CN102943070A

CN102943070A - 应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒及其应用

Info

Publication number: CN102943070A
Application number: CN2012104124184A
Authority: CN
Inventors: 胡文锋; 魏鲁宁; 吴惠玲; 周朝辉; 颜喆
Original assignee: GUANGDONG PRB BIO-TECH Co Ltd; South China Agricultural University
Current assignee: GUANGDONG PRB BIO-TECH Co Ltd; South China Agricultural University
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2032-10-25
Also published as: CN102943070B

Abstract

本发明公开了一种应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒及其在制备高盐稀态发酵食品方面的应用。将菌种菌悬液与相容性溶质混合均匀，加入到灭菌后的包埋材料溶液中，混合均匀挤出，滴入CaCl₂水溶液中，交联得珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl₂溶液，得所述共固定化凝胶颗粒。本发明所述共固定化凝胶适用于高盐、高糖等高渗环境的食品酿制，通过在发酵过程中添加共固定化凝胶颗粒，减弱或缓解高渗透压环境对发酵微生物的高渗胁迫作用，提高微生物活性，加快代谢过程，从而达到缩短发酵周期，改善酱油风味，提高蛋白质利用率和氨基态氮出品率的目的。

Description

应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及将相容性溶质与微生物共固定化技术在高渗透压环境（高盐或高糖）食品酿造方面的应用，尤其涉及所述共固定化技术高盐稀态酱油发酵、低盐固态酱油发酵、泡菜发酵、鱼露发酵以及蜜饯等方面的应用，属于生物发酵工程和调味品生产领域。

背景技术

我国很多传统食品或调味品常在高渗透压（高盐、高糖）环境经微生物和酶的长时间共同作用酿制而成，其中以酱油最为典型。酱油起源于中国，历史悠久，之后传播到日本和韩国，是具有鲜明的东方特色的传统调味品，并且已被欧美的消费者认知和接受，已成为人们日常生活中不可缺少的一种重要调味品。现代医学研究表明：其除了传统调味作用外，还具有营养与保健功能，如抗氧化、抗癌、降血压等作用。

目前我国酱油发酵工艺主要为高盐稀态发酵和低盐固态发酵。其中又以高盐稀态工艺酿制的酱油品质高，风味佳。但由于该工艺将酱曲浸泡于高浓度盐水（18% 氯化钠，约18°Bé）制成酱醪再发酵，发酵微生物及酶受高渗透压胁迫活性很低，导致高盐稀态发酵工艺存在着诸如发酵周期长、设备利用率低、原料利用率和氨基态氮出品率不高等缺点。因此如何缩短其发酵周期，提高蛋白质利用率和氨基态氮出品率是本行业迫切需要突破的技术难点。

多年来，人们致力于解决高盐稀态酱油发酵工艺不足，获得了不少成果，部分成果已应用于发酵工艺当中。如筛选优良的耐盐产香微生物菌种用于酱油发酵，以提高发酵微生物对高渗透压环境的耐受能力；或者添加高浓度发酵微生物菌悬液或外源酶溶液，以提高高渗透压环境下发酵微生物的菌密度或酶的活性。

但上述诸方法在使用中仍有不足之处，如添加高浓度发酵微生物菌悬液或外源酶溶液虽可以在一定范围内相应提高发酵产物的生成量，但在高渗透压环境下的发酵微生物或外源酶很快失活。因此，要从根本上解决高渗透压环境下发酵微生物代谢能力低问题，就要增强发酵微生物的耐高渗透压的能力，同时又有效降低生产成本。

相容性溶质(Compatible solutes)，也称渗透压保护剂，是近年来人们在研究高渗透压环境中微生物耐受机理时发现的一种易溶的、生理pH值条件下不带电荷的小分子有机物质，它能与细胞内体系相容，而不影响细胞的主要功能和蛋白质分子的正常折叠，在高渗透压或低水活度环境下能够在细胞内迅速积累到很高的浓度或者从细胞内泵出。微生物细胞内积累的相容性溶质主要有氨基酸类、氨基酸衍生物类、小分子肽类、甲胺类、硫酸酯类、多元醇类。

相容性溶质对发酵微生物及酶的保护作用机理是：在高渗透压环境下，微生物通过在细胞内积累或释放相容性溶质以缓解胞内水分的剧烈变化，以保持细胞内外的渗透压平衡，维持细胞的正常代谢功能与活动。但是微生物自身合成相容性溶质是一个相对耗能的过程。在外界环境中存在相容性溶质时，微生物会通过其在细胞膜上的转运系统从外界吸收相容性溶质进入细胞内，这在一定程度上节约了高渗透压环境下细胞的能量消耗。

