CN105461682B

CN105461682B - 可定量检测汞离子和甲基汞的小分子荧光探针

Info

Publication number: CN105461682B
Application number: CN201410452757.4A
Authority: CN
Inventors: 杨有军; 张子谦
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: CN105461682A

Abstract

本发明提供可定量检测汞离子和甲基汞的小分子荧光探针，含有所述小分子荧光探针的检测组合物、检测试剂盒，以及使用所述小分子荧光探针或检测组合物检测汞离子和/或甲基汞的方法。本发明的小分子荧光探针的结构式如下式I所示，其前体化合物的结构式如式II所示:式I和II中，R₁和R₂独立选自任选取代的C1‑C6直链或支链烷基。

Description

可定量检测汞离子和甲基汞的小分子荧光探针

技术领域

本发明涉及汞离子和甲基汞的检测，具体涉及可定量检测汞离子和甲基汞的小分子荧光探针。

背景技术

汞是一种广泛存在于环境中的重金属元素，主要来源包括海底火山爆发、化石燃料燃烧以及固体废料焚烧。汞在氯碱工业、造纸业、采金业中被广泛应用。汞还被用来制造电气开关、医疗设备、荧光灯、弧光灯、红外敏感半导体HgCdTe合金、工业催化剂、银汞合金、防污防霉涂料、化妆品、杀虫剂和防腐剂等。部分工业用汞被最终排放到了环境中造成污染。

环境中的汞主要以汞单质(Hg)、汞离子(Hg²⁺)及甲基汞(MeHg⁺)的形式存在。液态的汞单质毒性很低，主要是它无法通过皮肤接触或者胃肠道被人体吸收。然而，它的蒸汽很容易通过肺泡膜进入人体并在红细胞及肝脏细胞中被过氧化氢酶氧化成剧毒的Hg²⁺。大气中的汞单质可以被空气中的臭氧、羟基自由基等氧化为Hg²⁺，然后随降雨到地面及土壤，并最终在各类水体中积累。部分水中的Hg²⁺被水生微生物转成为对人体毒性更大的MgHg⁺。甲基汞具有强亲脂性，并可以通过食物链积累。最终，汞离子和甲基汞可以通过呼吸，饮水或进食等途径进入人体。

Hg²⁺和MeHg⁺可以抑制包括硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化酶、硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶等含硒酶。而这些酶在预防及修复体内的各种氧化剂对机体的损伤起关键作用。汞也可以抑制钠离子钾离子通道的三磷酸腺苷酶来扰乱细胞能量代谢。甲基汞与半胱氨酸结合可以通过胎盘并对发育中的胎儿神经发育造成伤害，导致死胎或者生育畸形。汞中毒的临床症状包括牙龈炎、呕吐、腹泻、甲状腺肿大、炎症、呼吸困难、心理变化、感知障碍、神经紊乱、循环系统混乱或者肾衰竭。

大范围的汞中毒在日本、伊朗、巴基斯坦、危地马拉、加纳、前南斯拉夫、阿根廷等国家发生，造成了严重的后果。因此，限制工业中汞的使用已经达成全球性的一致认同，并通过实时监控环境、水及食物中的汞离子和甲基汞弄态度对于保障公众的健康具有重要意义。

发明内容

我们开发了一系列的小分子荧光探针，可用于定量检测汞离子和甲基汞。相比已有探针，本发明的小分子荧光探针对二者汞离子和甲基汞都有极高的检测灵敏性，对汞离子和甲基汞的检测限分别达到了4.6pM和160pM。

因此，本发明第一方面提供下式I所示的化合物：

式中，R₁和R₂独立选自任选取代的C1-C6直链或支链烷基。

在一个具体实施例中，R₁和R₂各自独立选自C1-C4直链或支链烷基。

在一个具体实施例中，R₁和R₂各自独立选自任选地被1－2个选自羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)、C1-C4烷氧基、卤素、羟基、以及C1-C4烷氧基羰基的取代基取代的C1-C4直链或支链烷基。

