CN101865878A

CN101865878A - 一种智能电泳控温槽及时间温度-凝胶梯度电泳系统

Info

Publication number: CN101865878A
Application number: CN201010195446A
Authority: CN
Inventors: 谭啸
Original assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Current assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2010-10-20

Abstract

本发明涉及一种智能电泳控温槽及包含该控温槽的时间温度-凝胶梯度电泳系统。所说的智能电泳控温槽，包括槽本体、密封盖、智能温度控制器，槽本体内设有加热装置、电极接头、缓冲液循环管。该控温槽能在缓冲液温度达到初始温度时控制加热器在设定的升温时长内使缓冲液温度从初始温度匀速升至目标温度，当达到目标温度后维持恒温。一种时间温度-梯度凝胶电泳系统，包括上述所说的智能电泳控温槽、电泳支架和程控电泳仪。使用本发明的智能电泳控温槽和电泳系统进行时间温度-梯度凝胶电泳可以大大节约电泳时间，降低变性剂扩散的不确定性，提高凝胶的分辨率和结果的可重复性。

Description

一种智能电泳控温槽及时间温度-凝胶梯度电泳系统

技术领域

本发明涉及核酸电泳领域，具体涉及一种时间温度-凝胶梯度电泳（TTGG，Temporaltemperaturegelgradientelectrophoresis）控温槽及包含该控温槽的电泳系统。

背景技术

综合已有文献，DGGE（Denaturedgradientgelelectrophoresis，变性梯度凝胶电泳）、TGGE（Temperaturegradientgelelectrophoresis，温度梯度凝胶电泳）、TTGE（Temporaltemperaturegradientgelelectrophoresis，时间温度梯度凝胶电泳）等电泳技术均可用来检测DNA点突变和基因多样性。其中，DGGE电泳系统出现最早，应用也较广。变性梯度凝胶电泳（DGGE）是由Fischer等（1979）最先提出并用于检测DNA突变的一种电泳技术。Muyzer等（1993）首次将DGGE用于微生物生态学研究，完整精确地描述了微生物群落结构、相对比例和系统进化关系。

DGGE原理是：一定浓度的化学变性剂（通常为甲酰胺、尿素等）会使DNA双螺旋解链，GC含量是影响解链温度的主要因素。解链温度较低的区域称作低温解链区（lowermeltingdomain）。如果在某一变性剂浓度位置低温解链区已经解链，那么双螺旋就由未解链部分连在一起，未解链区域称作高温解链区（highmeltingdomain）。某一基因型双链在较低变性剂浓度位置首先解链（通常为突变株或解链温度较低的双链），而另一基因型双链则在较高变性剂浓度位置解链（通常为野生株或解链温度较高的双链），开始解链的DNA片段泳动速度急剧下降，梯度变性凝胶可将二者分开。通常环境样品的PCR产物中含有野生双链、突变双链以及异源双链等片段（异源双链常常是在PCR扩增时错配产生，异源双链通常可以远远地与同源双链分开）。为使仅有一个碱基之差的不同DNA双链较好地分离，需要选择合适的变性剂浓度梯度范围，并且在PCR前向引物的5’端加40-50bp的GC夹（GCclamp），人工形成一个高温解链区（Sheffieldetal.,1989）。这样，片段的其他部分就处在低温解链区，有利于提高分离效果。目前，DGGE电泳在恒定温度下进行（电泳时间达16小时），凝胶中不同浓度的变性剂在长时间电泳过程中容易扩散，影响浓度梯度的均匀分布，使样品在非线性梯度范围内泳动，难以分离解链温度较近的片段，影响电泳实验的分辨率和可重复性（Kisand&Wikner,2003）。

TGGE的原理是：引入空间温度梯度代替变性剂梯度。在远离加样孔的方向，温度逐步升高，双链DNA在泳动过程中开始解链，不同GC含量双链的解链位置有差异，影响了泳动速度，从而达到分离效果（Riesneretal.,1990）。目前，TGGE系统采用半导体模块实现空间温度梯度，售价相当昂贵；同时TGGE对实验者和实验环境的要求较高，限制了TGGE的推广。因此，国内外采用TGGE的研究论文远远少于DGGE。

