CN103333682B - 一种比例型近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种比例型近红外荧光探针，其化学名称为氮杂氟硼二吡咯-硼酸（aza-bodipy-BA），它具有如下结构式，其光稳定性好、在pH小于7.5时对pH不敏感，非常有利于细胞成像分析和测量。利用该探针，可以通过比例荧光的方法对细胞内H2O2的浓度进行检测。由于反应机理是通过H2O2与硼酸反应导致荧光强度的变化，因此也大大提高了对H2O2的选择性。本发明还公开了所述比例型近红外荧光探针氮杂氟硼二吡咯-硼酸的制备方法和其在检测H2O2上的应用。
Description
技术领域
本发明属于探针技术领域，具体设计一种比例型近红外荧光探针氮杂氟硼二吡咯-硼酸（aza-bodipy-BA）及其制备方法和应用。
背景技术
在生物体内H2O2是重要的活性氧(ROS)之一，可以调节人体的免疫系统，也与人体衰老以及癌症等各种各样的疾病息息相关1-7。近年来人们开始关注发展新的化学方法来研究H2O2以及其他ROS在生理和病理上所起的作用。其中引起了人们广泛关注的方法是使用选择性高的荧光探针来跟踪细胞内H2O2的化学过程8-16。
目前各种荧光指示剂已经用于H2O2的检测，比如二氢类似物2,7-二氯二氢荧光素(DCFH)17,18、Amplex Red19、二氢罗丹明20、基于磷化氢的荧光探针21 ,2 2、镧系络合物 23，探针与H2O2反应释放荧光团或发射团24-26。但是目前用于检测H2O2的荧光探针，有很多局限性，比如，DCFH是常用于检测细胞内ROS的荧光团，但是在连续光照下它容易被氧化，这样就增加背景荧光。另外一些探针，由于对H2O2的选择性不够高，因而受到其他ROS的干扰较大。激发在紫外光范围内会损伤样品活性，也会受到细胞本身自发荧光的干扰。而且，用turn-on的荧光探针来定量分析细胞内H2O2的浓度非常困难，因为荧光强度受到仪器功率以及探针浓度的影响很大，导致检测不准确。理想的荧光探针应该有一定的细胞穿透能力，有较强的专一性，荧光强度较强，光稳定性好。在近红外范围内，用比例法可以很好的降低来自样品本身以及检测过程中不确定因素的干扰。
众所周知，BODIPY类荧光染料有很多优点，比如荧光强度高，光稳定性好，发射带宽窄，结构可修饰性强等优点。然而，BODIPY荧光染料通常吸收和发射都在紫外可见光范围内，虽然可以通过增加扩展共轭体系使激发和发射波长有所红移，但是合成步骤很复杂，波长变化有限，而且这类探针的水溶性相对较差27。用氮原子取代BODIPY次甲基桥上的碳原子，生成的化合物通常被称为aza-bodipy，和BODIPY类衍生物相比，aza-bodipy紫外吸收会有大约90nm的红移，在吡咯环上加上苯并环也可以达到红移的效果。Aza-bodipy尺寸较小，水溶性好，有较大的斯托克斯位移可以达到近红外范围。但是与BODIPY类衍生物相比，对于aza-bodipy类化合物的研究还较少，这主要是由于aza-bodipy以异吲哚为前体的制备过程很困难，在通常的条件下，这样的前体由于反应活性较高因而极不稳定28-30。不久前，我们合成了一系列基于硼酸 的BODIPY衍生物，用于检测单糖和多糖31。在BODIPY母核中间位置上接上苯硼酸，当糖类分子与硼酸结合后，探针的荧光强度就会发生变化，这是由于BODIPY母核与中间位置上的苯硼酸是相互垂直的，因此是分别独立的两部分。本工作目的就是设计并合成比例荧光探针，通过在荧光团的3,5位上进行修饰连接上了苯硼酸。当硼酸有所改变的时候就会导致探针的激发能级的改变，因此荧光光谱图上就会呈现出比例荧光的变化。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提出一种对H2O2的选择性高的比例型近红外荧光探针氮杂氟硼二吡咯-硼酸（aza-bodipy-BA）。本发明还要解决的技术问题是上述比例型近红外荧光探针氮杂氟硼二吡咯-硼酸（aza-bodipy-BA）的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种比例型近红外荧光探针aza-bodipy-BA，其化学名称为氮杂氟硼二吡咯-硼酸，其具有下述结构式：