在一个具体实施例中，R₁和R₂各自独立选自任选地被1－2个选自羧基、氨基和C1-C4烷氧基羰基的取代基取代的C1-C4直链或支链烷基。

在一个具体实施例中，R₁和R₂各自独立选自任选地被1－2个选自羧基、氨基和C1-C3烷氧基羰基的取代基取代的甲基、乙基和丙基。

在一个具体实施例中，R₁和R₂各自独立选自甲基、乙基、-CH₂-COOMe、-CH₂-COOH和-CH₂NH₂。

在一个具体实施例中，式I化合物选自：

本发明第二方面提供一种检测组合物，该组合物含有本发明式I的化合物和溶剂。

在一个具体实施例中，所述溶剂为溶解本发明化合物并适用于汞离子和/或甲基汞的检测的各种溶剂。

在一个具体实施例中，所述溶剂为含有HEPES缓冲液和DMSO的混合溶液。

在一个具体实施例中，所述HEPES缓冲液的浓度为5-15mM，pH＝7.4。

在一个具体实施例中，所述HEPES缓冲液的浓度为10mM，pH＝7.4。

在一个具体实施例中，HEPES缓冲液与DMSO的体积比为85～98：15～2。

在一个具体实施例中，HEPES缓冲液与DMSO的体积比为95：5。

在一个具体实施例中，所述检测组合物中，本发明化合物的浓度为5-50μM，优选为5-20μM。

在一个具体实施例中，所述检测组合物含有浓度为5－15μM的本发明式I化合物、HEPES缓冲液与DMSO，其中，HEPES缓冲液的浓度为10mM，pH＝7.4，HEPES缓冲液与DMSO的体积比为90～98：10～2。

本发明第三方面提供一种检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明式I的化合物，或本发明的检测组合物。

在一个具体实施例中，所述试剂盒还包括用于指导检测样品中的汞离子和甲基汞的说明书。

本发明还提供一种检测样品中的汞离子和/或甲基汞的方法，所述方法包括使本发明式I化合物或本发明检测组合物与样品接触，并检测紫外可见光谱或荧光发射光谱信号。

在一个具体实施例中，所述检测方法包括检测紫外可见光谱在350纳米处的吸收强度。

在一个具体实施例中，所述检测方法包括检测荧光发射光谱中410纳米处的发射强度。

在一个具体实施例中，所述检测方法中，紫外可见光谱在350纳米处的吸收强度的汞离子和/或甲基汞的浓度成正比。

在一个具体实施例中，所述检测方法中，荧光发射光谱中410纳米处的发射强度和汞离子和/或甲基汞的浓度成正比。

本发明还包括下式II化合物：

式中，R₁和R₂独立选自任选取代的C1-C6直链或支链烷基。

在一个具体实施例中，式II化合物选自：

本发明还包括式II化合物在制备式I化合物中的用途。

附图说明

图1：本发明探针Hg410b及其检测产物1的化学结构。

图2：a)探针Hg410b和Hg²⁺的荧光滴定图；b)探针Hg410b和Hg²⁺的荧光滴定中410b纳米处荧光发射强度随Hg²⁺当量变化情况；c)探针Hg410b和MeHg⁺的荧光滴定图；d)探针Hg410b和MeHg⁺的荧光滴定中410b纳米处荧光发射强度随MeHg⁺当量变化情况。

图3：探针Hg410b检测Hg²⁺和MeHg⁺的动力学曲线。

图4：向探针Hg410a的溶液中加入含有汞离子的样品，固定荧光激发波长360纳米，检测在410纳米处的荧光发射强度随汞离子当量的变化情况。

具体实施方式

本发明涉及使用本发明式I化合物检测样品中的汞离子和/或甲基汞：

式中，R₁和R₂独立选自任选取代的C1-C6直链或支链烷基。

“烷基”在本文中指支链或直链饱和烃基。在一些实施方式中，烷基含有 1－6个碳原子，在优选的实施例中，烷基含有1－4个碳原子，在更优选的实施例中，烷基有1－3个碳原子。烷基的例子有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等。

“烷氧基”指被烷基取代的氧基，通常含有1－6个碳原子，优选含有1－4个碳原子，更优选含有1－3个碳原子。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基等。

“羰基”指“-C(O)-”基团。

“任选取代”指基团可任选地被1－3个，优选1－2个，更优选1个取代基取代；取代基可以是例如羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)、C1-C4烷氧基、卤素、羟基、以及C1-C4烷氧基羰基。

“卤素”指氟、氯、溴和碘，优选氟和氯。

本文中，取代基优选选自羧基、氨基和C1-C4烷氧基羰基。

因此，R₁和R₂优选各自独立选自任选地被1－2个选自羧基、氨基和C1-C4烷氧基羰基的取代基取代的C1-C4直链或支链烷基。

更优选地，R₁和R₂各自独立选自任选地被羧基、氨基和C1-C3烷氧基羰基取代的甲基、乙基和丙基。

本发明式I化合物可按以下步骤制备：

探针可以从化合物1出发予以合成。首先利用POCl₃,DMF在化合物1上引入醛基得到化合物2。再通过Suzuki耦联反应合成化合物3。在路易斯酸催化下，利用乙二硫醇保护醛基得到化合物4，最后再利用锌粉把硝基还原为氨基得到所需探针。

