CN102942919B - 罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg2+荧光探针的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针在水中或血清中Hg²⁺检测中的应用，其中所述罗丹明B硫代双酰肼衍生物结构式如式（I）所示，所述Hg²⁺检测是利用罗丹明B硫代双酰肼衍生物与Hg²⁺发生反应生成发荧光的结构式如式（II）所示的罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物实现。本发明可以选择性地使罗丹明B硫代双酰肼衍生物即Hg²⁺荧光探针与分析物汞离子反应，灵敏度，强荧光增强效应明显，有效实现了对汞离子的非破坏性的和快速的检测，具有重要而广泛的社会价值和经济效益。

Description

罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg2+荧光探针的应用

技术领域

本发明涉及一种罗丹明B硫代双酰肼衍生物的应用，尤其涉及一种罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针的应用，利用罗丹明B硫代双酰肼衍生物（结构式如式（I）所示）与汞离子发生反应生成发荧光的罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物（结构式如式（II）所示）可作为Hg²⁺荧光探针检测水中或血清中Hg²⁺荧光成像。 

背景技术

汞是高毒性的过渡金属及重金属元素，是环境中最危险和最普遍的污染物之一。汞通过自然或人为方式以各种各样的形态进入环境，并可以通过空气、食物、饮用水以及化妆品等多种途径进入人体。汞为人体非必需元素，是公认的人体神经系统毒素。另外还对肾脏，免疫，生殖等多个机体系统造成损害。二十世纪五十年代日本水俣病就是典型的汞中毒。鉴于汞对环境以及人类健康造成的危害，汞离子检测显得尤为重要。 

检测金属离子有原子吸收光谱，电感耦合等离子体质谱，X射线荧光光谱，冷蒸气原子荧光光谱等方法，但它们一般需要进行复杂的多级样本制备或需要精密仪器。而罗丹明B荧光探针具有摩尔消光系数大，量子产率高，背景干扰小等优点，可以选择性地与分析物作用，通过简单的荧光增强或淬灭响应，发生荧光信号转换，实现对金属离子的非破坏性的和快速的检测。因此，开发新型罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针实现对水或血清中Hg²⁺荧光显微成像和检测具有重要意义。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种新型罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针的应用。 

本发明所述罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针在水中或血清中Hg²⁺检测中的应用，其中所述罗丹明B硫代双酰肼衍生物结构式如式（I）所示，所述Hg²⁺检测是利用罗丹明B硫代双酰肼衍生物与Hg²⁺发生反应生成发荧光的结构式如式（II）所示的罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物实现； 

上述罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的制备可按照申请人先前申请的专利【申请号：201210204864.6】介绍的方法制备。 

在0.2当量四丁基溴化铵的作用下，通过罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的二氯甲烷溶液与2当量氯化汞水溶液在回流条件下经两相反应，可制备得到罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物（II）。 

上述反应路线如下式所示： 

通过罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）与氯化汞反应合成罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物（II），并对罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物（II）进行详细表征确定其结构，证实罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）与Hg²⁺作用机理为：Hg²⁺作用下诱导螺环断裂开环，脱硫化汞，环化生成噁二唑环，且环合产物为罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物（II）。 

本发明所述罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）作为Hg²⁺荧光探针与汞离子的反应具有较高的选择性和灵敏度，可用于检测水或血清中汞离子的存在。 

配制上述罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）的DMF/HEPES缓冲液（20mM HEPES，pH=7.2，2:3，体积比）的溶液，分别定量加入微升级的NaNO₃,Mg(NO₃)₂·6H₂O,Al(NO₃)₃·9H₂O,KNO₃,Ca(NO₃)₂·4H₂O,Cr(NO₃)₃·9H₂O,50%(wt.)Mn(NO₃)₂(aq.),Fe(NO₃)₃·9H₂O,Co(NO₃)₂·6H₂O,Ni(NO₃)₂·6H₂O,Cu(NO₃)₂·3H₂O,Zn(NO₃)₂·6H₂O,AgNO₃,Cd(NO₃)₂·4H₂O,Ba(NO₃)₂,HgCl₂和Pb(NO₃)₂的水溶液。通过紫外可见分光光度法和（或）荧光分光光度法测试对不同金属离子的选择性、响应能力以及其它金属离子的干扰情况。结果显示罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）对Hg²⁺具有非常好的选择性，对Hg²⁺的荧光检测限为2.1×10^-8M，加入汞离子前后对照显示荧光增强23倍，具有较强荧光增强效应。 

