以及任选的一种或多种其他植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品混合。
附图说明
图1.基于16S rDNA的1390个核苷酸的比对，分离株F30A与代表25种不同假单胞菌种的菌株和1种大肠杆菌(E.coli)的参照菌株(Gene Bank保藏号J01695)比较的分类学位置。
图2.以不同浓度对种子施用F30A发酵产物和其上清液后，春小麦(未感染种子批)的出苗(A)和干重(B)。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图3.对种子施用不同浓度的F30A发酵产物和生理盐溶液中悬浮的F30A细胞后，春小麦(未感染种子批)的出苗(A)和干重(B)。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图4.对种子施用不同浓度的F30A发酵产物、悬浮在自来水中的F30A细胞和分离株上清液后，菠菜的出苗。来自两个不同的发酵产物批次的结果：批次FOM115(A)和批次FOM139(B)。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图5.对根/土壤施用不同浓度的F30A发酵产物和施用其上清液后，卷心莴苣的绿色质量(green mass)产量。使用两个不同的发酵产物批次：批次FOM173(A)和批次FOM176(B)。(A)和(B)代表两个独立的温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(n＝12)。
图6.对根/土壤施用F30A的贮存发酵产物批次后，卷心莴苣的绿色质量产量。批次FOM203在4℃贮存2周，批次FOM196贮存6周，批次FOM192贮存14周。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(n＝12)。
图7.对根/土壤施用不同浓度的F30A发酵产物(批次FOM076)后，辣椒的果实产量。温室试验。方块表示CFU/ml。误差棒代表平均值的标准误差(n＝8)。
图8.卷心莴苣的土壤/根处理。左盆：水对照；右盆：F30A发酵产物。
图9.对种子施用F30A发酵产物(批次FOM233)后，田间试验中菠菜的出苗。在三个不同时刻记录出苗。图中显示与未处理对照相比，出苗的增加/减少百分比。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图10.对种子施用F30A发酵产物(批次FOM233)后，田间试验中的菠菜产量。在两个不同时间点测量产量。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图11.田间试验中对种子施用F30A发酵产物(批次FOM154)后，紫花南芥在两个时刻的产量(棒)和出苗(方块)。误差棒代表平均值的标准误差(n＝12)。
图12.田间试验中对种子施用F30A发酵产物(批次FOM150)后，蔓生豌豆(vining pea)的产量。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图13.田间试验中对种子施用F30A发酵产物(批次FOM076)后，胡萝卜的产量。误差棒代表平均值的标准误差(未处理：n＝9；水：n＝12；F30A：n＝6)。
图14.田间试验中对根/土壤施用F30A发酵产物(批次FOM233)后，卷心莴苣的产量。误差棒代表平均值的标准误差(n＝5)。
图15.田间试验中对根/土壤施用F30A发酵产物(批次FOM095和FOM147)后，草莓花的数量。深色棒：F30A；浅色棒：水处理对照。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图16.田间试验中对根/土壤施用F30A发酵产物(批次FOM095和FOM147)后，草莓的产量。深色棒：F30A；浅色棒：水处理对照。误差棒代表平均值的标准误差(n＝4)。
图17.田间试验中对根/土壤施用F30A发酵产物(批次FOM076)后，花椰菜的产量。深色棒：F30A；浅色棒：水处理对照。误差棒代表平均值的标准误差(n＝5)。
图18.田间试验中对根/土壤施用F30A发酵产物后，夏卷心菜(summercabbage)的产量。深色棒：F30A；浅色棒：水处理对照；方块：可销售产量的百分比(＞350克)。误差棒代表平均值的标准误差(n＝50)。
图19.田间试验中对块茎施用F30A发酵产物后，早熟马铃薯的值株发育和块茎产量。具有不同字母的平均值显著不同，根据Duncan多范围测试(p＝0.05)。
图20.对块茎施用F30A发酵产物和分离株的湿配方后，一个早熟马铃薯和一个晚熟马铃薯品种的相对块茎产量。来自田间试验的数据。具有不同字母的平均值显著不同，根据Duncan多范围测试(p＝0.05)。
图21.与未处理幼苗(左)比较，在用分离株F30A的发酵产物处理(右)后，欧洲赤松10周龄幼苗根和枝条(shoot)生长的增强。
具体实施方式
本发明的植物生长促进剂
本发明涉及一种生氮假单胞菌的新菌株菌株F3A，其已于2008年12月3日保藏在德意志微生物保藏中心(Inhoffenstraβe 7B；D-38124 Braunschweig；Germany)，且分配有保藏号DSM 22077。保藏人为兰特曼伦生物农业有限公司(
Figure BPA00001620916500051
BioAgri AB)(P.O.Box 914；751 09 Uppsala；Sweden)。本发明的F30A菌株是一种生物学纯菌株。
生氮假单胞菌的新菌株菌株F30A下面也标记为“分离株”、“剂”或生氮假单胞菌F30A。生氮假单胞菌下面可缩写为生氮假单胞菌(P.azotoformans)。生氮假单胞菌菌株F30A还可在下面简化标记为“F30A”。
本发明的植物生长促进生氮假单胞菌F30A包含荧光假单胞菌的生物学纯菌株，其有以下具体的鉴定特征：(i)分离株是根相关革兰氏阴性菌，荧光假单胞菌(P.fluorescens)谱系的成员，它有不同于最近亲的特定Biolog GM利用特征；选择和鉴定特征在后面将介绍；(ii)分离株具有如下所述的其他独特的形态、生化和代谢特性，以及固氮、溶解磷和溶解/氧化硫的能力；(iii)分离株增强至少属于下列植物科的农作物的种子萌发、植物生长和/或产量：苋科，十字花科，茄科，菊科(Astraceae)，伞形科，豆科，蔷薇科，葫芦科，唇形科，葱科(Aliaceae)，以及增强植物苗圃中树幼苗成根和生长。下文将给出这种影响的具体实例。
本发明的分离株具有以下的其他鉴定特征：在活跃生长的分离株存在下，浓密暗绿色至接近黑色的色素积累在有机培养基(PF琼脂，具有大豆蛋白胨、小麦蛋白胨和其他植物蛋白胨作为基质的液体培养基)中和/或蓝绿色素积累在添加了甘油的无机培养基(例如Lemna培养基(Maeng和Khudairi，1973))中。这种色素积累没有在任何其他已知假单胞菌中报导。此外，分离株具有独特的生化特性，其中通过Biolog GN系统测试的特定的碳水化合物利用特征不同于生氮假单胞菌的典型菌株和其他最近亲荧光假单胞菌的。
本发明分离株的选择首先是收集包括根的整株植物样本。样本稀释液来自根块，并且接种在适合细菌分离的培养基上。收集具有不同形态特征的菌落并作为-80℃原种维持。合适的微生物基质上的液体培养物来自原种，并且用于植物生长促进特性的选择是通过温室生物测定与个体分离株接种的小麦和糖用甜菜种子。选择、鉴定出增强萌发和植物生长的分离株，并进行初步的安全性评估以便确认其大规模温室和田间试验的可行性。