本发明提供一种检测组合物，该组合物含有本发明式I的化合物和溶剂。溶剂可以是各种溶解本发明化合物并适用于汞离子和/或甲基汞的检测的溶剂。这类溶剂包括但不限于含有HEPES缓冲液和DMSO的混合溶液。HEPES缓冲液的浓度可为5-15mM，pH通常为7.4。在具体实施例中，所使用的HEPES缓冲液的浓度可为10mM，pH＝7.4。

溶剂中，HEPES缓冲液与DMSO的体积比通常为85～98：15～2，例如HEPES缓冲液与DMSO的体积比为95：5。

检测组合物中，本发明化合物的浓度通常为5-50μM，优选为5-20μM。

在一个具体实施例中，本发明的检测组合物含有浓度为5－15μM的本发明式I化合物、HEPES缓冲液与DMSO，其中，HEPES缓冲液的浓度为10mM，pH＝7.4，HEPES缓冲液与DMSO的体积比为90～98：10～2。

本发明还提供一种检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明式I的化合物，或本发明的检测组合物。本发明的检测试剂盒还可包括用于指导检测样品中的汞离子和甲基汞的说明书。

本发明提供一种检测样品中的汞离子和/或甲基汞的方法，所述方法包括使本发明式I化合物或本发明检测组合物与样品接触，并检测紫外可见光谱或荧光发射光谱信号。

可检测紫外可见光谱在350纳米处的吸收强度，其中，紫外可见光谱在350纳米处的吸收强度的汞离子和/或甲基汞的浓度成正比。

也可检测荧光发射光谱中410纳米处的发射强度，其中荧光发射光谱中410纳米处的发射强度和汞离子和/或甲基汞的浓度成正比。

样品可以是来自环境的待测样品，包括例如工业废水、土壤、植物部分(例如怀疑被汞污染的植物的叶子、树干、根等)，也可以是怀疑受汞污染的大气等。

本发明的检测是体外检测方法。可采用本领域常规的荧光仪进行检测。

在使本发明化合物或检测组合物与样品接触之前，可先对样品进行预处理，包括，例如对于土壤溶入纯净水中，然后过滤除去残渣等等。这些预处理可根据不同检测对象而不同，但都属于本领域的常规预处理手段。

下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，这些具体实施例仅仅是阐述性的，本发明并不限于这些具体实施例。实施例中所使用到的各种试剂、反应条件等，除非另有说明，否则为本领域常规使用的试剂和反应条件。

实施例1：化合物Hg410a和Hg410b的制备

按以下步骤制备化合物Hg410a和Hg410b：

化合物2a或2b的合成与鉴定数据。

在室温下将POCl₃(1.3eq)加入干燥的DMF 15mL，反应30min。将化合物1a或1b(1eq)的10mL DMF溶液加入反应液中，80℃反应6小时。将反应混合物用隔膜泵浓缩后，溶于50mL EA用50mL去离子水萃洗三次后，MgSO₄干燥，减压浓缩通过柱层析纯化。PE：EA＝20:1.产率：黄色固体73.0％。化合物2a为已知化合物。

化合物2b:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.11(s,1H),7.80(d,J＝8.8Hz,1H),6.81(d,J＝2.4Hz,1H),6.62(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.14(s,2H),3.76(s,3H),3.14(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ190.3,169.8,153.7,131.2,129.7,123.3,115.5,110.9,53.7,52.4,39.7。

化合物3a或3b的合成与鉴定数据。

化合物2a或2b(1当量)与2-硝基苯硼酸(1.5当量)，Na2CO3(2当量)Pd(PPh3)4(0.004当量)加入DMF 30ml，3mLH2O的溶液中，氩气保护。加热至100℃反应12小时。反应结束后用150mLH₂O稀释，30mL乙酸乙酯萃取三次取有机层，再用饱和食盐水50mL萃洗三次。MgSO4干燥后，减压浓缩通过柱层析纯化。PE：EA＝6:1.产率：黄色固体71.5％。

化合物3a:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.55(s),8.06(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(d,J＝8.9Hz,1H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),7.40(d, J＝7.4Hz,1H),6.74(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),6.35(d,J＝2.3Hz,1H),3.49-3.40(m,4H),2.24(t,J＝7.8Hz),1.22(t,J＝7.2Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ188.8,132.7,132.3,132.3,128.7,124.1,111.2,110.5,44.7,12.5。

