CN102905693A - 包含至少一种疏水性治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混和物的至少一种化合物的水溶性药物组合物 - Google Patents

包含至少一种疏水性治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混和物的至少一种化合物的水溶性药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水溶性药物组合物，其包含至少一种治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一种化合物，其中至少一种治疗活性物质为疏水性药物。特别地，本发明涉及由鞘糖脂或经修饰的鞘糖脂的纳米胶束组成的可注射无菌组合物，其可以被白蛋白非共价包被，且允许高疏水性分子的运输和受控释放。

Description

包含至少一种疏水性治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混和物的至少一种化合物的水溶性药物组合物
技术领域
本发明涉及水溶性药物组合物，其包含至少一种治疗活性物质，以及选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混和物的至少一种化合物。在此组合物中，至少一种治疗活性物质为疏水性药物。特别地，本发明涉及由经修饰的鞘糖脂或鞘糖脂的纳米胶束组成的可注射无菌组合物，其可以被白蛋白非共价包被，且允许高疏水性分子的受控释放。
背景技术
主要由于缺乏到达正确位点以发挥治疗作用的能力，许多药物特别是那些疏水性药物的疗效受到了限制。在很多情况下，甚至当药物为水溶性时，只有小部分的给药剂量到达其治疗位点，而大部分药物则分散于全身。由此，这种在健康器官及组织中的分散常常限制了药物的剂量。因此，理想的具有高疏水性主要活性成分的药物制剂应该使药物在水介质中具有高溶解度，并能以复合物的形式稳定存在而不会分解，与此同时还能够聚集于特异的作用位点。
具有高疏水性和极低或有限水溶性的活性成分的实例包括用于肿瘤治疗的(例如紫杉醇、多烯紫杉醇和阿霉素)、抗真菌病(例如两性霉素B)、用作激素(黄体酮)和麻醉剂(例如异丙酚)的那些。此外还包括前列腺素、二硝酸异山梨酯、睾酮、硝酸甘油、雌二醇、维生素E、可的松、地塞米松及其酯和戊酸倍他米松。
特别地，紫杉醇(paclitaxel,Ptx)是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树中分离出来的具有抗癌特性的二萜类化合物。大约30年前，由美国国家癌症研究所进行的临床前研究中证实了上述树木的粗提取物具有抗肿瘤活性，此后，人们提出将紫杉醇用于癌症治疗。
Ptx是一种与微管蛋白结合并促使其聚合以形成高稳定性微管的分子。这种微管的稳定性导致了微管网重组的正常动态受到抑制。这与例如秋水仙碱、长春新碱或长春碱之类的引起微管解体的其它抗微管药物作用相反(诸如秋水仙碱、长春新碱或长春碱之类的其它抗微管药物显示了相反的作用：它们导致了微管的解体)。
在开发包含PTX的药物过程中遇到的最主要困难之一在于其极不溶于水的特性。传统上，将低水溶性药物制剂加工为乳剂，或将药物与诸如胶束的溶解药物的胶体结合，从而增加其在水介质中的浓度。具体来说，PTX的水溶性很低(低于10μg/ml)；因此，研究了用于静脉输注的不同载体。实际上某些有机溶剂可以部分溶解PTX；然而，在将混溶溶剂用于水稀释于含水介质中，并且其中的PTX接近其饱和点时，此药物就会开始沉淀。
由于这个原因，在不同临床实验中，针对人的给药，将50%CremoforEL/50%无水乙醇稀释于生理溶液中或5%的葡萄糖水溶液中以使Cremofor EL和无水乙醇的终浓度为5%或更低，从而配制了的不同PTX组合物。
如今，Bristol-Myers Squibb Co.(纽约,N.Y.)将30mg(5ml)剂量的PTX针剂行销世界各地。
每毫升所述制剂包含大约6mg Ptx、527mg Cremofor EL、和49.7%(vol/vol)的无水酒精。给药时，可将该浓缩制剂稀释于生理溶液、5%葡萄糖水溶液、包含5%葡萄糖的生理溶液、或者包含5%葡萄糖水溶液的林格氏液中(Goldspiel,1994,"Pharmaceutical Issues:Preparation,Administration,Stability,andCompatibility with Other Medications"Ann.Pharmacotherapy,vol.28,pp.S23-26.Harvey Whitney Books Company)。然而，应该注意的是在Cremophore/乙醇中的PTX制剂稀释于水介质后会变得不稳定，并出现纤维状沉淀。在美国专利US 5,504,102中可以查阅到Cremophore中的PTX制剂。