所述的比例型近红外荧光探针aza-bodipy-BA的制备按如步骤进行：
（1）将1mol4-溴苯乙酮溶于2.44L乙醇中，加入2.5M氢氧化钠水溶液，室温下滴加1mol苯甲醛的乙醇溶液，滴加完毕待有大量固体析出后，室温反应20h，水洗固体，用乙醇重结晶，用乙醇洗涤固体后干燥得到黄色固体1-(4-溴)-3-苯丙烯酮（化合物3）；
（2）将0.75mol的1-(4-溴)-3-苯丙烯酮（化合物3）、3.75mol二乙胺和3.75mol硝基甲烷溶于1L甲醇，回流20h，将反应液体积旋至约1/5，倾入等体积冰水中，用4M浓盐酸调pH至3-4，用二氯甲烷（DCM）萃取水相，有机相水洗，饱和NaCl洗涤，Na2SO4干燥，旋干，加入甲醇，用甲醇冲洗滤饼，再用甲醇重结晶得到1-(4-溴苯)-4-硝基-3-苯丁酮（化合物4）；
（3）将0.39mol1-(4-溴苯)-4-硝基-3-苯丁酮（化合物4）和13.65mol醋酸铵加入到3.5L乙醇中，N2保护回流，20h后点板原料消失，停止反应，浓缩乙醇，先用用四氢呋喃：石油醚（THF:PE）体积比=1.5:1，后用甲醇和石油醚洗，得到的蓝黑色固体二溴氮杂四苯基二吡咯次甲染料（化合物5）；
（4）将18mmol二溴氮杂四苯基二吡咯次甲染料（化合物5）、63mmol联硼酸频哪醇酯，7.2mmol Pd(dppf)Cl2、165.24mmol醋酸铵分别加入到500mL四氢呋喃中，氮气下加热回流20h，直到TLC显示反应完全，用石油醚：四氢呋喃（PE:THF）体积比=20:1过柱子，得到二频哪醇乙硼烷氮杂四苯基二吡咯次甲染料（化合物6）；
（5）将7.5mmol二频哪醇乙硼烷氮杂四苯基二吡咯次甲染料（化合物6）溶于无水二氯甲烷中，加入75mmol N,N-二异丙基乙基胺，氮气保护，室温搅拌1h，加入112.5mmol三氟化硼乙醚，搅拌4个小时后，制砂过柱，用石油醚：四氢呋喃（PE:THF）体积比=3:1纯化得到二频哪醇乙硼烷氮杂BODIPY（化合物7）；
（6）将1.33mmol二频哪醇乙硼烷氮杂BODIPY（化合物7）溶于150mL四氢呋喃中，加入2.8mmol二乙醇胺，30min后待不溶固体析出后，过滤，用250mL THF洗涤固体，再加入560mL HCl，1h后悬浮液变均相溶液，乙酸乙酯（EA）萃取干燥，利用甲醇：二氯甲烷（CH3OH:CH2Cl2）体积比=1:20洗脱液经硅胶柱纯化样品，得到aza-bodipy-BA（化合物8）。
本发明通过Suzuki偶联反应将aza-bodipy上的溴原子转化为硼酸，且产率很高。其中，aza-bodipy硼酸酯通过HCl水解成硼酸的产率可以达到73%。
本发明还提供了上述比例型近红外荧光探针aza-bodipy-BA在检测H2O2中的应用。
其中，所述H2O2在水溶剂中、PVC-DOS膜中和细胞中。
有益效果：本发明首次合成了新型近红外荧光探针aza-bodipy-BA，其光稳定性好、在pH小于7.5时对pH不敏感，非常有利于细胞成像分析和测量。通过比例荧光的方法可以对细胞内H2O2的浓度进行检测。由于反应机理是通过H2O2与硼酸反应导致荧光强度的变化，因此也大大提高了对H2O2的选择性。通过在水相、膜相和细胞中对aza-bodipy-BA的研究，推定aza-bodipy-BA可能存在于亲脂性环境中，比如各种细胞器膜中，并且能够定量的检测细胞中H2O2的浓度。
附图说明
图1为化合物3、4、5、6、7、8的合成反应方程式。