化合物3b:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.51(s,1H),7.99(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.79(d,J＝8.8Hz,1H),7.57(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),7.49(td,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.30(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.67(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.31(d,J＝2.8Hz,1H),4.12(d,J＝18.0Hz,1H),4.03(d,J＝18.4Hz,1H),3.68(s,3H),3.07(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ189.2,170.1,152.4,149.0,142.5,134.7,32.5,132.3,128.9,124.2,123.8,112.1,111.2,53.9,52.4,39.7。

化合物4a和4b的合成与鉴定数据。

化合物3a或3b(1当量)溶于无水DCM，加入乙二硫醇(1.2eq)，再加入BF3Et2O(0.5eq)室温反应4H。加入Na2CO3 30ml萃洗后取有机相，MgSO4干燥后，减压浓缩通过柱层析纯化。PE：EA＝8:1.产率：4.50g黄色固体97.4％。

化合物4a:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.98(d,J＝8.1Hz,1H),7.81(d,J＝8.9Hz,1H),7.65(ddd,7.6,1.2Hz,1H),7.54(ddd,8.0,1.6Hz,1H),7.46(dd,J＝7.2,1.2Hz,1H),,6.75(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),6.23(d,J＝2.7Hz,1H),5.36(s,1H),3.54-3.45(m,2H),3.38-3.27(m,4H),3.22-3.18(m,2H),1.14(t,J＝7.1Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ149.4,146.8,137.6,135.8,132.4,132.1,130.1,128.40,123.9,122.7,112.5,110.5,53.7,44.3,40.2,12.6。

化合物4b:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.98(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),7.82(d,J＝8.8Hz,1H),7.63(ddd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.51(ddd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.41(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.74(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.24(d,J＝2.8Hz,1H),5.31(s,1H),4),4.08(d,J＝18.0Hz,1H),3.98(d,J＝18.0Hz,1H),3.71(s,3H),3.55-3.40(m,2H),3.27-3.15(m,2H),3.02(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.2,149.2,147.9,137.67,135.5,132.5,132.3,130.1,128.6,125.3,124.1,113.0,111.3,54.2,53.4,52.1,40.2,40.2,39.5。

化合物Hg410a与Hg410b的合成与鉴定数据。

化合物13(2.00g)溶于100mL MeOH，加入Zn粉(3.23g 10eq)，剧烈搅拌后加入20mL饱和氯化铵溶液。TLC监测反应结束后，旋干溶剂，加入DCM 30mL，H2O 20mL萃洗后，取有机相，MgSO4干燥后，减压浓缩通过柱层析纯化。PE：EA＝4:1.产率：1.42g白色固体76.7％。

化合物Hg410a:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(d,J＝8.8Hz,1H),7.21(ddd,8.0,1.2Hz,1H),7.12(dd,7.2,1.2Hz,1H),6.85(ddd,7.2,0.4Hz,1H),6.79(d,8.0Hz,1H),7.12(dd,8.8,2.8Hz,1H),6.43(d,J＝2.8Hz,1H),5.53(s,1H),3.64(br,2H),3.55-3.42(m,2H),3.37(t,7.2Hz,4H),3.42-3.11(m,2H),1.17(t,J＝6.8Hz,6H),¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ147.4,144.0,138.9,130.5,130.2,128.6,126.6,123.8,118.2,115.1,112.0,53.1,44.3,40.2,12.7。

化合物Hg410b：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.82(d,J＝8.8Hz,1H),7.17(ddd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.06(dd,J＝7.2,1.2Hz,1H),6.81(t,J＝7.2Hz,1H),6.75(d,J＝7.6Hz,1H),6.72(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.44(d,J＝2.8Hz,1H),5.49(s,1H),4.06(s,2H),3.71(s,3H),3.57(br s,2H),3.57-3.40(m,2H),3.25-3.15(m,2H),3.05(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.2,148.5,144.0,138.9,130.5,130.3,128.7,126.6,126.1,118.1,115.2,113.0,112.6,77.4,77.0,76.7,54.1,52.8,52.0,40.2,39.5。