基于形态、生化和遗传特性的集合，本发明选出的分离株是一种革兰氏阴性鞭毛菌且为荧光假单胞菌谱系的成员，鉴定为生氮假单胞菌菌种(图1)。但是，它与生氮假单胞菌典型菌株IAM1603和其他近亲假单胞菌种(表1)相比，具有独特的Biolog GN系统的利用特征。结合表1中列出的性状，以下特征对于本发明菌株是非常特异的：其利用三个最近亲物种的成员不利用的蔗糖和癸二酸，并且它不利用三个最近亲物种的成员利用的木糖醇和腐胺。
表1
区分分离株F30A和近亲的生氮假单胞菌、P.libanensis和类黄假单胞菌(P.synxantha)典型菌株的关键生化特性。
a取自Dabboussi等(1999)的数据基于几个菌株而非仅菌株LMG2190的特性，菌株LMG2190用作MASE实验室中进行的Biolog测试的参照；(-)阴性、(+)阳性、(d)分歧的、nt(没有测试)。
Figure BPA00001620916500071
Figure BPA00001620916500081
能鉴定本发明分离株的其他有用的特性是在常见细菌培养基上的特异性菌落形态，常见细菌培养基例如：VPA-植物蛋白胨琼脂(Vegetable Peptone Agar)(1000ml蒸馏水/去离子水中10g植物蛋白胨液体培养基(Vegetable Peptone Broth)(Oxoid Ltd.)，15g颗粒化琼脂(Agar Granulated)(Difco Ltd))；PF琼脂(PF Agar)(Difco Ltd，1000ml蒸馏水/去离子水中38g PF预混培养基，10g甘油)，先前所描述的独特色素积累。
本发明的分离株的特有菌落外观在温度30℃下孵育24小时，接着在室温(约20-22℃)下再孵育24-48小时后最明显。当在VPA上培养时，菌落边缘通常是不整齐的，菌落在中间稍更高更密。菌落中间紧密、透明、不粘稠、更密集和褐色，边缘为较浅蓝色，具有典型的类似壳状结构的形状。
将本发明分离株与荧光假单胞菌其他分离株区分开的独特菌落特性，在室温下5至8天的孵育后PF琼脂上也观察得到。菌群是灰白色，中间带有很清晰的黄褐色的小尖端，和相当规则的边缘。
本发明的分离株在PF琼脂上培养期间，浓密绿色到接近黑色的色素积累在琼脂中。
在实验室测定中，本发明的分离株在用于假单胞菌的改良液体无机培养基中培养(Stanier等，1966)，该培养基中没有任何可用的氮，但添加了2％的适宜碳源(例如甘油)，这表明其具有固定大气中氮的能力。用本发明分离株过夜生长的细菌细胞的环接种液体培养基，或者将细胞悬浮在0.01M硫酸镁中，并将细胞悬液(0.1ml/5ml液体培养基)添加到无机培养基中。直到接种后5天通过光密度测量(600nm)监测生长。5天后光密度分别为0.108(环接种)，相比开始培养时的0.069，和0.087(细胞悬液)，相比开始培养时的0.046。测量结果表明分离株具有在氮不存在下缓慢增殖的能力，这进而表明本发明的分离株具有固氮能力。
此外，本发明的分离株溶解磷，以及氧化硫代硫酸盐和溶解元素硫。通过在添加不溶性磷(Ca3(PO4)2)或硫代硫酸盐/硫元素的琼脂平板上接种本发明的分离株进行测定。由于不溶性元素的溶解/氧化作用，本发明的分离株的菌落周围形成了清除区。
施用属于生氮假单胞菌菌种的本发明的PGPR分离株，而不是使用荧光假单胞菌菌种的分离株的优点是从未报告过生氮假单胞菌菌种成员为可能的人类病原体。与此相反，可见到荧光假单胞菌对人类致病性的报道(参见例如Franzetti等，1992，Hsueh等，1998；Wei等，2002)。
本发明分离株的生长和维持
本发明的荧光假单胞菌的分离株(生氮假单胞菌F30A)可在任何适合的常见细菌培养基(固体和液体均可)上生长。一些适合的固体培养基实例是植物蛋白胨琼脂(VPA)和假单胞菌F琼脂(Pseudomonas F agar，PF琼脂)。液体培养基实例是植物蛋白胨液体培养基和大豆蛋白胨作为主要的有机碳源的所有培养基。在实验室条件下，本发明分离株在任何适于典型环境荧光假单胞菌的温度，即15℃-30℃下生长良好；优选温度范围23-27℃。在37℃的温度下，超过90％的生长受阻。营养培养基的pH优选中性范围pH7.0-7.5。
几种有机基质，例如胰蛋白胨大豆液体培养基(Tryptic Soy Broth)、植物蛋白胨液体培养基以及植物蛋白胨(Plant Peptone)、小麦蛋白胨(Wheat Peptone)和大豆蛋白胨(Soy Peotone)液体培养基为本发明分离株的优良功效和高生物质生产提供支持。温室试验利用两种生物测定系统进行；施用于根/土壤(卷心莴苣)和施用于种子(菠菜)；该试验允许选择MPS0基质(Levenfors等，2008)，其对于在这些不同农业系统中的应用是最灵活的。然而，对于本发明的分离株，发酵时间应为40-48小时，而不应更短。为了检测本发明分离株生物活性，尽管其他有机基质也适合其发酵，但是本发明的分离株也可以在旋转振荡器(120rpm，40-48小时，室温)上培养。但是，为了获得满意功效，本发明分离株的生物活性产物的发酵推荐在7.0-7.5的pH范围，在大约15-30℃温度范围内进行，例如20-28℃时，最优选约23-27℃。
对于功效试验，本发明分离株发酵产物通常根据标准的发酵试验方案(pH7.0；20℃)，或根据整个发酵过程中的优化发酵试验方案(pH 7.25和25℃)发酵(关于各自试验方案参见实验部分)。此外，也在所选的试验中测试通过如下方法获得的细菌细胞：离心本发明分离株的标准或优化的发酵产物(8000rpm，15分钟)，然后在适当的无机或有机农业兼容载体中配制。所有这些类型的发酵产物制剂的种类都适合用于种子萌发或植物生长增强，并适用于本发明方法。
为确保本发明分离株保持稳定，其可作为冷冻干燥原种培养物或-80℃下深冷冻在20％VPB和30％甘油的混合物中的原种培养物保持。为了发酵及启动液体培养，通常将约100μl深冷冻原种培养物转移到100ml任意适合细菌生长的50％浓度的有机液体培养基，即50％浓度的TSB中，并且在旋转振荡器中(120rpm；22-25℃；最多24h)培养。对于其他实验目的，也可将少量分离株F30A深冷冻原种培养物涂板在适合细菌生长的任何固体有机基质培养基上，并且在+4℃下保存不超过两周。
植物生长促进活性
本发明的生物学纯生氮假单胞菌F30A分离株具有如下能力：增强种子萌发、植物出苗和齐苗、促进成花和花形成和/或促进植物生长，从而提高种植作物产量。因此，本发明的一个方面涉及本发明分离株用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的用途。该植物可为单子叶或双子叶植物或该种子能发育成这两种类型植物之一。
本发明的分离株在上述农作物中增强萌发、出苗、开花和/或提高生长和产量从4到超过50％的范围。
下面给出的实施例显示本发明生氮假单胞菌F30A的植物生长促进活性。表2显示了连续四个生长季中在瑞典进行的一系列田间或商业温室试验中对目标作物施用本发明的分离株作为种子、根/土壤(移植苗)或块茎处理后关于总结的平均产量增加的田间试验数据。实施例1至18清楚地显示当施用到未感染的植物系统中作为种子、块茎、根和土壤/浸液处理时，在商业的田间/温室试验或在生长室实验(小麦，禾本科)中本发明分离株优越的植物生长促进潜能。此外，施用于感染了种子传播的病原体例如小麦镰孢霉属(Fusarium spp.)的种子后，观察到本发明分离株的植物生长促进作用(实施例1)。该作用可能为通过刺激种子萌发和新出苗的幼苗生长而避免感染的结果。因此，更迅速地克服植物的易感阶段并能避免感染。此外，本发明分离株广泛的植物生长促进活性不受土壤类型影响(田间和温室试验均在不同类型的土壤和温室基质中进行)，也不受环境条件例如气候影响(已证实本发明分离株在几个具有不同的温度和降水模式的生长季期间，在多种作物中促进植物生长方面是有效的)。
表2.