图2为在密度为135.9mWcm-2条件下，用波长范围为530～550nm的绿光连续照射浓度为20μM aza-bodipy-BA（乙醇）在最大吸收波长为655nm处紫外吸收光谱的变化。
图3为每隔15min，在652nm激发下，10μM aza-bodipy-BA(乙醇:HEPES=1:1，V:V，pH7.4)在发射峰为687nm处荧光强度的变化曲线。
图4为aza-bodipy-BA(10μM，乙醇:PBS=1:1,V:V)随着pH的变化荧光光谱的变化和荧光强度比值F706/F687对pH的变化曲线。
图5为10μM aza-bodipy-BA对不同ROS的响应。柱形图是在加入ROS后随时间变化（0min、15min、30min、45mim、60min、75min、90min、105min、120min）F727/F687荧光强度比值的变化。其中，除了O2 -浓度为200μM，NO浓度为6×10-2M，其它的ROS浓度均为5mM。
图6为10μM aza-bodipy-BA在pH7.4HEPES缓冲液中对2.5mM H2O2随着时间变化(0min、15min、30min、45mim、60min、75min、90min、105min、120min)相应荧光光谱图的变化，λex：652nm。
图7为10μM aza-bodipy-BA对不同浓度H2O2的响应，溶剂为pH7.4HEPES缓冲溶液。
图8为含有0.5mmol/kg aza-bodipy-BA的PVC-DOS膜对不同浓度H2O2的响应。
图9为含有0.5mmol/kg aza-bodipy-BA的PVC-DOS膜随着时间的变化对10-8MH2O2的响应（绿光激发）。
图10为含有0.5mmol/kg aza-bodipy-BA的PVC-DOS膜随着时间的变化对10-7MH2O2的响应（绿光激发）。
图11为含有0.5mmol/kg aza-bodipy-BA的PVC-DOS膜随着时间的变化对10-6MH2O2的响应（绿光激发）。
图12为含有0.5mmol/kg aza-bodipy-BA的PVC-DOS膜随着时间的变化对10-5MH2O2的响应（绿光激发）。
图13为含有0.5mmol/kg aza-bodipy-BA的PVC-DOS膜随着时间的变化对10-4MH2O2的响应（绿光激发）。
图14为用aza-bodipy-BA培养HeLa细胞后，在波长范围为661～681nm和750～780nm的荧光成像的叠加图，其中，（a）为用20μM的aza-bodipy-BA培养HeLa细胞；（b）为相应的明场图；（c）为在已用aza-bodipy-BA培养过的的HeLa细胞培养基中加入H2O2，外加到H2O2浓度为10-1M，5min中后的成像图；（d）为加入H2O2前后的F750～780nm/F661～681nm荧光强度的比值。
图15为20μM aza-bodipy-BA培养HeLa30min后，外加到H2O2浓度为10-4M，10-3M和10-2M时，探针对H2O2响应的荧光光谱图。
图16为在37℃下，20μM aza-bodipy-BA培养HeLa细胞1h20min(blank)和加入 5μg/ml PMA1.5h后荧光光谱变化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所用的仪器和试剂来源如下：
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)（HEPES）、无水磷酸氢二纳、一水合磷酸二氢钠、无水乙醇、氢氧化钠、30%过氧化氢（H2O2）溶液购买于上海生工。铜粉和65%硝酸购买于南京晚晴。70%叔丁基过氧化氢（TBHP）、5%次氯酸钠购买于J&K。超氧化钾购买于Alfa Aesar。佛波酯（PMA）和过氧化氢酶购买于Sigma。培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素购买于Lifetechnologies。