像大多数化疗药物一样，最大耐受剂量受到其毒性的限制。在人体中，PTX的大部分毒性作用可见于约100至约250mg/m2的浓度范围。例如，在毒副作用中，文献提到了粒细胞减少症(Holmes F.A.et al.，“Phase II trial of taxol,anactive drug in the treatment of metastatic breast cancer”,J Natl Cancer Inst.1991,83:1797-1805)，和系统性周围神经病变，后者为主要的非血液性毒性作用(Rowinsky E.K.et al.,1995,Review Article.Drug Therapy-Paclitaxel(Taxol)N.Engl.J.Med.Vol 332:1004-1014 N.15)。
最近，PTX已被制备成用于胃肠外灌注的液态及固体状态。美国专利US6,743,826描述了通过与人白蛋白或重组人白蛋白的相互作用而获取可溶性Ptx的方法。另一方面，美国专利US 2005282734A1中描述了包含与人白蛋白结合的Ptx或多烯紫杉醇的冻干制剂或水溶性组合物，其中Ptx的浓度高于500μg/ml。然而，所述申请没有清楚地显示Ptx在所述制剂中的溶解度。
白蛋白分子在诸如Ptx的疏水分子的传递中起到了关键作用，其在不同组织中的累积与白蛋白和细胞受体间相互作用的能力有关(Gradishar W.J.,2006,“Albumin-bound paclitaxel:A next-generation taxane,.Expert Opin Pharmacother;7:1041–1053)。
通过与受体结合，白蛋白启动了所谓的白蛋白-Ptx复合物转胞吞作用，使白蛋白-Ptx复合物(称为ABI-007)穿过血管内皮细胞膜到达间质复合体，从而直接暴露于肿瘤表面(Ibrahim N.K.et al.,2002,“Phase I and pharmacokineticstudy of ABI-007,a Cremophor-free,protein-stabilized,nanoparticle formulation ofpaclitaxel”,Clin Cancer Res-;8:1038–1044；Gradishar W.J.,2006,“Albumin-boundpaclitaxel:A next-generation taxane”,Expert Opin Pharmacother,7:1041–1053；Drummond D.C.et al.,1999,“Optimizing liposomes for delivery ofchemotherapeutic agents to solid tumors”.Pharmacol Rev.;51:691-743)。
白蛋白在肿瘤中蓄积，这至少部分是由于所谓的白蛋白结合蛋白(SPARC,分泌蛋白，酸性而富含半胱氨酸，也称为BM-40)的分泌，这可能会导致结合于白蛋白的PTX在肿瘤内蓄积(Fukunaga-Kalabis M.and Herlyn M.,2007,“Unraveling mysteries of the multifunctional protein SPARC”,J InvestDermatol;127:2497–2498)。另一方面，近年来在专业文献中也发表了其他获取水溶性PTX的方法，比如将其与聚谷氨酸聚合物结合(US专利No.7,384,977)。
另外，多烯抗生素两性霉素B (AmB)也是高疏水性分子。这种分子主要通过与甾醇类(比如存在于真菌细胞膜中的麦角甾醇)相互作用而发挥效力，从而增加其渗透性。然而，用两性霉素B治疗全身性真菌感染与广泛的肾损伤密切相关(Bennet J.E.,1996“Antimicrobial agents”.In:Hardman JG，Limbird LE,Molinoff PB,Ruddon RW，Goodman Gilman A,editors.Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics.9th ed.New York:McGraw Hill,:1175-90)。所观察到的两性霉素B在人体内的毒性很可能和其与所有哺乳类细胞中胆固醇的相互作用有关。