相比得自未处理的对照地块的产量，对很多蔬菜作物施用生氮假单胞菌F30A后产量增加。使用适应于商业需求的不同处理方法以施用分离株F30A。连续四个生长季，进行作为田间或商业温室试验的实验。平均产量增加数据为所进行的田间试验数值的平均值。
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此外，本发明分离株的上清液(离心(8000rpm以上，20分钟以上)并附加过滤灭菌(0.2μm)后获得的生氮假单胞菌F30A的无细胞发酵产物)增强萌发、出苗、植物生长和/或提高产量。
实施例1、2和4显示本发明分离株上清液显著地增强春小麦和菠菜出苗以及提高春小麦和卷心莴苣产量的潜力。
本发明分离株的施用和施用说明
此外，本发明的一个目的是提供有效的制剂/配方，其包含本发明生氮假单胞菌F30A和/或其上清液，当用作处理种子、无性繁殖个体、根、土壤和/或其他植物生长培养基和/或浸液时，其有效地增强种子萌发和/或改善植物生长和/或提高重要农作物的产量。因此，本发明还提供农业组合物，其包含本发明植物生长促进生氮假单胞菌F30A和/或其上清液，任选组合的一种或多种使得本发明分离株为液体配方的农业兼容载体或使得本发明分离株为干燥或固体制剂/配方的农业兼容载体。
本发明分离株在温室和田间的双子叶和单子叶农作物中有效提高种子萌发和植物出苗，提高作物植株密度，促进植物开花和植物生长，以及提高产量，农作物来自例如下列植物科：苋科(即糖用甜菜、菠菜、饲用甜菜(mangoldwurzel)、茄科(即马铃薯、辣椒)、豆科(即豌豆)、十字花科(即芝麻菜、花椰菜、各种卷心菜品种、瑞典芜菁、油菜)、菊科(即各种莴苣品种)、伞形科(即胡萝卜)、蔷薇科(即草莓)和禾本科(即小麦)、葫芦科(即黄瓜)、唇形科(即牛至)，葱科(即细香葱)。本发明的分离株也有助于改善各种植物苗圃(即松科欧洲赤松)中的树幼苗的根形成和/或植物生长。
为了提高种子萌发和/或植物出苗、提高作物植株密度、促进植物开花和/或生长和/或最终增加产量，使作物在一定量的本发明植物生长促进分离株(即生氮假单胞菌F30A)存在下生长，其中一定量的植物生长促进分离株描述为相比未处理对照显著地增强种子萌发、提高作物植株密度、促进植物开花和生长并最终增加产量的一些分离株。获得所需作用所需要的本发明分离株的量在作物间是不同的，并取决于本发明分离株的施用方法(播种双子叶和单子叶作物的种子处理、马铃薯和其他无性繁殖作物中的无性繁殖个体(块茎、球茎、根茎等)处理以及植物移植苗和其他作物幼苗的土壤/根/浸液处理)。通常如下建议以获得需要的植物生长促进作用：每1千克种子10-100ml生氮假单胞菌F30A产物(7.5×108-7.5×109菌落形成单位/ml)，每株移植幼苗(根/土壤/浸液)10-20ml，和每个无性繁殖个体(例如马铃薯块茎)100μl-1ml。然而，本发明分离株的量应优选根据不同的作物/施用方法组合的个案情况来确定。
任选地，通常如下建议以获得需要的植物生长促进作用：每1千克种子10-100ml生氮假单胞菌F30A的无细胞上清液，每株移植幼苗(根/土壤/浸液)10-20ml，和每个无性繁殖个体(例如马铃薯块茎)100μl-1ml。然而，本发明分离株的量应优选根据不同的作物/应用方法组合的个案情况来确定。
可以发酵产物形式或农业组合物形式将本发明生氮假单胞菌F30A细胞施用于种子、植物和/或种子或植物的周围环境(例如土壤)，以增强种子萌发和/或植物生长。
因此，本发明的一个方面涉及生氮假单胞菌的生物学纯菌株F30A的发酵产物(即细菌细胞连同其使用的生长培养基)。
本发明的另一个方面涉及一种获自生氮假单胞菌的生物学纯菌株(菌株F30A)的培养物的上清液，该菌株已保藏在德意志微生物保藏中心，且分配的保藏号为DSM 22077。这种上清液可代替细菌细胞或细胞的发酵产物用于本发明的所有方面。
因此，本发明的又一个方面涉及一种农业组合物，其包含：任选与一种或多种液体和/或固体载体组合的生氮假单胞菌的生物学纯菌株F30A或其培养物的上清液。农业组合物为可在不损害活性成分的生物作用的情况下使在农业系统中的实际施用和用途成为可能的组合物。本发明农业组合物包含：生氮假单胞菌F30A的纯培养物/发酵产物、其细胞(例如，通过离心去除培养基并任选利用例如合适缓冲液洗涤细胞而制备)和/或其无细胞上清液，该上清液任选用任何合适的农业可接受液体和/或固体载体配制，载体不对分离株活性和被施用的作物的生长产生负面影响。该农业组合物进一步的任选成分在本文其它地方举例说明。
此外，也可例如通过离心从生氮假单胞菌F30A的细菌培养物去除生长培养基，并在本领域已知的液体培养基或缓冲液的水中重悬细菌细胞，然后施用于植物、种子或土壤。由于上清液本身包含生氮假单胞菌F30A产生的活性物质，也可使用该上清液代替细菌细胞用于本发明所有方面。
本发明还有一个方面涉及一种制备包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物的方法，其包括如下步骤：将所述生氮假单胞菌F30A或从其培养物获得的上清液与一种或多种液体和/或固体载体，和任选一种或多种其他植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品混合。技术人员熟知合适的此类试剂。
也可以干燥细胞(例如冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥或流化床干燥的细胞)的形式将生氮假单胞菌F30A细胞提供给种子、植物和/或种子或植物的周围环境(例如土壤)。该组合物还可包含一种或多种合适的载体。
包含生氮假单胞菌F30A或其培养物上清液的农业组合物也可还包含另外的微生物，例如具有例如植物生长促进、植物保护性(即生物防治)或有益技术作用的生物防治微生物、添加剂和/或佐剂，以进一步增强农业组合物的性能。
可直接将本发明生氮假单胞菌F30A的纯培养物/发酵产物/上清液施用于作物的种子、块茎或幼苗和/或待处理的种子或植物的周围环境(例如土壤)，另外其也可构成适于上文说明的施用的农业组合物的一部分。
生氮假单胞菌F30A的纯培养物/发酵产物、其细胞(例如，通过离心去除培养基并任选利用例如合适的缓冲液洗涤细胞而制备)或其无细胞上清液可任选地与任何合适的不对分离株活性和待施用作物的生长产生负面影响的农业可接受载体混合和配制。合适的载体实例为基于大豆蛋白胨的有机物或与生理盐、甲基纤维素、糊精以及矿物质混合的其他适当的化合物。用于将细菌施用于植物的农业用途的合适载体对于技术人员是已知的。当以混悬液或乳状液的形式施用生氮假单胞菌F30A时，这种混悬液或乳状液也可包含一种或多种市售的添加剂，例如表面活性剂、润湿剂等。此外，优选生氮假单胞菌F30A可与其它植物生长促进剂(关于合适的植物生长促进剂参见例如Lugtenberg和Kamilova，2009)、生物防治剂(关于合适的生物防治剂参见例如Compant等，2005)、有机肥料和/或农用化学品一起使用。因此，本发明另一个方面涉及包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物，其还包含一种或多种另外的植物生长促进微生物、生物防治微生物和/或农用化学品。