多年前我们已研究了相容性溶质在高盐环境对乳酸菌生长以及高盐稀态酱油发酵的影响，证明游离的相容性溶质可以改善乳酸菌在高盐胁迫的生长，提高酱油发酵的蛋白质转化率并缩短发酵周期。有关的研究成果已公开发表，并申报了专利（发明名称：相容性溶质在高盐稀态酱油发酵中的应用；申请号：201110248389.8）。

固定化技术（Immobilization technicas）是近年来飞速发展的生物工程技术。生物固定化技术是把微生物细胞（microbial cell）或酶（enzyme）吸附或包埋在一定的载体上，取代传统发酵或反应器中游离的细胞或酶，大大提高单位体积含菌量和酶水平，且固定化的微生物细胞或酶具有更稳定的催化活性和抗逆能力，因而能改善基质转化率、加快代谢速率，从而提高发酵产率和缩短发酵周期。

共固定化技术（Co-immobilization）是在固定化酶和固定化细胞技术基础上发展起来的，它是将不同种属的微生物细胞取代单一的微生物进行固定，或者不同性质的酶替代单一的酶，以及酶与微生物细胞同时固定于同一载体内形成共固定化系统的一种技术，综合了混合发酵和固定化技术的优点。

共固定化常用包埋材料包括天然高分子载体和有机高分子合成载体。其中天然高分子载体一般对生物无害，传质性能较佳；有机高分子合成载体抵抗外界环境能力强，机械强度大，循环使用性能好，但传质性能差，固定化细胞后易失活。

共固定化将是打破高盐稀态酱油酿造技术瓶颈的很有潜力的方法之一。但是针对传统高盐稀态发酵酱油工艺的共固定化技术方案仍属空白，缺少适合传统高盐稀态酱油发酵体系的包埋载体、共固定化体系，很难找到适合酱油这种食用调味料色、香、味整体要求的共固定化技术方案，而且不能解决高昂的生产成本问题，大大限制了共固定化技术在工业化扩大生产高盐稀态发酵酱油或者其他调味品方面的推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有传统高盐稀态发酵调味品制备技术的不足，提供一种应用于传统高盐稀态发酵酿造食品制备的共固定化凝胶颗粒，具有稳定、安全和良好溶解性，基于所述共固定化凝胶颗粒，可获得适合传统高盐稀态发酵调味品发酵的共固定化体系，提供适合高盐稀态发酵酿造食品尤其是酱油这种食用调味料色、香、味整体要求的共固定化技术方案。

本发明的另一个目的是提供所述共固定化凝胶颗粒在制备传统高盐稀态发酵酱油方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种应用于传统高盐稀态发酵酿造食品制备的共固定化凝胶颗粒，是通过以下方法制备得到：将菌种菌悬液与相容性溶质按比例混合均匀，加入到灭菌后的包埋材料溶液中，通过挤出滴入CaCl₂水溶液中，交联得珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl₂溶液，得共固定化凝胶颗粒；

所述菌种为耐盐产香微生物的一种或几种的混合物，优选为耐盐酵母菌、耐盐乳酸菌或耐盐醋酸菌中的一种或几种，使用几种时，几种耐盐产香微生物的混合比例不做严格限定。所述相容性溶质为甘氨酸甜菜碱、甘油或海藻糖中的一种或几种的混合物，使用几种时，混合比例不做严格限定，根据本技术领域制备所述高盐稀态发酵食品要求选用。

所述菌种菌悬液与相容性溶质混合的比例按照共固定化凝胶颗粒的最终应用领域确定。应用于制备高盐稀态发酵酱油时，菌种菌悬液相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0.1～0.4%，所述相容性溶质相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0～0.3%，确定二者的用量后将二者进行混合。

优选地，所述相容性溶质相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0.2～0.3%。

所述包埋材料溶液为海藻酸钠或聚乙二醇的水溶液，质量百分比浓度为2.5～4.0%。

所述CaCl₂作为底物，没有添加量的严格限定，适量即可。优选地，所述CaCl₂水溶液的质量百分比浓度为4%。

所述挤出可以将混合均匀的菌种菌悬液、相容性溶质和包埋材料混合溶液中用蠕动泵通过橡胶管吸入后挤出。

所述交联的时间优选为2～5小时。

本发明同时提供了所述共固定化凝胶颗粒在制备高渗透压环境食品酿造方面的应用。

具体地，所述应用是在制备高渗透压环境食品时，发酵物料上罐发酵0～15天内添加相对于发酵物料的质量分数为0.6～1.0%的共固定化凝胶颗粒，然后继续发酵，制备得到所述高渗透压环境食品。