为了解决这些问题，AmB起初被制备成胶束制剂，通过了FDA认证，并以Anfostat为名称进行销售。尔后，人们开发出两性霉素B的脂质体制剂，并以Ambisome为名称进行销售(Boswell G.W.et al.,1998,“AmBisome(Liposomalamphotericin B):A comparative review”,J Clin Pharmacol vol.38:583-92)。该产品是最早获批应用于临床治疗全身真菌感染的脂质体制剂(Gray A.and Morgan J.(1991)Liposomes in hematology.Blood Rev;258-271)。
在正常剂量下，脂质体两性霉素B的特征在于优先传递到肝脏和脾脏，从而减轻了两性霉素B的肾脏毒性特征(Boswell G.W.et al.,1998,“AmBisome(Liposomal amphotericin B):A comparative review”,J Clin Pharmacolvol.38:583-92;Ahmad I.et al.,1991,“Tissue distribution and antileishmanialactivity of liposomised amphotericin-B in BALB/c mice”.J Biosci.vol16:217-21)。然而，当高剂量使用时，肾脏毒性再次出现(Longuet P.et al.,1991,“Limitedprotection by small unilamellar liposomes against the renal tubular toxicity inducedby repeated amphotericin B infusion in rats”.Antimicrob Agent Chemother;vol.35:1303-1308)。显然，该毒性是由于肝脏和脾脏巨噬细胞吸收机制的饱和而造成的。
Ambisome也可以用于治疗网状内皮系统的耐药性寄生感染(Davidson R.N.et al.,1991,“Liposomal amphotericin B in drug-resistant leishmaniasis”;Lancetvol.337:1061-1062)。实际上，脂质体可被巨噬细胞俘获及其聚集于肝脏和脾脏的能力使其成为了治疗诸如利什曼病的肝脏和肾脏疾病的理想选择。
此外，有趣的是注意到当被O-硬脂酰支链淀粉和聚氧乙烯(polioxiethylene)或单唾液酸神经节苷脂包被后，脂质体还可以被定向传递到肺部(Deol P，Khuller GK.(1997)“Lung specific stealth liposomes:stability,biodistribution andtoxicity of liposomal antitubercular drugs”.Biochim Biophys Actavol.1334:161-72)。
将诸如利福平或异烟肼之类的抗结核药物包封于脂质体中可以调节或调控它们的毒性(Deol P.andKhuller G.K.,1997,“Lung specific stealth liposomes:stability，biodistribution and toxicity of liposomal antitubercular drugs”,BiochimBiophys Acta vol.1334:161-72)并且改善这些药物的疗效(Deol P.et al.,1997,“Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specificstealth liposomes against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice”.Antimicrob Agent Chemother vol.41:1211-4)。常规的脂质体制剂经配制使药物或其他活性成分置于其核心的水相(亲水性药物)或者分配于脂双分子层(非亲水性药物)中。经证实，将各种抗肿瘤或抗霉菌药物包封于常规脂质体中减少了药物引起的细胞毒副作用，从而保持或在某些情况下增强了其抗肿瘤或治疗效果。毒性的降低是由于脂质体能够减少药物与非目标组织的接触及随之而来的不必要损伤。
