CN102928495A

CN102928495A - 匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统

Info

Publication number: CN102928495A
Application number: CN2012104772952A
Authority: CN
Inventors: 谭啸
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2013-02-13

Abstract

本发明涉及匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统，在时间上的升温过程叠加空间上的凝胶梯度，缩短了电泳时间，提高了凝胶分辨率。本发明的电泳系统可以进行匀速升温-变性梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳、普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可以外接恒温冷槽进行单链构象多态性分析，实现“一机多用”。本电泳系统可以快速高效地揭示微生物多样性及其相对含量，探寻功能菌群并预防有害菌群，在工业、农业、医学、环境监测和污染治理中发挥巨大作用。

Description

匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统

技术领域

本发明涉及DNA电泳领域，特别是一种匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统。

背景技术

微生物群落是广泛存在于生态系统中的结构和功能单位，群落中不同的微生物以有规律的方式共处，它们具有各自的营养途径和代谢类型。微生物群落结构研究是生态学和环境科学研究的热点，涉及土壤及根际微生物、肠道微生物、浮游微生物等多个领域，对于开发微生物资源，阐明微生物群落与生境的关系，揭示群落结构与功能的联系，引导微生物群落功能的定向调控具有重要意义。

微生物群落结构分析技术分为三个发展阶段：① 20世纪70年代以前主要通过传统的分离培养方法，依靠形态学和生理特性进行分类鉴定和计数。② 在70-80年代，研究者通过对微生物进行化学分析建立了微生物分类和定量的方法。③ 在80-90年代，开始以DNA序列为分子标记，通过电泳指纹图谱和DNA测序方法，比较精细地揭示了微生物种类和遗传的多样性，给出了微生物群落结构的直观信息。

综合已有文献，DGGE（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，变性梯度凝胶电泳）和TGGE（Temperature Gradient Gel Electrophoresis，温度梯度凝胶电泳）电泳技术可以直接展示微生物DNA图谱。其中，DGGE电泳系统出现最早，应用也较广。DGGE是由Fischer等（1979）最先提出用于检测DNA突变的一种电泳技术。Muyzer等（1993）首次将DGGE用于微生物生态学研究，完整精确地描述了微生物群落结构、相对比例和系统进化关系。

DGGE在灌制凝胶时设置变性剂浓度梯度，仪器只设置一个目标温度（一般为60℃），在电泳前预热电泳槽，不控制升温速度和时长，达到目标温度后才放入样品进行电泳，控温槽的功能是加热并维持恒温，与水浴锅功能类似。DGGE出现最早，仪器较普遍，相关的研究论文最多。

TGGE利用半导体Peltier效应实现空间温度梯度，电泳时温度不随时间变化，PCR产物在模块表面的凝胶中由低温区泳动到高温区。TGGE空间温度梯度所需的半导体模块造价偏高，并且大尺寸半导体模块受功率限制（功率为200-500W），难以实现稳定的空间温度梯度，所以TGGE温控区面积较小，导致电泳凝胶也较小，限制了上样数和分辨率。由于价格、分辨率、可重复性等原因，TGGE使用得不多，相关论文较少。DGGE和TGGE都使用恒定单体浓度的聚丙烯酰胺凝胶（即凝胶孔径一致），这影响了凝胶的分离效果，降低了分辨率（Cremonesi et al., 1997; Petri & Imhoff, 2001）。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可以在时间上的升温过程叠加空间上的凝胶梯度，缩短了电泳时间，提高了凝胶分辨率、可以进行匀速升温-变性梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳、普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可以外接恒温冷槽进行单链构象多态性分析的匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统，包括控温槽、电泳支架、电泳仪和梯度混合器，所述的控温槽和电泳支架通过导线连接在电泳仪上，所述的控温槽和电泳支架间设有缓冲液循环管，所述的梯度混合器用于制作孔径梯度凝胶和变性剂梯度凝胶，所述的控温槽用于温度控制和提供缓冲液环境，所述的电泳支架用于安放凝胶、提供电场，所述的电泳仪提供恒压电源，所述的控温槽内设有循环泵，所述的控温槽内充满有缓冲液。

采用以上技术方案后，本发明具有以下有益效果：使用时间温度梯度代替TGGE的空间温度梯度，在凝胶中引入孔径梯度，设计匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统，实现“一机多用”。可以在时间上的升温过程叠加空间上的凝胶梯度，缩短了电泳时间，提高了凝胶分辨率、可以进行匀速升温-变性梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳、普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可以外接恒温冷槽进行单链构象多态性分析。

附图说明

图1：A表示湖水总DNA样品（100 V，6 小时）TTGG图谱，

B表示湖水总DNA样品（100 V，16小时）DGGE图谱

具体实施方式

下面根据附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。

匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统，包括控温槽、电泳支架、电泳仪和梯度混合器，所述的控温槽和电泳支架通过导线连接在电泳仪上，电泳仪产生的恒压直流电正极通过导线传递到控温槽底部，直流电负极传递到电泳支架上，所述的控温槽和电泳支架间设有缓冲液循环管，所述的梯度混合器用于制作孔径梯度凝胶和变性剂梯度凝胶，所述的控温槽用于温度控制和提供缓冲液环境，所述的电泳支架用于安放凝胶、提供电场，凝胶处于上负下正的匀强电场中，所述的电泳仪提供恒压电源，所述的控温槽内设有循环泵，所述的控温槽内充满有缓冲液。循环泵不断混匀缓冲液并通过导管向电泳支架内补充新鲜缓冲液