本发明所述罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）作为Hg²⁺荧光探针还可用于血清中Hg²⁺检测。首先确定标准工作线，根据工作线确定实验鼠血清中汞离子浓度。并且通过荧光显微镜观察汞离子浓度的变化情况，判断血清中汞离子的存在。 

本发明提供的新型罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针的应用，可以选择性地使罗丹明B硫代双酰肼衍生物即Hg²⁺荧光探针与分析物汞离子反应，灵敏度，强荧光增强效应明显，有效实现了对汞离子的非破坏性的和快速的检测，具有重要而广泛的社会价值和经济效益。 

附图说明

图1为将10当量的不同金属离子中分别加入10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物 （1）的DMF/HEPES缓冲溶液的紫外吸收光谱。 

图2为在可见光下，将10当量的不同金属离子分别加入10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）的DMF/HEPES缓冲溶液后，溶液的颜色变化。自左至右依次为：罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）的空白缓冲溶液,加Na⁺,Mg²⁺,Al³⁺,K⁺,Ca²⁺,Cr³⁺,Mn²⁺,Fe³⁺,Co²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Ba²⁺,Pb²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺离子的溶液。 

图3为分别将10当量的Ni²⁺,Ag⁺,Hg²⁺和Cu²⁺加入10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）的DMF/HEPES缓冲溶液后，溶液的荧光对比。 

图4为10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的空白缓冲溶液以及分别将10当量的Na⁺,Mg²⁺,Al³⁺,K⁺,Ca²⁺,Cr³⁺,Mn²⁺,Fe³⁺,Co²⁺,Ni²⁺,Cu²⁺，Zn²⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Ba²⁺,Pb²⁺和Hg²⁺加入10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的缓冲溶液的荧光光谱。插入图为罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）以及加入Hg²⁺之后溶液的荧光颜色变化。(激发波长(λ_ex)，565nm；激发狭缝宽度,10.0nm；发射波长(λ_em),590nm；发射狭缝宽度,10.0nm)。 

图5为向10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的缓冲溶液中分别加入10μM Hg²⁺（黑色柱），以及10μM的Hg²⁺与50μM的其它金属离子共存（灰色柱）条件下相对荧光强度的变化。(激发波长(λ_ex)，565nm；激发狭缝宽度,10.0nm；发射波长(λ_em),590nm；发射狭缝宽度,10.0nm)。 

图6为将0～5.0当量的Hg²⁺分别加入10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的缓冲溶液的紫外吸收光谱。插入图为在567nm波长下，化合物1吸光度随Hg²⁺浓度的变化曲线。 

图7为将0.01～5.0当量的Hg²⁺分别加入10μM的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的DMF/HEPES缓冲溶液的荧光光谱。插入图为在590nm波长下，罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）的相对荧光强度随Hg²⁺浓度的变化曲线。(激发波长(λ_ex)，565nm；激发狭缝宽度,10.0nm；发射狭缝宽度,10.0nm)。 

图8为实验鼠血清中Hg²⁺浓度与Hg²⁺荧光成像。（A）*,p＜0.05与对照组相比；#,p＜0.05与0.5mg/kg/天(同一天)相比;,p＜0.05与1mg/kg/天((同一天))相比;&,p＜0.05与5mg/kg/天(同一天)相比;$,p＜0.05vs 10mg/kg/天(同一天),n=6.(B):实验鼠血清的荧光成像。血清来自注射HgCl₂两天后的实验鼠。 