包封的抗癌或抗真菌药物的作用机理还不清楚；这可能是由于脂质体能够向血液循环中缓慢释放所包裹的药物，或脂质体与肿瘤表面的相互作用使药物得以缓慢释放到目标肿瘤中。然而，脂质体包封药物面临一个严重的问题：包封后药物会从脂质体中快速释放出来。进一步来说，那些分配于脂质体脂质双分子层中的高度亲脂性(非水溶性)药物在某些情况下似乎会改变膜的物理性质，以至于膜本身变得不稳定而不能再保有药物，从而将其释放到介质中。基于这些所观察到的现象，在药物包封系统中，应力图稳定脂质体使其得到保护，从而避免药物和脂质体相互之间的不利作用。
另一方面，由于被主要位于肝脏和脾脏中的网状内皮系统(RES)的细胞快速清除，脂质体通过血流进行特异性给药的应用受到了严重影响。事实上，人们熟知较小的脂质体其血液循环寿命会增加(美国专利No.5,225,212)。可是，较小脂质体的血管内体积也较小，使其治疗价值甚微。为解决这个问题的另外一种尝试是使用结构如脂质体和纳米球的Ptx微胶囊(Bartoni D.and Boitard R.,1990,“In vitro and in vivo antitumor activity of free and encapsulated taxol”,J.Microencapsulation,vol.7:191-197)。尤其是脂质体制剂被证实至少与单独的Ptx同样有效。然而只有那些Ptx含量低于2%的制剂具有物理稳定性(Sharma A.etal.,1995,“Antitumor efficacy of taxane liposomes on a human ovarian tumorxenograft in nude athymic mice”.J.Pharm.Sci.vol.84:1400-4；Sharma U.S.et al.1995“Pharmaceutical and physical properties of paclitaxel(taxol)complexes withcyclodextrins”.J.Pharm.Sci.vol.84:1223-30)。另一方面，纳米球制剂被证实具有毒性。
这些制剂所要实现的重要特性是增加血浆循环时间。针对特别选定的器官或组织进行了生物分布研究；分析了组织匀浆样品中脂质体的脂质含量或所研究药物的含量。将含糖的脂分子，或如GM1神经节苷脂的含氨基酸基团的脂分子聚集到脂质体中显著降低了脂质体中的脂质在肝脏和脾脏中的蓄积。例如长春新碱，其制剂综合了pH 2的脂质体内部pH与存在于脂质体双分子层中的GM1。将包含2、3或4mg/kg药物的该制剂通过静脉注射对接种P388肿瘤细胞的小鼠进行给药，与对照组相比，这种给药极大地增加了这些小鼠的寿命。多个实验室还研究了通过模拟红血球表面以延长脂质体平均循环时间的可能性。
表面碳水化合物在细胞识别中的作用已被广泛研究(Ashwell G.and MorellA.G.,1974,“The role of surface carbohydrates in the hepatic recognition andtransport of circulating glyco-proteins”,Adv Enzymol 41:99-128;Hakormori S.,1981,“Glycosphingolipids in cellular interaction,differentiation,and oncogenesis”.Annu Rev Biochem.vol.50:733–764)。神经节苷脂和唾液酸的化学性质，代谢及生物功能也已被深入考虑(Schauer,R.,1982,“Chemistry,metabolism,andbiological functions of sialic acids”,Adv.Carbohydrate Chem.Biochem.40,131–23;Ledeen R.W.et al.,1998,“Sphinglolipids as signaling modulators in thenervous system”,Annals of the New Cork Academy of Science,Vol 845)。已有研究表明在由磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇组成的脂质体掺入GM1神经节苷脂可以显著地延长它们的平均血液循环时间(Bedu-Addo F.K.andL.Huang,1996,“Effectof matrix lipid chain length on liposomes containing cholesterol and GM1ganglioside:Implications in drug delivery”,Journal of Pharmaceutical Sciences,Volume 85,Issue 7,Pages 714–719)。