Perkin-Elmer LS50B荧光光谱仪和α-1900UV/Vis用于研究aza-bodipy-BA在均相中的性质。莱卡TCS SP5双光子共聚焦显微镜和Prism and Reflector Imaging Spectroscopy System(PARISS)和Olympus BX53显微镜用于细胞实验中的光谱分析和成像分析。pH调节用已校正过的Sartorius PB-10pH电极。
实施例1：Aza-bodipy-BA的合成。
Aza-bodipy-BA的合成路线如图1所示，包括如下步骤：
（1）将199.04g1mol的4-溴苯乙酮溶于2.44L乙醇中，加入2.44L2.5M氢氧化钠水溶液，室温下滴加化合物106.12g1mol苯甲醛的乙醇溶液，滴加完毕待有大量固体析出后，室温反应20h，水洗固体，用乙醇重结晶，用乙醇洗涤固体后干燥得到黄色固体1-(4-溴)-3-苯丙烯酮（化合物3）229.8g，产率：80%。
化合物3检测：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.92(d,2H,J＝10.8Hz),7.84(d,1H,J＝15.68Hz),7.67(d,4H,J＝14.16Hz),7.65(s,1H),7.47(t,3H,J＝5.72Hz)；
（2）将化合物3(216g,0.75mol,1eq)、二乙胺(274.29g,3.75mol,5eq)、硝基甲烷(229.5g,3.75mol,5eq)溶于1L甲醇，回流20h，将反应液体积旋至约1/5，将其倾入等体积冰水中，4M浓盐酸调pH至3-4，之后以二氯甲烷（DCM）萃取水相，有机相水洗，饱和NaCl洗涤，Na2SO4干燥，旋干后得黄色油状样品，加入甲醇后有大量固体析出，用甲醇冲洗滤饼，再用甲醇重结晶，得到193g产物1-(4-溴苯)-4-硝基-3-苯丁酮（化合物4），产率77%。；
（3）将化合物4(130g,0.39mol,1eq)、醋酸铵(1050g,13.65mol,35eq)加入到3.5L 乙醇中，N2保护回流，20h后点板原料消失，停止反应，将溶剂乙醇浓缩，用硅胶制砂过炮筒，先用四氢呋喃：石油醚（THF:PE）体积比=1.5:1，后用甲醇和石油醚洗，得到106.4g蓝黑色产物二溴氮杂四苯基二吡咯次甲染料（化合物5），产率45%。
化合物5检测：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.05(d,4H,J＝6.96Hz),7.80(d,4H,J＝8.00Hz),7.69(d,4H,J＝8.00Hz),7.44(d,6H,J=7.4Hz),7.18(s,2H).；
（4）将化合物5(10.8g,18mmol,1eq)、联硼酸频哪醇酯(16g,63mmol,3.5eq)、Pd(dppf)Cl2(6g,7.2mmol,0.4eq)、醋酸铵(15.12g,165.24mmol,9eq)分别加入到500mL四氢呋喃中，氮气保护，加热回流20h，直到TLC显示反应完全，用石油醚：四氢呋喃（PE:THF）体积比=20:1过柱子，得到二频哪醇乙硼烷氮杂四苯基二吡咯次甲染料（化合物6）；
（5）将化合物6(5.2g,7.5mmol,1eq)溶于无水二氯甲烷中，加入N，N-二异丙基乙基胺(12.5mL，75mmol，10eq)，氮气保护，室温搅拌1h，加入三氟化硼乙醚(15mmL,112.5mmol,15eq)搅拌反应4个小时后，制砂过柱，石油醚：四氢呋喃（PE:THF）体积比=3:1纯化产品，得到二频哪醇乙硼烷氮杂BODIPY（化合物7）；