实施例2：探针的荧光滴定

探针在用荧光检测时检测灵敏度最高，因此本发明在实际的检测中用到了荧光仪。具体实验过程如下：将探针410b溶在HEPES缓冲液(50mM,pH＝7.4)：DMSO(v/v＝95:5)混合溶液中，其中探针浓度为10μM。把含有汞离子或者甲基汞的水溶液加入此探针溶液中，并检测荧光发射信号，其中，荧光发射光谱中410纳米处的发射强度和汞离子/甲基汞的浓度成正比。可使用各类单发射波长的荧光分光光度计，荧光光谱仪，或者是酶标仪来检测荧光发生信号，不同厂商的仪器设备均满足检测需求。在检测荧光信号时，所选取的激发波长是360纳米。

结果显示在图2中。探针本身在被360纳米的光激发时，不会释放出荧光。当有Hg²⁺或MeHg⁺时，可以看到在410纳米有荧光发射，荧光发射的强度和 Hg²⁺或MeHg⁺的浓度成线性相关。一当量探针Hg410b可以反应一当量Hg²⁺或者两当量的MeHg⁺。

实施例3：探针的检测动力学

将探针Hg410a或Hg410b溶在HEPES缓冲液(50mM,pH＝7.4)：DMSO(v/v＝95:5)混合溶液中，其中探针浓度为10μM。把含有汞离子或者甲基汞的水溶液加入探针溶液中，固定荧光激发波长为360纳米，荧光发射波长为410纳米，并持续观察410纳米处的荧光发射信号强度随时间的变化情况。具体的荧光检测仪器可以是各类单发射波长的荧光分光光度计，荧光光谱仪，或者是酶标仪。不同厂商的仪器设备均满足检测需求。

图3显示，探针Hg410b的检测动力学非常快，仅仅需要2－5秒钟，远超出现有文献中已有探针的检测速率。下图中的探针是目前所报导(并明确测定检测动力学，Chem.Commun.20212，48，5094)的汞离子荧光探针中最快的一个，但检测需要大约3分钟：

现有的其它探针检测速度慢，一些甚至超过1个小时反应仍然不能完全。

检测速率的提升带来的好处有两点：第一，检测通量可以极大的提高；第二，检测的灵敏度大幅提升。据测量，Hg410b可以准确检测的Hg²⁺和MeHg⁺的最低浓度分别达到了4.6pM和160pM，较现有探针(例如，Chem.Rev.2013,113,192-270中所罗列探针)提升了三个数量级。

图4显示向探针Hg410a的溶液中加入含有汞离子的样品，固定荧光激发波长360纳米，检测在410纳米处的荧光发射强度随汞离子当量的变化情况。

虽然已以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，上述具体实施例仅仅是阐述性的，并不用于限定本发明的保护范围。在不偏离本申请的精神的情况下对本发明做出的任何修改，都应包括在本发明的范围之内。

Claims

1.下式I或II所示的化合物：

式I和II中，

R₁和R₂独立选自任选被1或2个选自羧基、氨基和C1-C4烷氧基羰基的取代基取代的C1-C6直链或支链烷基。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₁和R₂各自独立选自任选地被1个C1-C4烷氧基羰基取代的C1-C4直链或支链烷基。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₁和R₂各自独立选自任选地被1个C1-C3烷氧基羰基取代的甲基、乙基和丙基。

4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₁和R₂各自独立选自甲基、乙基、-CH₂-COOMe、-CH₂-COOH和-CH₂NH₂。

5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1选自C1-C4直链或支链烷基；R2选自C1-C4直链或支链烷基和被1个C1-C3烷氧基羰基取代的C1-C4直链或支链烷基。

6.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，R1选自甲基、乙基和丙基；R2选自甲基、乙基和丙基和被1个C1-C3烷氧基羰基取代的甲基、乙基和丙基。

7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：

8.一种检测组合物，该组合物含有权利要求1－7中任一项所述的式I化合物和溶剂。

9.如权利要求8所述的检测组合物，其特征在于，所述溶剂为含有HEPES缓冲液和DMSO的混合溶液。

10.如权利要求9所述的检测组合物，其特征在于，HEPES缓冲液与DMSO的体积比为85～98：15～2。

11.如权利要求8或9所述的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物含有浓度为5－15μM的所述式I化合物、HEPES缓冲液与DMSO，其中，HEPES缓冲液的浓度为5－15mM，pH＝7.4，HEPES缓冲液与DMSO的体积比为90～98：10～2。

12.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1－7中任一项的式I化合物，或权利要求8－11中任一项所述的检测组合物。

13.一种检测样品中的汞离子和/或甲基汞的方法，其特征在于，所述方法包括使权利要求1－7中任一项所述的式I化合物或权利要求8－11中任一项所述的检测组合物与样品接触，并检测紫外可见光谱或荧光发射光谱信号。