TTGE的原理是：用时间温度梯度取代空间温度梯度，随着时间推移电泳装置均匀升温，使双链DNA逐步解链实现分离（Yoshinoetal.,1991）。TTGE电泳时间比DGGE大幅缩短，但是分辨率有待于提高（Marieetal.,2006）。

综上所述，为使DNA的解链温度在合适范围（通常为50-70℃），TGGE和TTGE使用恒定浓度的变性剂来降低双链DNA的解链温度，并且DGGE、TGGE、TTGE均使用恒定单体浓度的聚丙烯酰胺凝胶（即凝胶孔径一致），这影响了凝胶的分离效果，降低了分辨率（Cremonesietal.,1997;Petri&Imhoff,2001）。

本发明采用独创的时间温度-凝胶梯度（TTGG）电泳系统，将恒定变性剂浓度的孔径梯度凝胶与智能控温槽相结合，电泳过程中控温槽逐步升温，实现DNA片段的分离（表1）。TTGG比DGGE节约一半以上的电泳时间，消除DGGE的变性剂梯度扩散而影响重复性，避免使用昂贵的TGGE半导体模块，在引物设计过程中可以省去GC夹（Chenetal.1999）。TTGG引入凝胶孔径梯度的分子筛效应，在节约时间和金钱的同时提高了分辨率和结果的可重复性（图2）。

对于TTGG而言，电泳温度参数（升温范围和升温速度）与凝胶孔径梯度的选择尤为重要。

1解链温度（Tm值）的计算

长度为25bp以下的双链DNA序列Tm(℃)=4*(G+C)+2*(A+T)

25bp以上的序列Tm(℃)=81.5+16.6*lg[Na⁺]+0.41(%GC)–600/L，式中[Na⁺]表示离子浓度，%GC表示GC百分含量，L表示双链DNA长度（Howleyetal.,1979）

凝胶中加入尿素、甲酰胺等可以降低解链温度。根据经验：每加入1mol/L的尿素可以降低解链温度2℃；加入甲酰胺后Tm(℃)=81.5+16.6*lg[Na⁺]+0.41(%GC)-600/L-0.63F，式中F表示去离子甲酰胺的百分比浓度（Steger,1994）。

很多软件或网站（Oligo6.71、Meltscan、Meltmap、OligCalc等）可以进行解链温度预测（Brossette&Wartell,1994;Kibbe,2007），根据待测DNA序列开始解链和完全解链的温度确定TTGG变温范围。如果变温范围小于6°C则使用较慢的升温速度（0.5-1°C/小时）；如果变温范围较大，可以适当提高升温速度，但较慢的升温速度有利于提高分辨率。

2凝胶孔径的选择

根据PCR产物长度选择凝胶孔径（6%：0.3–1kb；8%：0.2-0.4kb；10%：0.1-0.3kb）。但是，环境样品基因组复杂，即使是邻近物种的保守序列也存在长度差别，并且PCR扩增会产生错配、异源双链和嵌合体（Qiuetal.,2001），选用梯度孔径凝胶有利于降低其他因素的干扰，提高了碱基差异的检出率（Cremonesietal.,1997;Petri&Imhoff,2001）。另外，聚合后的孔径梯度凝胶的流动性远低于DGGE凝胶中的梯度变性剂。因此，TTGG能更好地维持凝胶孔径的线性梯度，保证了实验的重复性。

常规的DGGE电泳系统不能用来进行TTGG电泳。这是因为在进行TTGG电泳时，不同的样品所要求的升温速度是不同，现有DDGE电泳系统控温槽的功能是将缓冲液加热到预设温度后保持恒温，升温速度不能根据需要进行调整。因此，一种智能电泳控温槽及时间温度-凝胶梯度电泳系统有待开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种智能电泳控温槽，以及包含该控温槽的时间温度-凝胶梯度电泳系统。

本发明所说的智能电泳控温槽，包括槽本体、密封盖、保温层、智能温度控制器。槽本体内设有加热器、电极接头、缓冲液循环管。所说的智能温度控制器设于槽本体外，用于控制加热器。用户可以在控制器输入初始温度、目标温度以及升温时长，当缓冲液温度达到初始温度后控制器调节加热器在设定的升温时长内使温度从初始温度匀速升至目标温度，达到目标温度后维持恒温。