生物防治剂和农用化学品可具有例如杀真菌、杀细菌、杀线虫、杀虫、除草或驱鸟作用。该农用化学品也可为植物肥料或植物调节剂。下面的实施例18提供了本发明分离株与一些选定农用化学品、有机肥料和生物防治剂之间完全兼容性的实例。
下面给出了本发明分离株的施用领域、施用说明和规定的有效量的实例。本发明分离株对特定应用和特定农作物有效的量优选根据个案情况确定。
对于种子施用，优选通过市售的种子处理装置以取决于作物的合适剂量施用细菌细胞、发酵产物(即细菌细胞连同其使用的生长培养基)或包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物(包含例如约107-1010菌落形成单位/ml)。可以适当浓度加入合适的载体、添加剂和/或佐剂(这些对技术人员是熟知的)，以在种子包衣期间和之后改善配方的作用、粘附、贮存稳定性和技术性能。此外，可通过常规的可用方法将生氮假单胞菌F30A细胞与载体或载体组合配制，以便获得固体制剂。然后将这类制剂悬浮在液体载体中，产生约107-1010菌落形成单位/ml的细胞浓度。
对于施用于土壤、草皮或其他植物生长介质，或对于移植苗/幼苗的根/土壤处理，可使用灌溉、喷洒或浇灌移植苗架(transplant rack)以将生氮假单胞菌F30A分配到预期位点。当用于处理商业温室作物时，也可通过灌溉、喷洒或营养供给系统来分配细菌。以适于每种作物和施用技术的剂量施用纯培养物或发酵产物或其中任一种的稀释物，或包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物(优选约106-1010菌落形成单位/ml)。可以适当浓度添加合适的载体，以例如改善细菌对植物根部的粘附。
对于施用于各种块茎、球茎等，适合利用传统机械(在分选时集中涂布)喷涂或种植前或在种植处浸透块茎/球茎等。以每个块茎约0.1-10ml的剂量施用生氮假单胞菌F30A的纯培养物或发酵产物(优选约109-1010菌落形成单位/ml)。可以适当浓度添加合适的载体，以例如改善细菌对块茎的粘附。
本发明的生氮假单胞菌F30A在温室和田间双子叶和/或单子叶农作物中增强种子和/或块茎/植物无性繁殖个体萌发、提高作物植株密度、促进植物生长和/或显著提高产量。此外，促进生长和提高产量的能力不受土壤类型、气候条件和植物栽培所用基质类型的影响。在四年间在不同土壤(从砂土到粘土)上已经进行了超过60个田间试验，其代表不同的气候条件。此外，已使用基于泥炭的种植土壤进行了10个商业温室试验以及众多的其他温室试验。
本发明还包括特定鉴定特性的说明。本文描述了本发明分离株的鉴定和表征结果。
本发明另一个方面包括详细的发酵参数，其适于能用于培养本发明植物生长促进剂的的一系列实验室和工业基质。
本发明还涉及一种增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的方法，其包括如下步骤：对种子、植物和/或种子或植物的周围环境施用生氮假单胞菌F30A细菌细胞、发酵产物或包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物。在此方法中例如可以将生氮假单胞菌F30A施用到植物根部。备选地，可将此方法中的生氮假单胞菌F30A在植物的根出现之前和/或之后施用于土壤，或者施用于种子和/或植物周围的植物栽培介质中。备选地，可将生氮假单胞菌F30A细菌细胞、发酵产物或包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物施用于植物无性繁殖个体或施用于种子和/或植物周围的植物栽培介质。当然也可使用上述施用方法的任意组合。用生氮假单胞菌F30A细菌细胞、发酵产物或包含生氮假单胞菌F30A的农业组合物处理的种子或植物可为单子叶植物或双子叶植物或者可发育成此类植物的种子。
本发明的其他目的和优点根据下面对本发明的详细描述无疑会变得明显。然而，详细的描述和具体的实例仅提供用于说明本发明的优选实施方案，且本发明范围内的各种变化和修改就涉及本发明主题的问题而言对于本领域技术人员将是显而易见的。
实验部分
下面的实施例补充说明了本发明的优点，并不应当限制本发明由权利要求限定的范围。
对于所描述的所有实施例中的施用，如未另外指定，本发明分离株根据如下进行发酵：标准(pH 7.0，20℃)或优化(pH 7.25，25℃)的发酵方案，其中使用MPS0培养基(Levenfors等，2008)作为生长基质。发酵前，将培养基灭菌。添加适量的碳源(例如甘油、果糖、蔗糖、葡萄糖)，并校准氧和pH电极。其后发酵罐接种适量的在任何合适的细菌液体基质中生长的本发明分离株的起始培养物。在整个发酵过程中控制发酵参数(氧供应和pH)。需要时添加合适的消泡基质。在测得耗氧量表示次级代谢的转变后2-3小时(通常40-48小时后)，收获发酵产物。将未稀释或用自来水稀释且优选不超过3个月的、包含MPS0培养基中分离株细胞的发酵产物或其无细胞上清液施用于种子、马铃薯块茎，或施用于测试农业和园艺作物的根/土壤。某些试验也利用通过如下方法获得的未稀释或稀释的本发明分离株细菌细胞进行：将其标准或优化发酵产物离心(8000rpm，15分钟)，之后在适当的无机或有机农业兼容载体中配制。
开始的七个实施例描述了包括商业试验在内的温室/生长室试验，它们显示在施用本发明分离株后，增强了小麦、菠菜和油菜的种子萌发和植物出苗，以及提高卷心莴苣绿色质量产量，提高辣椒果实重量，增加选定的盆栽草本植物产量和增加黄瓜产量。
实施例1
增强植物出苗和植物生长-春小麦温室试验
播种前，将春小麦种子(30g)用根据标准发酵方案发酵的本发明分离株的发酵产物、其自来水稀释的细菌细胞或自来水稀释的无细胞上清液处理(300ml/kg种子)，之后将种子与发酵产物/细菌细胞/上清液混合约2分钟的时间并干燥过夜。如果需要，随后在开始试验前贮存种子多达2周的时段。