（6）将化合物7(1g,1.33mmol,1eq)溶于150mL四氢呋喃，加入二乙醇胺(293mg,2.8mmol,2.1eq)，30min后有不溶固体析出，过滤后用250mL THF洗涤，再加入HCl(0.1M,560mL)，1h后悬浮液变均相溶液，乙酸乙酯（EA）萃取干燥，甲醇：二氯甲烷（CH3OH:CH2Cl2）体积比=1:20洗脱纯化，得到0.57g aza-bodipy-BA（化合物8），收率73%。
化合物8检测：1HNMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)8.29(s,4H),8.19(d,4H,J=7.28),8.09(d,4H),7.94(d,4H),7.64(s,2H),7.52-7.58(m,6H).13C NMR(400MHz,DMSO)159.49,145.50,143.82,134.60,132.60,132.11,130.33,129.73,129.23,128.93,120.84.HRMS(EI):Calcd for C32H24B3F2N3O4,585.20;found,m/z586。
实施例2：均相中H2O2的检测。
均相检测中所有的荧光实验都是以652nm为激发波长，激发和发射狭缝宽度均为15nm，扫速为100nm/min，1%衰减。
光稳定性实验：在室温下，用光密度为135.9mWcm-2，100W汞灯，波长范围为530～550nm的绿光连续照射浓度为20μM aza-bodipy-BA溶液，进行紫外吸收稳定性实验。每隔15min用激发波长为652nm激发10μM aza-bodipy-BA来进行荧光光稳定性实验。结果表明，aza-bodipy-BA在甲醇中的量子产率为0.60(以尼罗蓝为参比染料)，在最大吸收波长655nm处的消光系数为74540L mol-1cm-1，该化合物光稳定性很好(如 图2和图3)，在连续汞灯照射下（光密度为135.9mWcm-2），655nm处紫外吸收和在687nm处荧光发射几乎都没有变化。
pH响应实验：用10-2M不同pH值的磷酸盐缓冲液按照体积比为1:1稀释aza-bodipy-BA（乙醇）得到aza-bodipy-BA浓度为10μM。硼酸是一种对pH敏感的分子，因为OH-会与缺电子的硼原子结合形成硼酸负离子。图4是aza-bodipy-BA对pH的响应曲线。从图中可以得出当pH小于7.5时，aza-bodipy-BA对pH都是不敏感的，非常有利于细胞成像分析和测量。
Aza-bodipy-BA对不同活性氧（ROS）选择性：用含有ROS的溶液按照体积比为1:1稀释aza-bodipy-BA(乙醇)溶液，最终得到ROS浓度为5mM（如没有特殊说明）和10μM aza-bodipy-BA。所用的缓冲液为20mM HEPES（pH7.4）缓冲液。H2O2、叔丁基过氧化氢(TBHP)、次氯酸钠（NaClO）浓度均为5mM，分别是通过稀释相应的30%H2O2、70%TBHP、5%NaClO溶液得到。超氧根离子（O2 -）通过溶解KO2得到，最终得到O2 -浓度为200μM，aza-bodipy-BA浓度为10μM。100mM羟基自由基(·OH)和叔丁基自由基(·OBu)由1M Fe2+分别与100mM H2O2和TBHP反应得到。然后用pH7.4HEPES缓冲溶液稀释得到10mM羟基自由基(·OH)和叔丁基自由基(·OBu)。最后，分别用10mM羟基自由基(·OH)和叔丁基自由基(·OBu)按照体积比为1:1稀释aza-bodipy-BA，最终得到aza-bodipy-BA浓度为10μM，羟基自由基和叔丁基自由基都为5mM。NO是由铜粉与2M的硝酸反应得到，最终得到NO浓度为6×10-2M，aza-bodipy-BA浓度为10μM。10units/ml过氧化氢酶在37℃下分解10-2M H2O230min，然后用该溶液稀释aza-bodipy-BA，得到最终浓度为10μM。从图5所示的结果可以看出aza-bodipy-BA对H2O2有较强的选择性。