上述所说的智能电泳控温槽，还设有过压、过流和过载报警装置、开盖断电保护装置。

为了使缓冲液更好地平稳匀速升温，降低边缘效应，特在槽本体外设置保温层。保温层是内衬聚苯乙烯的“回”字形木板套，在电泳开始后套在槽本体四周。

一种时间温度-凝胶梯度电泳系统，包括上述所说的智能电泳控温槽、电泳支架、梯度混合仪和程控电泳仪。电泳支架用于固定凝胶玻璃板；梯度混合仪用于制作孔径梯度凝胶；程控电泳仪通过电泳控温槽电极接头与电泳支架连通，控制电泳时间和电压。

本发明所说的时间温度-凝胶梯度电泳系统，还包括一台计算机，用于分析PCR产物的解链曲线，并推算出电泳的初始温度和目标温度。

应用本发明的控温槽和电泳系统进行TTGG时，智能温度控制器与加热器可使缓冲液温度匀速上升（最慢为0.5℃/小时，最快可达30℃/小时），升温过程由微处理器控制，线性极为严格（误差±0.1℃），保证电泳的分辨率和结果的可重复性。

附图说明

图1：智能温度控制器电路图。

图2：11个样品（100V，6小时）TTGG图谱。

图3：11个样品（100V，16小时）DGGE图谱。

具体实施方式

本发明一个实例的时间温度-凝胶梯度电泳系统由智能电泳控温槽、程控电泳仪、电泳支架组成。

图1是智能电泳控温槽的温度控制器电路图，由温度检测、显示、设定、控制四部分组成。

图中M1-M4为4个单独的运算放大器。PTC₁-PTC_n为热敏电阻（PTC）感温探头，RP1用于对微安表调零，RP2用于调节M2的输出使微安表指满度，S为转换开关。

由PTC检测缓冲液温度信息，输入M1的反馈回路。该信息即作为M2的输入信号，经M2放大后通过微安表液晶屏显示实测温度；又作为比较器M4的同相输入信号，与M3输出的设定基准信号构成M4的差模输入电压。当控温槽内缓冲液的实际温度低于RP3的预设温度时，PTC的阻值较小，此时M4同相输入电压的绝对值小于反相输入电压的绝对值，于是M4输出为高电位，从而使晶体管V饱和导通，继电器K闭合触点JK，加热器RL由220V市电供电，对缓冲液加热。当缓冲液的实际温度升到预设值时，M4同相输入电压的绝对值大于反相输入电压的绝对值，M4的输出为低电位，从而导致V截止，K失电断开触点JK，加热器停止加热。如此反复运行，达到控温目的。

温度设定部分负责设定初始温度和目标温度，并且根据升温时长计算出各时间段的目标温度。本装置以3分钟（慢速）或30分钟（快速）为1个时间段，将升温时长分割成多个时间段来计算目标温度，以达到匀速升温的目的。

本发明的另一个实例的时间温度-凝胶梯度电泳系统由智能电泳控温槽、程控电泳仪、电泳支架和一台计算机组成。计算机中安装有分析软件，软件可以计算得出DNA片段的解链温度区间，以此选择电泳的初始温度、目标温度以及升温时长。所说的分析软件可以采用已有的免费软件或商业软件（如：Oligo6.71、Meltscan、Meltmap、OligCalc等），也可由研究人员自行编写。

使用方法：通过软件对PCR产物进行解链温度分析，确定初始温度、目标温度和升温时长；在智能控温槽上设置初始温度、目标温度和升温时长后，加热器开始对控温槽内的缓冲液预热；当温度达到初始温度时将固定有凝胶玻璃板的电泳支架放入控温槽内，接好电极接头和缓冲液循环管，在程控电泳仪上设置电泳时间和电压，上样后启动程控电泳仪开始电泳。

下面详细说明用本发明所说的时间温度-凝胶梯度电泳系统进行湖泊浮游细菌DNA多样性分析的实验过程。

实施例一

1.1技术路线

使用0.22μm滤膜过滤湖泊水样→从滤膜提取细菌DNA→PCR扩增（选用细菌16SrDNA序列前向引物341F和反向引物907R）→扩增产物解链温度分析及其TTGG温度条件设置→TTGG→凝胶拍照、带型分析。