然后分别播种四盆各50粒种子用于每种处理，并放置在生长室中，其中温度为18-20℃(未感染种子批)或10-12℃(感染镰孢霉属和微结节菌属(Microdochium)真菌的种子批)，光照期为14小时。非无菌市售泥炭混合物“Enhetsjord”(Gerhardson等，1985)用于所有试验。将盆置于18-20℃的温度下后5-6日和置于10-12℃下后12-14日，对出苗植株进行计数。再过12-18日之后，从离土壤表面约0.5cm的距离处剪取植株，并在105℃下干燥过夜后测量枝条的干重，以估算利用本发明分离株处理后增加的植物质量。
图2和3显示利用不同浓度的本发明分离株处理后增强了春小麦的植物出苗，以及其施用对小麦干重的作用，所述小麦在分别利用春小麦的未感染种子批(图2)和感染种子批(图3)的生长室实验中测试。适当浓度下，出苗增强10-15％(未感染种子批)和12-35％(感染种子批)。播种后约20日估算的干重也显著增加了13-18％(未感染种子批)和10-36％(感染种子批)。此外，图2显示以不同浓度施用本发明分离株上清液后春小麦出苗及干重提高。适当浓度下，出苗提高了5-10％，干重提高了8-15％。
给出的结果证实了该分离株作为单独的植物生长促进剂在施用于未感染和感染种子批方面是有用的。分离株F30A极大增强种子萌发和出苗的独特特性导致避免了疾病的过程，促进了核生长和以整个实验期间(约20日)产生的植物干物质的量表示的整体植株状态。
实施例2
增强植物出苗-菠菜温室试验
播种之前，用本发明分离株的发酵产物或其无细胞上清液或者细菌细胞(300ml/kg种子)处理菠菜种子(3-5g)，所述发酵产物根据标准方案(批号：FOM115)或优化方案(批号：FOM139)发酵，所述细菌细胞从各自的发酵产物获得，然后在自来水中再水化。然后将种子和分别的细菌处理物混合约2分钟的时段后，并干燥过夜。如果需要，随后在开始试验前贮存种子多达2周的时段。
然后分别播种四盆各25粒种子用于每种处理，并放置在生长室中，其中温度为12-14℃，光照期为14小时。非无菌市售泥炭混合物“Enhetsjord”(Gerhardson等，1985)用于所有试验。出苗的菠菜植株从播种后第7日开始的约8-10日的时段间连续计数。第9日得到的植株计数用于下面给出的所有结果。
图4显示了利用不同浓度的本发明分离株及其上清液处理后增强的菠菜出苗(图4A)，和利用选定的分离株固体制剂处理后增强的菠菜出苗(图4B)。在适当浓度下，发酵产物处理种子导致出苗增强高达35％。与未处理对照相比，施用未稀释的上清液产生高了13％的出苗。施用固体细胞制剂也有效地提高出苗；在测试浓度下，利用在生理盐溶液中再水化的该制剂处理种子后，多了高达15％的植物出苗。
温室试验的实例清楚地显示本发明菌株增强菠菜萌发和出苗的显著能力。该增强在分离株发酵产物存在下，以及在生理盐溶液或水中悬浮的细胞或在生理盐溶液中再水化的干细胞制剂存在下表现出来。如给出的实施例所示，可检测的出苗增强通常是在10-40％的范围内，并取决于施用于菠菜种子的产物浓度。
实施例3
增强植物出苗-油菜温室试验
播种之前，用根据修改的方案发酵并干燥过夜的本发明分离株的发酵产物处理Joplin油菜(oilseed rape cv.Joplin)种子(10-20g)。利用4种剂量(10、20、40和60ml/kg种子)的分别含有5.0x107、5.0x108和5.0x109cfu/ml本发明分离株的发酵产物处理种子。
随后，分别播种六盆各25粒种子用于每种处理，并置于生长室中，其中温度为12-14℃，光照期为14小时。非无菌市售泥炭混合物用于所有试验。
出苗的油菜植株从播种后第5日开始的约4-5日的时段间连续计数。第6日得到的植株计数用于估算出苗增强。施用5.0x107/ml(0.5％)的发酵产物产生了不依赖剂量的最一致的油菜出苗增强，其出苗增强平均31％。当将剂量20、40和60ml/kg的发酵产物5.0x108/ml(5％)和5.0x109/ml(50％)施用于种子时，检测到较大的变化(表3)。
表3.以三种浓度及四种剂量施用本发明分离株后油菜出苗的增强(n＝6)。
Figure BPA00001620916500191
实施例4
增加卷心莴苣产量-根施用，温室试验
将育苗盘置于温室/生长室(18℃，光照期14小时)，约2周后将幼苗移植到具有同样基于泥炭的基质的盆(1株幼苗/盆)中。再将盆置于温室/生长室4-6日，然后将10-20ml本发明分离株的发酵产物和其他细菌溶液及其上清液施用于根附近，所述发酵产物按照标准或优化发酵方案发酵，其他细菌溶液包含生氮假单胞菌F30A(例如在适当的无机和有机溶剂中再水化的细菌细胞)。随后将盆在温室/生长室再保持约2-3周。然后从离土壤表面约0.5cm的距离处剪取莴苣植株并称重，以测量试验期间产生的绿色质量。
将10ml本发明分离株的发酵产物或其他制剂(5x109-4x1010菌落形成单位(cfu)/ml)作为根/土壤处理在移植时施用于卷心莴苣幼苗中，与未处理对照幼苗相比，这导致优越地增强莴苣生长，并最终导致处理植株的绿色质量更高。
图5显示利用均根据优化方案发酵的本发明分离株的两种发酵产物和其上清液(批次FOM173和FOM176)的两个单独的温室实验的实例。所检测的卷心莴苣绿色质量的增加在19-68％范围内(发酵批次173的温室试验)和3-32％范围内(发酵批次176的温室试验)。施用上清液导致绿色质量分别增加56％(批次173)和36％(批次176)。
此外，本发明分离株的发酵产物具有良好的贮存稳定性；贮存在4℃长达14周的发酵产物的功效不受产品贮存影响。图6示出示例性的温室试验，其显示用2、6和14周龄的本发明分离株的发酵产物处理的卷心莴苣的生长促进，所有发酵产物都是根据优化方案发酵。在这个温室试验中，与发酵产物的龄期无关，用本发明分离株处理的植株的绿色质量增加约40％。此外，14周龄的发酵产物中活细胞计数为约1×1010cfu/ml，相比之下，6和2周龄的发酵产物中分别是1.3和1.5×1010cfu/ml。
实施例5
增加辣椒产量-根施用，温室试验
为了检测对移植苗/幼苗进行根/土壤施用后的生长促进作用，使用辣椒作为补充测试作物。将辣椒种子播种到具有市售的基于泥炭的基质的盆托盘中。将育苗盘置于温室/生长室(白天25℃，晚上20℃且光照期14小时)，约3周后将幼苗移植到具有相同基于泥炭的基质的盆(1株幼苗/盆)中。将盆在温室/生长室再放置4-6日，然后将10ml本发明分离株的发酵产物以及其他细菌溶液施用于根附近，该发酵产物按照标准或优化发酵方案发酵，其他细菌溶液包含生氮假单胞菌F30A(例如在适当的无机和有机溶剂中再水化的细菌细胞)。随后将盆在温室/生长室再保持多达4个月。在两个时刻收获辣椒果实并称重，以估计每株植株的总果实重量。
在辣椒幼苗移植时将3.5x107-3.5x1010cfu/ml间不同浓度的10ml本发明分离株发酵产物作为根/土壤处理施用于辣椒幼苗的塞状育苗容器中，导致与未处理对照植株相比辣椒果实的平均产量更高。图7显示利用本发明分离株的发酵产物批次FOM076处理辣椒幼苗后辣椒果实的产量增加。与未处理对照相比，检测到产量增加6-30％，这取决于辣椒幼苗处理期间本发明分离株的浓度。