H2O2均相检测：aza-bodipy-BA（乙醇）按照体积比为1:1与H2O2混合，得到10μMaza-bodipy-BA，用紫外吸收和荧光发射信号检测H2O2。用20mM的HEPES pH7.4缓冲溶液稀释30%H2O2得到不同浓度的H2O2。结果如图6所示，aza-bodipy-BA在652nm激发下，发射峰在687nm，当加入H2O2时，荧光发射从687nm位移到713nm。在加入H2O2后紫外吸收可以从655nm位移到687nm。紫外吸收光谱和荧光发射光谱的变化是因为aza-bodipy-BA中的苯硼酸与H2O2反应后转化成苯酚，硼酸是缺电子结构，缺电子硼酸转换成多电子羟基后，扩展了aza-bodipy-BA的共轭结构，因而波长会有所红移，荧光发射波长也相应的发生了红移。如图7所示，在水相中，aza-bodipy-BA对不同浓度的H2O2的响应范围在10-5M到10-2M。
实施例3：膜相中H2O2的检测。
将aza-BODIPY-BA整合到聚氯乙烯-癸二酸二辛酯（PVC-DOS）（增塑剂DOS的介电常数ε=3）膜中时，检测其对H2O2的响应。如图8所示，它对H2O2的响应范围可以从10-7M到10-2M，最低检测限可以达到10-8M并且响应时间对荧光强度比值曲线遵循一级动力学方程，如图9到图13所示。在膜相检测中，H2O2扩散进入到膜相中与aza-bodipy-BA发生反应，响应时间要比在均相中的短。从上述结果表明，aza-bodipy-BA中的苯硼酸转化为苯酚是与环境相关的，并且更适合在有机相中发生该反应，可能是由于探针在有机相中的溶解性较好。这样的性质很适合用于微型化的高分子传感器中来进行细胞内部的检测，并且有很多优势比如背景干扰小，对探针起到保护作用，降低对细胞的毒性，可以进行非侵害性的连续性检测32。
实施例4：细胞中H2O2的检测。
细胞培养和染色：用加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基培养HeLa细胞。在染色的前一天，将细胞培养在0.17mm厚的共聚焦盖玻片上以备用。实验前用pH7.4PBS缓冲液冲洗三次，再用20μM aza-bodipy-BA培养，再用pH7.4PBS缓冲液冲洗三次。
荧光成像：在实验前，用20μM aza-bodipy-BA培养HeLa细胞30min，用pH7.4PBS缓冲洗三次，最后，在40x物镜下，用Prism And Reflector Imaging Spectroscopy System(PARISS)和Olympus BX53显微镜来获取染色后的HeLa细胞加入H2O2前后荧光成像和光谱信号的变化。
共聚焦成像：用莱卡TCS SP5双光子共聚焦显微镜，在63x油镜下，633nm HeNe激光激发被aza-bodipy-BA染色的HeLa细胞，接收波长范围在661nm～681nm和750nm～780nm。
aza-bodipy-BA对细胞内H2O2响应的情况用共聚焦显微镜进行研究。20μM的aza-bodipy-BA只需要5min就可以染进HeLa细胞（图14），并且可以忽略细胞自身荧光的干扰，因为aza-bodipy-BA的激发和发射波长都在近红外范围内。
试验结果发现，aza-bodipy-BA对H2O2的响应时间与膜相中aza-bodipy-BA对H2O2的响应时间相似，都要比在均相中的响应时间短。用Pariss Hyperspectral Imaging System定量研究aza-bodipy-BA对细胞内H2O2的响应。从图15可以看出，在685nm和735nm处峰值在不同浓度的H2O2作用下荧光强度呈现出此消彼长的变化。在细胞实验中，当外加H2O2浓度为100μM时F685/F735的比值为3.50，在膜相检测中加入10-6M H2O2后相应的比值为3.67，与细胞实验中外加100μM的比值相似。这与之前文献中报道的结 果相符：细胞内部H2O2的浓度比外加浓度低100倍33。实验结果表明aza-bodipy-BA可能存在于亲脂性环境中，比如各种细胞器膜中，而不是存在于细胞液中。已经有文献报道荧光探针二氯二氢荧光素二乙酸酯DCFH-DA和水溶性的DCFH能很好的存在于磷脂双分子层中而不是在水相和膜相的界面上17，这就使得我们质疑DCFH与细胞内水溶性组分相互作用的能力。然而，比例型荧光探针aza-bodipy-BA能够合理的预测细胞内部的H2O2浓度。