本发明所述高渗透压环境食品包括高盐稀态发酵酱油、低盐固态酱油、泡菜、腐乳、豆豉、豆瓣酱、酱菜、鱼露或蜜饯等，本发明尤其适用于高盐、高糖等高渗环境的酿制食品方面的技术领域。

所述应用具体在生产制备高盐稀态酱油发酵时，高盐稀态酱油的制备包括以下步骤：

（1）按常规方法制备成曲；

（2）将成曲与重量体积比（w/v）为18%的盐水按1:2.0～2.5的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵，按照常规进行淋油操作；在上罐0～15天内添加共固定化凝胶颗粒；添加共固定化凝胶颗粒后每天淋油一次，连续淋油操作7～15天左右；自然发酵；

（3）自上罐发酵始，当自然发酵到60～100天时滤出头油。

优选地，步骤（2）所述共固定化凝胶颗粒按照所述酱醅或酱醪质量的0.6～1.0%添加。制备所述共固定化凝胶颗粒时，菌种菌悬液相对于高盐稀态发酵原料（酱醅或酱醪）的质量分数为0.1～0.4%；所述相容性溶质相对于高盐稀态发酵原料（酱醅或酱醪）的质量分数为0～0.3%，优选0.2～0.3%。优选地，所述耐盐产香微生物菌悬液终浓度为107cfu/100g酱醪或酱醅以上，所述相容性溶质终浓度为0.2g/100g酱醪或酱醅以上。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种新的共固定化技术和体系，适宜应用于高渗透压环境食品酿造方面。本发明创造性地分析了多菌株的共固定技术方案，总结出多菌株混合发酵与固定化技术与高渗透压环境食品酿造结合机理，总结了出适宜的技术方案，更加显著地缓解高渗透压环境对耐盐性产香微生物的抑制作用。

本发明进一步提供优选的技术方案，找到相容性溶质与多种耐盐产香微生物共固定化的合适技术方案，有效缓解高渗胁迫对微生物或大分子蛋白的抑制作用，且不影响微生物或大分子蛋白的相关代谢反应，改善发酵效率，很好地保证相容性溶质调节机制改善耐盐产香微生物适应高渗环境的能力，显著提高其生物活性。

本发明应用于制备高渗透压环境食品的酿造时，通过在高盐稀态酱油发酵过程中添加共固定化凝胶颗粒，显著减弱或缓解高渗透压环境对发酵微生物的高渗胁迫作用，提高微生物活性，加快代谢过程，从而达到缩短发酵周期，并提高蛋白质利用率和氨基态氮出品率，对改善酱油风味做出贡献。

基于本发明共固定技术方案，本发明优选海藻酸钠作为包埋材料，确定包埋材料浓度和用量，确定合理的包埋工艺，将相容性溶质与耐盐产香微生物成功包埋，提供一种稳定、安全、良好溶解性的共固定化凝胶颗粒，而且价格低廉，便于发酵操作时添加，利于工业化扩大生产中使用。

本发明使用的相容性溶质，据食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB2760-2011），甘油（食品用合成香料，FEMA编号：2525）及甘氨酸甜菜碱（食品用天然香料，FEMA编号：4223）可作为食品用香料加入食品中，符合食品添加剂使用的基本要求及食品用香料的标准，安全性较高；海藻糖亦是一种安全、可靠的天然糖类，广泛存在于自然界中许多可食用动植物及微生物体内部，如人们日常食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。因此本发明所使用的相容性溶质既可以为产品带来浓郁优良的品质，又具有安全性。

附图说明

图 1 高盐稀态酱油发酵试验出油中全氮含量对比

图 2 高盐稀态酱油发酵试验出油中总酸含量对比

图 3 高盐稀态酱油发酵试验出油中氨基态氮含量对比

图 4 高盐稀态酱油发酵过程中全氮含量变化对比

图 5高盐稀态酱油发酵过程中总酸含量变化对比

图 6高盐稀态酱油发酵过程中氨基态氮含量变化对比

图7高盐稀态酱油发酵试验出油中蛋白质转化率对比

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，除非特别说明，本发明实施例采用的原料和方法皆为本技术领域常规的原料和方法。