本发明的电泳系统包括时间上的升温过程和空间上的凝胶梯度，匀速升温过程依靠程序控温槽实现，空间上的凝胶梯度依靠梯度混合器实现（包括凝胶孔径梯度和变性剂梯度），达到对环境样品DNA扩增产物的高分辨率区分。

程序控温槽包含输入系统、分析系统、控制系统，输入系统供客户输入温度参数和时间参数，分析系统根据客户输入的参数计算升温速率，控制系统对缓冲液温度和加热器功率进行监控。TTGG电泳前，在程序控温槽上设置5个重要参数（预热时长、初始温度、升温时长、最终温度、保温时长）。通过仪器自带单片机计算后，以3分钟或30分钟为1个时间段，将总升温时长分割成多个时间段来计算各时间段的目标温度，实现匀速升温过程。在缓冲液达到初始温度时即开始电泳，样品在匀速升温的过程中泳动，达到最终温度后进行恒温电泳，一直到保温时长结束。所以本发明的控温槽不是简单的升温和保温作用，而是根据电泳条件的需要来设置升温范围和速度，实现程序化温控，升温过程与电泳过程同步进行。这与DGGE实验前“粗放式”预热和恒温电泳有很大不同。由于TTGG加热器可以将最大加热功率提升到5000W，加热器功率根据升温速度变化，控温能力较强，成本远低于TGGE的半导体模块。

本发明将孔径梯度凝胶与智能控温槽相结合，在引物设计过程中可以省去GC夹（Chen et al. 1999），在节约时间和金钱的同时提高了分辨率和结果的可重复性。使用梯度混合器可以制作孔径梯度凝胶和变性剂梯度凝胶。

常规的DGGE电泳系统不能用来进行TTGG电泳。这是因为在进行TTGG电泳时，不同的样品所要求的升温速度不同，现有DGGE系统是将缓冲液加热到预设温度后保持恒温（一般为60℃），升温速度不能根据需要进行调整。

本发明的电泳系统还能实现“一机多用”的功能，可以进行除TTGG之外的其他电泳。将初始温度和最终温度均设置为60℃，放入变性梯度凝胶即可进行DGGE；将初始温度和最终温度均设置为4℃，外接恒温冷槽，即可进行SSCP（单链构象多态性分析）；关闭加热器，本系统还能进行普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明的电泳系统可以快速高效地揭示微生物多样性及其相对含量，探寻功能菌群并预防有害菌群，在工业、农业、医学、环境监测和污染治理中发挥巨大作用。

本发明的TTGG系统符合以下标准：《中国人民共和国强制性电泳行业标准》YY0155-94、《电泳装置行业标准》YY/T0087-2004、《电泳装置企业标准》Q/FTLYY001。电泳系统具体参数如下：

电泳电压：70-200V

电泳电流：50-150mA

凝胶面积：40cm*30cm

凝胶厚度：0.75cm和1cm

泳道数：20个/块

加热功率：0-5000W（功率可变，加热器电压为220V）

最小和最大升温速度：0.5 ℃/小时至30 ℃/小时

控温误差：±0.1 ℃

下面将本系统“一机多用”，进行TTGG和DGGE，对电泳图谱进行比较。

1 实施例一

设置预热时长=1h、初始温度=55℃、升温时长=5h、最终温度=60℃、保温时长=1h，凝胶变性剂浓度梯度为40%~50%，孔径梯度为6%~8%，对13个湖水样品总DNA的PCR产物进行TTGG。

2 实施例二

设置预热时长=1h、初始温度=60℃、升温时长=0h、最终温度=60℃、保温时长=16h，凝胶变性剂浓度梯度为40%~50%，对13个湖水样品总DNA的PCR产物进行DGGE。

结果图所示，本发明的TTGG电泳图谱（图1A）条带清晰、分辨率高；DGGE电泳图谱（图1B）条带模糊，分辨率低。

在电泳时间方面，TTGG（共7小时）的比DGGE（共17h）缩短一半以上。对于同样13个样品，TTGG图谱的分辨率要高于DGGE图谱，单泳道条带多样性（Shannon-Weiner指数，H’）提高10%以上。单泳道条带多样性指数（H’）的计算公式如下：

H’= -Σ (Pi)·(lnPi)

Pi (某一条带的相对灰度值) = ni /N, ni：某一条带的灰度值, N：某一泳道中条带的总灰度值。

Claims

1.匀速升温-变性梯度凝胶多功能电泳系统，包括控温槽、电泳支架、电泳仪和梯度混合器，其特征在于所述的控温槽和电泳支架通过导线连接在电泳仪上，所述的控温槽和电泳支架间设有缓冲液循环管，所述的梯度混合器用于制作孔径梯度凝胶和变性剂梯度凝胶，所述的控温槽用于温度控制和提供缓冲液环境，所述的电泳支架用于安放凝胶、提供电场，所述的电泳仪提供恒压电源，所述的控温槽内设有循环泵，所述的控温槽内充满有缓冲液。