佛波酯(PMA)是一种可以刺激细胞内部产生H2O2的试剂，产生的H2O2扩散到细胞外的浓度大约是在纳摩尔级别，然而，细胞内部的H2O2浓度要比细胞外部的高，但是还没有在实验上被证明。本申请通过用PMA培养已经染有aza-bodipy-BA细胞1.5h，发现在685nm处荧光强度有所下降，685nm和735nm处的荧光强度的比值为3.81（如图16）与细胞实验中外加H2O2浓度100μM的值相似。
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Claims (3)
1.一种比例型近红外荧光探针，其特征在于，其化学名称为氮杂氟硼二吡咯-硼酸，结构式如下：
。
2.权利要求1所述的比例型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该制备方法按如步骤进行：
(1)将1mol 4-溴苯乙酮溶于2.44L乙醇中，加入2.5M氢氧化钠水溶液，室温下滴加1mol苯甲醛的乙醇溶液，滴加完毕待有大量固体析出后，室温反应20h，水洗固体，用乙醇重结晶，用乙醇洗涤固体后干燥得到黄色固体1-(4-溴)-3-苯丙烯酮；
(2)将0.75mol的1-(4-溴)-3-苯丙烯酮、3.75mol二乙胺和3.75mol硝基甲烷溶于1L甲醇，回流20h，将反应液体积旋至约1/5，倾入等体积冰水中，用4M浓盐酸调pH至3-4，用二氯甲烷萃取水相，有机相水洗，饱和NaCl洗涤，Na2SO4干燥，旋干，加入甲醇，用甲醇冲洗滤饼，再用甲醇重结晶得到1-(4-溴苯)-4-硝基-3-苯丁酮；
(3)将0.39mol 1-(4-溴苯)-4-硝基-3-苯丁酮和13.65mol醋酸铵加入到3.5L乙醇中，N2保护回流，20h后点板原料消失，停止反应，浓缩乙醇，先用四氢呋喃：石油醚体积比＝1.5:1，后用甲醇和石油醚洗，得到蓝黑色固体二溴氮杂四苯基二吡咯次甲染料；
(4)将18mmol二溴氮杂四苯基二吡咯次甲染料、63mmol联硼酸频哪醇酯、7.2mmol Pd(dppf)Cl2、165.24mmol醋酸铵分别加入到500mL四氢呋喃中，氮气下加热回流20h，直到TLC显示反应完全，用石油醚：四氢呋喃体积比＝20:1过柱子，得到二频哪醇乙硼烷氮杂四苯基二吡咯次甲染料；
(5)将7.5mmol二频哪醇乙硼烷氮杂四苯基二吡咯次甲染料溶于无水二氯甲烷中，加入75mmol N,N-二异丙基乙基胺，氮气保护，室温搅拌1h，加入112.5mmol三氟化硼乙醚，搅拌4个小时后，制砂过柱，用石油醚：四氢呋喃体积比＝3:1纯化得到二频哪醇乙硼烷氮杂BODIPY；
(6)将1.33mmol二频哪醇乙硼烷氮杂BODIPY溶于150mL四氢呋喃中，加入2.8mmol二乙醇胺，30min后待不溶固体析出后，过滤，用250mL THF洗涤固体，再加入560mL HCl，1h后悬浮液变均相溶液，乙酸乙酯萃取干燥，利用甲醇：二氯甲烷体积比＝1:20洗脱液经硅胶柱纯化样品，得到氮杂氟硼二吡咯-硼酸。
3.权利要求1所述的比例型近红外荧光探针在检测H2O2中的应用；
其中，所述H2O2在聚氯乙烯-癸二酸二辛酯膜中或Hela细胞中。
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