实施例1

（1）按常规方法制备成曲；

（2）将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.3的质量比例混合均匀后上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，添加质量分数为0.3%的游离的耐盐乳酸菌（华南农业大学食品学院应用微生物研究室分离所得；本技术领域技术人员也可以采用市购的耐盐乳酸菌，以及参照现有文献选用在高盐稀态酱油制备方面应用的耐盐乳酸菌）与质量分数0.2%的甘氨酸甜菜碱（食品级，市购）；

（3）上罐后每天淋油一次，连续10天；当自然发酵到100天时滤出头油。

实施例2

将相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0.3%的耐盐乳酸菌（同实施例1采用相同的菌）菌悬液和质量分数0.2%甘氨酸甜菜碱一起加入到灭菌后、质量百分比浓度为3%的海藻酸钠的水溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管吸入后挤出，滴入质量分数 4% CaCl₂水溶液中，交联2～5小时，得颗粒均匀的珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，用无菌生理盐水冲洗去珠体表面的CaCl₂溶液，得共固定化凝胶颗粒，4℃保存备用。共固定化凝胶颗粒平均粒径为2～4mm。

（1）按常规方法制备成曲；

（2）将成曲与重量体积比（w/v）为18%的盐水按1:2.3的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵，按照常规进行淋油操作；在上罐时添加共固定化凝胶颗粒；按照所述酱醅或酱醪质量的0.6～1.0%添加共固定化凝胶颗粒后每天淋油一次，连续淋油操作7～15天左右；自然发酵；

（3）自上罐发酵始，当自然发酵到100天时滤出头油。

实施例3

（1）按常规方法制备成曲；

（2）将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.2的质量比例混合均匀后上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，添加质量分数0.3%的游离的耐盐产香酵母菌（华南农业大学食品学院应用微生物研究室分离所得；本技术领域技术人员也可以采用市购的耐盐乳酸菌，以及参照现有文献选用在高盐稀态酱油制备方面应用的耐盐乳酸菌）与质量分数为0.3%的甘油（食品级，市购）；

实施例4

将相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0.3%的耐盐酵母菌（同实施例4采用相同的菌）菌悬液和质量分数0.3%甘油一起加入到灭菌后、质量百分比浓度为3.5%的海藻酸钠的水溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管吸入后挤出，滴入质量分数 4%的 CaCl₂水溶液中，交联2～5小时，得颗粒均匀的珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，用无菌生理盐水冲洗去珠体表面的CaCl₂溶液，得共固定化凝胶颗粒，4℃保存备用。共固定化凝胶颗粒平均粒径为2～4mm。

（1）按常规方法制备成曲；

（2）将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.2的质量比例混合均匀后上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量的 0.6～1.0%添加共固定化凝胶颗粒后每天淋油一次，连续淋油操作7～15天左右；自然发酵；

（3）当自然发酵到100天时滤出头油。

实施例5

将相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0.2%的耐盐乳酸菌（同实施例1采用相同的菌）菌悬液和质量分数0.15%甘氨酸甜菜碱一起加入到灭菌后、质量百分比浓度为4%的聚乙二醇的水溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管吸入后挤出，滴入质量分数 4% CaCl₂水溶液中，交联2～5小时，得颗粒均匀的珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，用无菌生理盐水冲洗去珠体表面的CaCl₂溶液，得共固定化凝胶颗粒，4℃保存备用。共固定化凝胶颗粒平均粒径为2～4mm。

（1）按常规方法制备成曲；

（2）将成曲与重量体积比（w/v）为18%的盐水按1:2.3的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵，按照常规进行淋油操作；在上罐时添加共固定化凝胶颗粒；按照所述酱醅或酱醪质量的0.6～1.0%添加共固定化凝胶颗粒后每天淋油一次，连续淋油操作7～15天左右；自然发酵。

（3）自上罐发酵始，当自然发酵到100天时滤出头油。

实施例6

将相对于高盐稀态发酵原料的质量分数为0.4%的耐盐酵母菌（同实施例4采用相同的菌）菌悬液和质量分数0.3%甘油一起加入到灭菌后、质量百分比浓度为2.5%的海藻酸钠的水溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管吸入后挤出，滴入质量分数 4%的 CaCl₂水溶液中，交联2～5小时，得颗粒均匀的珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，用无菌生理盐水冲洗去珠体表面的CaCl₂溶液，得共固定化凝胶颗粒，4℃保存备用。共固定化凝胶颗粒平均粒径为2～4mm。