实施例6
增加饲用甜菜、芫荽、牛至和细香葱产量-土壤施用，温室试验
将下面的盆栽草本植物：饲用甜菜、芫荽、牛至和细香葱使用市售播种系统播种在具有市售土壤基质的盆中。然后以每一升土壤基质10ml本发明分离株的发酵产物(约1-3×109cfu/ml)喷洒在盆中的土壤表面(25/株盆栽草本植物)。将盆置于用于栽培盆栽草本植物的商业温室中，生长条件为栽培盆栽草本植物的标准条件。取决于盆栽草本植物，在约1-2个月后测量植株的绿色质量。
利用本发明分离株处理的盆栽草本植物的绿色质量相比从未处理盆收获的草本植物的绿色质量平均高约7％(表4)。此外，植株看上去更绿且更茁壮。
表4.利用本发明分离株处理的盆栽草本植物的绿色质量与各自未处理对照的绿色质量的比较和平均产量增加百分比(n＝25)。
Figure BPA00001620916500211
实施例7
增加黄瓜产量-根/土壤施用，商业温室试验
在用本发明分离株处理前，根据黄瓜栽培的要求将黄瓜移植苗种植在面积4600m2的商业温室中。然后，将本发明分离株的发酵培养物(20升；约2-3x109cfu/ml)与80升水在浇水容器中混合，并且作用商业浇水系统用混合物处理植株。对照为在同一类型温室中栽培的黄瓜；栽培面积5400m2；用水处理。两种处理在同一日开始和完成，对两个温室所有生长参数和其他必需的实践措施(例如施肥)保持相同。以每平方米温室的kg测量黄瓜产量，另外对每平方米收获的黄瓜数量进行计数。在收获期间，从利用本发明分离株处理的温室收获了13.75kg/m2和344根黄瓜/m2，相比之下从利用水处理的温室收获了13.03kg/m2和326根黄瓜/m2。这些数值相当于施用本发明分离株的温室中产量增加5.5％/m2。
田间试验
使用本发明分离株的商业田地和温室试验旨在评估其提高种子萌发和植物出苗以及在自然条件下改善植物覆盖、植物生长、开花和/或产量的潜力。在4个生长季期间，在多种重要的农业双子叶作物(参见表2)中进行包括一些较大规模实验(可达1公顷)在内的田间试验(共82个田间试验/商业温室试验)，这些试验侧重于通过使用不同的测量参数评价植物生长促进特性。作物平均产量增加数据列于表2，其中利用本发明分离株的处理导致产量显著增加。
本发明分离株的标准和优化发酵产物用于大量田间试验中。使用三种不同的施用方法来用分离株F30A处理目标作物。它们是种子处理、种薯(seed tuber)处理(马铃薯)和移植苗的根/土壤处理。施用方法取决于且调整为对每种作物所用的常规实践，大部分田间试验位于瑞典南部，这是瑞典生产蔬菜和马铃薯的主要地区。此外，在所有田间试验中，使用常规农业实践，以与必须采取以确保有利的收成的其他必要措施联合来测试施用本发明分离株的有用性。遵循完全随机分组设计进行大多数试验，重复四次，或在一些实验中重复五次。通过SAS/Stat(统计分析系统)中的方差分析(ANOVA)及一般线性模型(GLM)来分析数据。在试验中记载出苗/植株齐苗、花的数量(草莓)和产量/可销售产量。
利用分离株F30A处理各种作物种子导致产量增加6-19％(表2)。此外，产量往往显著高于或高于标准化学品处理后获得的产量(参见实施例8菠菜和实施例10豌豆)。当与未处理对照地块上的植物出苗相比时，植物出苗明显增强，这种作用在直到收获的整个生长季中均保持。在一些个别田间试验中测量的产量增加可达40％。用浇灌方法利用分离株F30A进行的移植苗的根/土壤处理也导致所处理幼苗的生长迅速而明显地增强，这在几天后就明显了(图8显示对温室试验中莴苣生长的作用的实例)。
这些作用在整个生长季中均保持，导致相比对照处理收获早并且产量更高。利用本发明分离株进行根/土壤处理后产量的增加取决于作物，并且平均介于17-52％(表2)。处理马铃薯块茎导致产量增加4-9％(表2)，在一些个别早熟马铃薯田间试验中记载的最高相对产量增加可达25％。
下面介绍的单独实施例(实施例8-18)将进一步显示施用本发明分离株以在一系列重要农作物中提高产量的有用性。施用本发明分离株对其他作物的作用目前正在测试中或将随后评估。因此，所给出的实施例并不意为限制本发明由权利要求限定的范围。
实施例8
增强植物出苗和产量-菠菜田间试验的实例。
除了大规模田间试验之外的菠菜田间试验中，采用重复4-5次的随机分组设计以建立实验。按行进行播种，每块地通常为15m2。在收获0.25m2的代表地块后的两个时刻估计产量。田间试验开始前，利用本发明分离株的发酵产物处理商用菠菜品种的种子批，所述发酵产物根据标准或优化酵方案发酵，也可将其他适当的处理例如市售杀真菌剂施用于种子。本发明分离株在田间试验中通常使用的两种剂量是300ml/kg种子或10ml/kg种子。剂量反应温室试验后进行剂量调整，以适于工业应用。播种前，最终可以按照常规实践中使用的标准来贮存种子。此处提供在瑞典南部进行的示例性的田间试验，其显示增强了植物出苗以及提高了产量。用10ml/kg本发明分离株的发酵产物(批次FOM233)的剂量处理菠菜种子；对照为未处理的种子和以标准剂量的化学杀真菌剂Apron处理的种子。图9显示了关于植物出苗增强的数据。在前两个读数时刻，出苗增强尤其显著，检测到出苗增强分别为33和32％(图9)。
植物出苗增强明显改善早期植物覆盖，这显然比从未处理的种子和标准杀真菌剂Apron处理的种子获得的覆盖更好。此外，用本发明分离株处理后的植株比由未处理的种子或Apron处理的种子出苗而得的植株更茁壮和更大。这产生显著更高的产量。图10显示了所给出实施例中的产量增加，其中产量分别增加了24％(早期收获)和14％(最终收获)。
实施例9
增强植物出苗和产量-紫花南芥田间试验的实例。
以类似菠菜试验的方式进行紫花南芥田间试验。根据试验地农艺实践调整实验设计。种子以6cm间距按行进行播种，选择约4m2的地块作为标准。在按对应每种处理的行随机收获紫花南芥后的两个时刻估计产量，收集和称重来自总行长度达55米中2米(n＝2或n＝4)的植株。以类似菠菜的方式进行种子处理；通常使用本发明分离株的两种剂量用于田间试验：300ml/kg种子或100ml/kg种子。在瑞典南部进行的示例性田间试验表明增强了植物出苗，以及提高了紫花南芥产量。在该田间试验中，将紫花南芥种子用300ml/kg的本发明分离株的发酵产物(批次FOM154)的剂量处理，该发酵产物根据优化方案发酵；对照是未处理的种子。图11显示了施用本发明分离株后紫花南芥植物出苗增强和产量增加的数据。出苗增强了约13％，其导致产量增加了8-18％，这取决于收获时刻(图11)。
实施例10
增强植物出苗和产量-豌豆田间试验的实例。