下面具体介绍“扩增产物解链温度分析→TTGG”过程。

1.2扩增产物融链分析

将PCR引物序列输入系统的计算机中，计算机附带软件分析后会预测PCR产物序列并计算解链曲线从而得出TTGG的初始温度和目标温度，根据两个温度之差来设定升温时长，升温速度通常在0.5℃/小时至3℃/小时之间，一般升温时长控制在6小时以内，电泳全程时间在8小时以内，达到目标温度后控温槽维持目标温度直至电泳结束。为实现更好的电泳效果，用户可选用较慢的升温速度。在电泳开始前1小时应打开电泳控温槽预热至初始温度。

1.3试剂配制

凝胶配置之前需要准备以下试剂：①凝胶单体（丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺＝37.5/1，称取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉双丙烯酰胺，加入去离子水定容至100ml，用0.45μm的滤膜过滤后装入棕色瓶4°C保存）；②尿素（分析纯）33.6g；③50×TAE缓冲液（Tris2mol/L、冰醋酸1mol/L、EDTA50mmol/L，pH8.0）；④10%过硫酸铵溶液（W/V，为保证良好的引发效果，建议现配现用）；⑤TEMED（进口分装）。

1.4变性胶的制作和时间温度-凝胶梯度电泳

①把琼脂盒放在支架底座上，将两块玻璃对齐后，下端放入琼脂盒内（带缺口的玻璃缺口朝上并位于内侧），用夹子将玻璃板固定在支架上。向琼脂盒内灌入5％的液态琼脂，待琼脂充分凝固。

②配置6%和8%的变性凝胶各20mL（表2），在灌胶前加入适量的10%过硫酸铵溶液和TEMED并充分混匀（凝胶孔径梯度根据PCR产物片段长度选择，本次实验341F和907R扩增产物选用6％-8%的孔径梯度凝胶）。

③使用梯度混合仪制作从上向下孔径逐步减小的梯度凝胶（即上端为6%，下端为8%，分离胶中变性剂（尿素）的浓度均为7mol/L，即8.4g/20mL），分离胶顶端灌入适量不含变性剂的6%浓缩胶，随后插好梳子待凝胶凝固。

④凝胶凝固后，拔出梳子，取出琼脂盒，擦净胶板外侧的琼脂。将胶板直接夹在电泳支架上并放入控温槽中（已装入1×TAE缓冲液，设置电泳初始温度（55°C）、目标温度（60°C）、升温时长（5小时），缓冲液已预热至初始温度），随即插上电极和缓冲液循环管。用微量上样器吸取PCR产物和上样缓冲液，注入上样孔中（每个孔的DNA总量约为500ng）。在电泳仪设置电压和时间，开始电泳。

1.5凝胶染色及数据分析

电泳结束后，取出电泳支架并撬开一侧玻璃，使用SYBRGreenI染色30min后将凝胶置于凝胶成像仪中拍照，对凝胶照片进行带型分析并可以对凝胶上的目的条带回收测序。

实施例二

将同样11个样品平均分成两份，一份按本发明的上述步骤进行TTGG电泳（表3），一份进行DGGE电泳（表4，所用系统参照ZL200820037544.5），然后对两个电泳图谱进行比较。

结果如图2和图3所示，本发明的TTGG电泳图谱（图2）条带清晰、多样性丰富，分辨率高；DGGE电泳图谱（图3）条带模糊，分辨率低。

Claims

1.一种智能电泳控温槽，包括槽本体、密封盖、智能温度控制器，槽本体内设有加热装置、电极接头、缓冲液循环管，其特征在于所说的智能温度控制器用于控制加热器，可以根据用户设置的初始温度、目标温度和升温时长，并且计算在升温时长内从初始温度均匀升至目标温度的速度，达到目标温度后控温槽保持恒温。

2.根据权利要求1所说的智能电泳控温槽，其特征在于还设有过压、过流和过载报警装置、开盖断电保护装置。

3.根据权利要求2所说的智能电泳控温槽，其特征在于，槽本体外设有保温层。

4.一种时间温度-梯度凝胶电泳系统，包括权利要求1所说的智能电泳控温槽、电泳支架和程控电泳仪。

5.根据权利要求4所述的时间温度-凝胶梯度电泳系统，其特征在于，还包括一台计算机，用于分析DNA序列的解链曲线并推算电泳的初始温度和目标温度。