（1）按常规方法制备成曲；

（3）当自然发酵到100天时滤出头油。

实施例7

设未添加任何微生物与相容性溶质的常规酱醪组作为空白对照组。取对照组实施例1、实施例3和本发明产品例实施例2和实施例4的一定头油样品检测其总酸含量、氨基态氮含量以及总氮含量。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

结果及分析：

从附图1可知，各实施例头油的全氮含量均比空白对照组有显著提高，提高幅度为9.5～37.9%。更进一步地，实施例2（添加共固定的乳酸菌及甘氨酸甜菜碱）头油全氮含量比实施例1（添加游离乳酸菌及甘氨酸甜菜碱）全氮含量高出15.7%。实施例4（添加共固定的酵母及甘油）头油全氮含量比实施例3（添加游离酵母及甘油）全氮含量高出18.5%。

由附图2可得知，各实施例头油总酸含量均比空白对照组有明显增加，增加幅度为10.7～37.5%。更进一步地，实施例2头油总酸含量比实施例1提高13.2%。实施例4头油总酸含量比实施例3提高10.5%。

从附图3可以比较出，实施例头油氨基态氮含量比空白对照组有较显著的提高，提高幅度为3.2～31.7%。更进一步地，实施例2中氨基态氮含量较实施例1提高了9.9%。实施例4中氨基态氮含量较实施例3提高了近13.7%。

附图4、5、6显示实施例中各理化指标含量均比空白对照组提早达到相同指标数；各实施例中全氮指标可提前15天左右达到空白对组组指标；氨基态氮指标较空白对照组至少提前10天达到相同指标；总酸含量指标较空白组可提前15天左右达到相同指标。

附图7显示实施例中蛋白质转化率较空白对照组有显著提高，提高幅度为4.2～9.8%。

综合以上数据分析，各实施例酿造的酱油头油各理化指标均比空白对照组有较大幅度的提高。外源添加游离的甘氨酸甜菜碱及产香微生物也能有效改善酿造指标，提高蛋白质利用率及缩短酿造周期，更进一步地，添加共固定化的甘氨酸甜菜碱与产香微生物凝胶颗粒其应用效果更佳、更稳定，产品风味更佳。

Claims

1.一种应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒，其特征在于通过以下方法制备得到：将菌种菌悬液与相容性溶质按比例混合均匀，加入到灭菌后的包埋材料溶液中，混合均匀后挤出，滴入CaCl₂水溶液中，交联得珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl₂溶液，得共固定化凝胶颗粒；

所述菌种为耐盐产香微生物的一种或几种的混合物；所述相容性溶质为甘氨酸甜菜碱、甘油或海藻糖中的一种或几种的混合物；

所述包埋材料溶液为海藻酸钠或聚乙二醇的水溶液，质量百分比浓度为2.5～4.0%；

所述CaCl₂水溶液的质量百分比浓度为4%。

2.根据权利要求1所述的应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒，其特征在于所述耐盐产香微生物为耐盐酵母菌、耐盐乳酸菌或耐盐醋酸菌中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒，其特征在于所述交联时间为2～5小时。

4.权利要求1～3任一项所述的共固定化凝胶颗粒在制备高渗透压环境食品酿造方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于是在发酵物料上罐发酵0～15天内添加相对于发酵物料的质量分数为0.6～1.0%的共固定化凝胶颗粒，然后继续发酵，制备得到所述高渗透压环境食品。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述高渗透压环境食品为高盐稀态发酵酱油；所述高盐稀态酱油的制备方法包括以下步骤：

（1）按常规方法制备成曲；

（3）自上罐发酵始，当自然发酵到60～100天时滤出头油；

步骤（2）共固定化凝胶颗粒按照所述酱醅或酱醪质量的0.6～1.0%添加；

步骤（2）所述共固定化凝胶颗粒的制备方法是：将菌种菌悬液与相容性溶质按比例混合均匀，加入到灭菌后的包埋材料溶液中，混合均匀后挤出，滴入CaCl₂水溶液中，交联得珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl₂溶液即得；所述菌种菌悬液相对于酱醅或酱醪的质量分数为0.1～0.4%；所述相容性溶质相对于酱醅或酱醪的质量分数为0～0.3%。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述相容性溶质相对于酱醅或酱醪的质量分数为0.2～0.3%。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述耐盐产香微生物菌悬液终浓度为10⁷cfu/100g酱醪或酱醅以上；所述相容性溶质终浓度为0.2g/100g酱醪或酱醅以上。