具体实施方式

实施例1 

利用罗丹明B硫代双酰肼衍生物与Hg²⁺发生反应生成发荧光的罗丹明B-1,3,4-噁二唑衍生物 

罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）的制备可按照申请人先前申请的专利【申请号：201210204864.6】介绍的方法制备。 

将50mL含650mg(1.0mmol)硫代双酰肼(I)的二氯甲烷溶液加入至30mL含543mg(2.0mmol)HgCl₂的水溶液中，然后向上述混合液中加入67mg(0.2mmol)四丁基溴化铵，在搅拌下反应液加热至回流，继续反应1.5小时，然后冷却降温。反应液用50mL二氯甲烷稀释，静置分层，分液，有机相水洗后，用无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液浓缩得到紫黑色固体445mg，即为产物罗丹明B-1,3,4-噁二唑衍生物（II）。产率：68.3%；熔点： 138-143℃。 

红外光谱测定：IR(KBr),υ:2973,2929,2870,1701,1649,1589,1528,1465,1413,1392,1336,1273,1246,1179,1131,1072,1010,976,921,820,759,722,682cm^-1。 

核磁共振氢谱测定：¹H NMR(CDCl₃,400MHz),δ(ppm):1.30(t,12H,NCH₂CH₃,J=7.2Hz),3.58(q,8H,NCH₂CH₃,J=7.2Hz),3.81(s,3H,OCH₃),6.76–6.78(m,4H,Xanthene–H),6.90(d,2H,Ar–H,J=8.8Hz),7.09–7.11(m,2H,Xanthene–H),7.39(d,1H,Ar–H,J=7.7Hz),7.48–7.52(m,2H,Ar–H),7.71–7.75(m,2H,Ar–H),8.10(d,1H,Ar–H,J=8.8Hz),8.32(d,1H,Ar–H,J=7.5Hz),11.24(s,1H,CONH)。 

核磁共振碳谱测定：¹³C NMR(CDCl₃,100MHz),δ(ppm):63.3,158.3,156.6,155.6,131.2,131.0,130.9,130.8,130.7,130.1,129.2,123.2,114.2,114.1,113.8,96.6,55.5,46.1,12.7。 

高分辨质谱测定：HRESIMS calcd for M⁺C₃₇H₃₈N₅O₄ ⁺：616.2924found：616.2904。 

上述罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）与汞离子反应生成罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物（II）的反应路线如下式所示： 

实施例2 

罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针的验证 

用微量注射器分别向盛有10mL配制好的罗丹明B硫代双酰肼衍生物（1）的DMF/HEPES缓冲溶液（20mM HEPES，pH=7.2，2:3，体积比）的溶液中加入10当量Na⁺,Mg²⁺,Al³⁺,K⁺,Ca²⁺,Cr³⁺,Mn²⁺,Fe³⁺,Co²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Ba²⁺,Pb²⁺,Hg²⁺和Cu²⁺离子水溶液，分别进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试。 

结果显示：罗丹明B硫代双酰肼衍生物（I）对Hg²⁺具有非常好的选择性，加入汞离子前后对照显示荧光增强23倍，具有较强荧光增强效应。（见图4） 

实施例3 

罗丹明B硫代双酰肼衍生物作为Hg²⁺荧光探针对血清中Hg²⁺荧光成像测试 

用HgCl₂按照不同剂量喂养实验鼠1天或两天，然后抽血离心后取血清，室温下5分钟内用汞离子探针罗丹明B硫代双酰肼衍生物对血清中Hg²⁺进行检测和荧光成像。 

结果见图8。 

Claims (1)

1.式（I）所示化合物作为Hg²⁺荧光探针在检测水中或血清中Hg²⁺的应用，其中所述检测Hg²⁺的应用中是利用式（I）所示化合物与Hg²⁺发生反应生成发荧光的结构式如式（II）所示的罗丹明B—1,3,4-噁二唑衍生物实现；

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