在豌豆实验中使用与其他作物的种子处理的田间试验相同的原则。田间试验在瑞典南部栽种蔓生豌豆的商业农场进行。通常每千克种子施用50ml发酵产物，并且最常使用15m2面积的地块。从10m2面积的地块收获豌豆后估计产量。按照成熟测度计数值为100(T 100)重新计算产量，这样代表所有收获的蔓生豌豆处于相同的成熟阶段。在瑞典南部进行的示例性田间试验表明增强了植物出苗，以及提高了豌豆产量。豌豆种子用50ml/kg的本发明分离株的发酵产物(批次FOM150，约9.25x109cfu/ml)的剂量处理，该发酵产物根据优化方案发酵；对照是未处理的种子和化学杀真菌剂Wakil处理的种子。图12显示了关于产量增加的数据，其比施用Wakil后稍好(3％)，比未处理对照好12％。此外与未处理对照相比，植物出苗增加了4％。
实施例11
提高产量-胡萝卜田间试验的实例。
在胡萝卜实验中使用与其他作物的种子处理的田间试验相同的原则。田间试验在瑞典南部栽种胡萝卜的商业农场进行。通常每千克种子用300或100ml发酵产物，并且根据试验不同采用面积从20到30m2的地块。从每种处理的0.5或1米的行(n＝3)随机收获胡萝卜后测量产量。分别收集、计数和称重得自每种处理和重复的胡萝卜。在瑞典南部进行的示例性田间试验表明提高了胡萝卜产量。在该田间试验中，将胡萝卜种子用300ml/kg的本发明分离株的发酵产物(批次FOM076，根据标准方案发酵)的剂量处理；对照是未处理的种子和用水处理的种子。图13显示施用本发明分离株后产量增加的数据(与对照相比约19％)。
实施例12
提高产量-对卷心莴苣进行根/土壤处理的田间试验的实例。
对卷心莴苣进行根/土壤处理的田间试验中，将商品化栽种幼苗各用10ml的本发明分离株的发酵产物处理，所述发酵产物按照标准或优化方案发酵。通常在将幼苗移植到田间时进行处理。处理前，发酵产物通常按如下比例稀释：1份发酵产物(5.0x109-1.0x1010cfu/ml，取决于发酵产物的批次)和1份自来水。任选地，幼苗也可用不同的在适当无机或有机农业兼容溶剂中再水化的本发明分离株细菌细胞制剂处理。移植前，将装有幼苗的育苗盘(每种处理150-300株)用适当体积的发酵产物浇灌，或用相同体积的水浇灌作为对照，然后移植到田间。如果需要，也可在移植前几天处理幼苗，并且按照商业性农业实践贮存。移植期间，遵循用于卷心莴苣田间栽培的标准(30cm行距，27cm株距)。根据常规农业措施收获莴苣，并以每个卷心莴苣叶球增加的克重量测量产量增加。
图14显示了得自瑞典南部进行的田间试验的数据。在该试验中，卷心莴苣的产量(每个莴苣叶球的克数)相比得自水处理植株的平均产量增加了平均41％。
实施例13
增加开花和产量-对草莓进行根/土壤处理的田间试验的实例。
对草莓进行根/土壤处理的田间试验中，整个夏季期间在幼苗移植到田间时，将商品化栽种幼苗各用10ml的本发明分离株的发酵产物(批次FOM095，按标准方案发酵，约1.2×1010cfu/ml)处理。接着，在次年春天用20ml发酵产物(批次FOM147，根据优化方案发酵，约3.1x109cfu/ml)以植株灌溉的方式进行第二次处理。如果必要，通过用自来水稀释将发酵产物调整至适当浓度。对于这两次处理，将施用相同体积的水作为对照。商品幼苗用于试验，它们根据用于草莓田间栽培的标准(90cm行距，30cm株距)种植。在七个独立的时刻测量成花数量，并在六个独立的时刻收获成熟的草莓以测量产量。图15和图16显示在第二个生长季期间检测到浆果成花增加和产量增加。除了浆果的首次收获之外，在所有读数时刻开花增加和产量增加均是明显的，并且在整个开花和收获季节都是显著的。取决于读数时刻，开花从20％(在5月30日读数)提高直到142％(在5月12日读数)，其在图15中示出。
开花的增加也导致浆果产量显著增加。在整个收获季节期间的累计产量相比得自水处理对照植株的浆果产量总计高43％(图16)。
实施例14
提高花椰菜成熟度和其早期产量-对花椰菜进行根/土壤处理的田间试验的实例。
对花椰菜进行根/土壤处理的田间试验中，将商品化栽种幼苗用10ml/株幼苗的本发明分离株的发酵产物处理，所述发酵产物按照标准或优化方案发酵。通常在将幼苗移植到田间时进行处理。处理前，将发酵产物用自来水稀释，以调整细胞浓度到约2.5-7.5×109cfu/ml。移植前，将装有幼苗的育苗盘用适当体积的发酵产物浇灌，或用相同体积的水浇灌作为对照，然后移植到田间。如果需要，也可在移植前几天处理幼苗，并且按照商业性农业实践贮存。移植期间，遵循用于花椰菜田间栽培的标准(30cm行距，30cm株距或者50cm行距，50cm株距)。根据常规农业实践在数个时刻收获花椰菜。开始以克/地块记录产量增加；通常使用20m2的地块，然后重新计算为以千克/公顷计的相应产量。图17显示了瑞典南部进行的田间试验期间在五个独立的时刻收获的花椰菜累计产量的数据；使用发酵产物批次FOM076(根据标准方案发酵，约6.5x109cfu/ml)。施用本发明分离株的作用是惊人的，特别是在收获初期。与得自水处理对照幼苗的产量相比，成熟和准备好收获的花椰菜的量在第一次收获时提高超过200％，在第二次和第三次收获时提高超过20％(图17)。虽然收获季节结束时收成的提高并非如此之大，但是对于潜在用户/农民来说提高的早期成熟度具有优越的经济重要性，这是因为相比水处理植株，利用本发明分离株处理的植株平均可提前5天收获。
实施例15
增加产量和提高卷心菜品质-对卷心菜进行根/土壤处理的田间试验的实例。
对卷心菜进行根/土壤处理的田间试验中，将商品化栽种幼苗用每株幼苗5-10ml的本发明分离株的发酵产物处理，所述发酵产物按照标准或优化方案发酵，通常在将植株移植到田间时进行处理。处理前，将发酵产物用自来水稀释，以调整细胞浓度为约5.0-7.0×109cfu/ml。移植前，将装有幼苗的育苗盘用适当体积的发酵产物浇灌，或用相同体积的水浇灌作为对照，然后移植到田间。如果需要，可在移植前几天处理幼苗，并且按照商业性农业实践贮存。移植期间，遵循用于卷心菜田间栽培的标准(50cm行距，50cm株距)进行。根据常规农业实践收获卷心菜，并估计每颗卷心菜叶球的重量。图18显示了利用批次FOM154(5ml，根据优化方案发酵，约6.5x109cfu/ml)的发酵产物处理后，初夏卷心菜(earlysummer cabbage)产量增加的数据(大规模试验；每种处理50株卷心菜幼苗，5个区组)。在该试验中，施用本发明分离株后卷心菜叶球的重量增加了53％(图18)。此外，也检测到卷心菜可销售部分(批准出售)产量的增加，显著提高(图18；相比水处理幼苗为+38％)。这对于潜在用户/农民具有显著的经济重要性。
实施例16
增加产量和提高块茎品质-马铃薯块茎处理的田间试验的实例。
除了一个大规模田间试验之外，马铃薯田间试验采用随机分组设计，重复5次。每种处理的每次重复包括播种在两到三行内的60个种薯。行距和种距遵循马铃薯种植的常规实践。马铃薯试验位于Skáne和Uppland/Dalarna(瑞典中部)。在早熟马铃薯和晚熟马铃薯栽培品种中都进行了试验。早熟马铃薯中，按照常规栽培实践，种植后整个田间试验被覆盖，直到植株完全发育。首批早熟马铃薯田间试验之一包括了未覆盖的处理。将马铃薯块茎直接在种植时处理或提前至多10日处理。一般而言，使用普通自来水将按照标准或优化方案发酵的发酵产物稀释至50％浓度以处理块茎，但也评价10％浓度发酵产物的作用。将块茎在各自的细菌制剂中浸泡20-30分钟，然后利用商用马铃薯种植机种植。如果种植前数天进行处理，将接种的块茎风干，然后放置在马铃薯贮存库中。通过浸泡，每个马铃薯块茎接收到约0.75-1ml细菌悬液。此外，施用细菌的另一种方法是使用标准的喷洒设备进行，该设备在商业上用于化学处理马铃薯块茎。使用该设备对块茎喷洒每吨4升细菌悬液的剂量，即每个块茎接收到约0.2ml上清液。还通过在种植前一至三个月的不同时间点喷洒块茎来评价这种接种方法的功效。为了增强细菌在马铃薯种薯上的粘附和保护，开发了包含均具有良好环境特点的农业兼容的粘着化合物和表面活性剂组合的湿配方。在浸泡和喷洒处理中，这种制剂均用于田间试验中。在所有田间试验中记录和测量出苗/植物齐苗、开花时间、可能的疾病症状和产量/可售售产量。
在早熟马铃薯栽培品种“Rocket”中本发明分离株的作用如图19所示。该细菌处理显著地改善了出苗植株的发育和增加了最终产量(平均产量增加24％)。
相比施用未配制的发酵产物后相应产量增加8％和3％，将本发明分离株的湿配方施用于早熟马铃薯和晚熟马铃薯栽培品种提高块茎终产量17％(早熟马铃薯)和4％(晚熟马铃薯)(图20)。
实施例17
增强植物苗圃中树木根和植株的生长
为了测试施用本发明分离株对改善植物苗圃中树木幼苗生长的作用，将根据优化发酵方案培养的本发明分离株的发酵产物用于处理欧洲赤松的新出苗幼苗。根据商业实践和植物苗圃中使用的方法播种和处理种子。播种9日后，用5ml发酵产物(2-3.5x109/ml)浇灌每株幼苗；对照为用等量的水处理的幼苗。处理后3周、6周和10周视觉监测幼苗生长。处理后13周，采集代表性幼苗样本以测量根与枝条的干重。在表5中总结的结果显示施用本发明分离株导致较高的欧洲赤松幼苗根和枝条干重，其也在图21中示出。与水处理的对照相比，根干重高出多达14％和地上植株干重高出多达31％。因此与水处理对照幼苗重量相比，用本发明分离株处理的幼苗总重量高出多达25％。因而本发明生氮假单胞菌菌株F30A也可用于改善树木和/或树木幼苗生长。
表5.施用本发明分离株后欧洲赤松幼苗干重的增加
实施例18
与农产品的兼容性。本发明分离株与来自生物的，有机的和化学的农产品的有效成分一起时生长的实施例。
表6.所选的商用于种子处理的合成化学杀真菌剂和有机成分的兼容性界限值(μg ml-1)和在测试化合物存在下不抑制生氮假单胞菌F30A(3.3×108ml-1)生长的兼容性值(μg ml-1)，所述兼容性界限值基于对种子处理各自的推荐剂量。
Figure BPA00001620916500282
Figure BPA00001620916500291
*)由于沉淀不能检测更高浓度
表7.根据结合测定法(双板测定法(dual plate assay))的生氮假单胞菌F30A和三种市售的生物防治剂的兼容性
Figure BPA00001620916500292
在所有上述实施例中，本发明分离株没有表现出任何生长受损的迹象，因此与在对种子处理建议的浓度下的所有市售有效成分完全兼容。
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Claims (16)

1.一种生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A，其已保藏在德意志微生物保藏中心，分配的保藏号为DSM 22077。
2.一种获自生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的培养物的上清液，所述菌株F30A已保藏在德意志微生物保藏中心，分配的保藏号为DSM 22077。
3.权利要求1的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或权利要求2的上清液用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述种子和/或植物是双子叶的。
5.权利要求3的用途，其中所述种子和/或植物是单子叶的。
6.权利要求1的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A的发酵产物。
7.一种农业组合物，其包含任选与一种或多种液体和/或固体载体组合的权利要求1的生氮假单胞菌的生物学纯菌株菌株F30A或权利要求2的上清液。
8.权利要求7的农业组合物，其进一步包含一种或多种其他的植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品。
9.一种用于增强种子萌发、植物出苗和/或植物生长的方法，其包括如下步骤：将权利要求6的发酵产物或权利要求7或8中任一项的农业组合物施用于种子、植物和/或所述种子或植物的周围环境。
10.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物施用于植物的根。
11.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物在植物的根出现之前和/或之后施用于土壤。
12.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物施用于植物无性繁殖个体。
13.权利要求9的方法，其中将权利要求6的所述发酵产物或权利要求7或8中任一项的所述农业组合物施用于种子和/或植物周围的植物栽培介质中。
14.权利要求9-13中任一项的方法，其中所述植物为或所述种子会发育成单子叶植物。
15.权利要求9-13中任一项的方法，其中所述植物为或所述种子会发育成双子叶植物。
16.一种用于制备权利要求7或8中任一项的农业组合物的方法，其包括如下步骤：将所述生氮假单胞菌菌株F30A或所述上清液与一种或多种液体或固体载体和任选的一种或多种其他的植物生长促进微生物、生物防治微生物、有机肥料和/或农用化学品混合。
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