上述结果和阐述清楚地表明了目前需要开发包含水溶性疏水物质的制剂，其在包含有效剂量的比如紫杉醇、多烯紫杉醇和两性霉素B的活性药物的同时不会出现由上述药物的不溶性所带来的缺点。
极低水溶性药物制剂传统上一直使用乳剂和其他胶体缔合物，例如胶束，来制备；这种结构可溶解药物，并且还可以增加它们在水介质中的浓度(美国专利No.6,296,870)。然而，这些乳剂，特别是胶束悬浮液不一定稳定，而且不一定能到达特异靶位点。已知载有活性药物的乳剂和胶束比脂质体更加不稳定。一般认为，只有当胶束与组成胶束的表面活性单体处于平衡状态时，胶束才是稳定的。因此，在缺乏单体的情况下，胶束会解体成为水溶性单体，并最终完全稀释。同理，在缺乏单体时，微乳剂的液滴合并成大滴，并最终消逝。因此，当胶束制剂由于比如静脉给药之类的原因而稀释时，胶束会溶解并分散于介质中，其内容物会在几秒钟内泄漏到血流中。与之相似的是，乳剂制品表现了同样的不稳定特性。
其他快速清除胶束包裹药物的机理是通过与脂蛋白之间的相互作用来实现的。
附图说明
图1：将包含100mg单唾液酸神经节苷脂GM1
Figure BDA00002427418700071
GM2
Figure BDA00002427418700072
和GM3
Figure BDA00002427418700073
的样品稀释于1ml的蒸馏水(pH 5)中或者1ml 20mM醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中，轻轻搅拌，直到全部溶解。将溶液于4或8°C放置至少24小时。然后将清夜于50,000×g离心15分钟，并将上清夜通过0.22微米孔过滤。从每个100mg/ml的单唾液酸神经节苷脂溶液中取0.5ml试样，并将其与50微升Ptx含量递增的DMSO混合，以达到如下的Ptx-神经节苷脂关系：1/25、1/20、1/15和1/10。将溶液置于4°C温育1小时，而后在15,000×g离心15分钟以清除没有被胶束包封的不溶性Ptx。最后，样品置于蒸馏水或者20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中透析24小时以彻底清除DMSO。通过HPLC进行Ptx定量。
图2：将包含100mg GM1单唾液酸神经节苷脂的样品稀释于1ml的蒸馏水(pH 5)或者1ml 20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中，轻轻搅拌，直到全部溶解。将溶液于4或8°C静置至少24小时。然后将清夜于50,000×g离心15分钟，并将上清夜通过0.22微米孔过滤。从100mg/ml的溶液中取0.5ml试样，并将其与50微升Ptx含量递增的DMSO混合，以达到如下的Ptx-GM1关系：1/100、1/50、1/25和1/11。将溶液置于4°C温育1小时后在15,000×g离心15分钟以清除没有被GM1胶束包封的不溶性Ptx物质。最后，样品置于蒸馏水或者20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中透析24小时以彻底清除DMSO。从每个样品中取400ul试样，注射到AKTA Explorer分子过滤系统中，该系统采用Superdex G200层析柱及包含50mM NaCl的流动相磷酸缓冲液(pH 7)。分子量确定如下：
GM1
Figure BDA00002427418700074
365KDa(胶束)和1.6KDa(单体)
PTX/GM1：1/100
Figure BDA00002427418700075
→350KDa
PTX/GM1：1/50
Figure BDA00002427418700081
→315KDa
PTX/GM1：1/25
Figure BDA00002427418700082
→280KDa
PTX/GM1：1/11
Figure BDA00002427418700083
→255KDa
图3：将包含100mg GM1和LIGA
Figure BDA00002427418700085
的样品稀释于1ml的蒸馏水(pH 5)或者1ml 20mM pH为5的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中，轻轻搅拌，直到全部溶解。将溶液放置于4或8°C至少24小时。然后将清夜于50,000×g离心15分钟，并将上清夜通过0.22微米孔过滤。从每个100mg/ml的溶液中取0.5ml试样，并将其与50微升Ptx含量递增的DMSO混合，以得到如下的Ptx-GM1或Ptx-LIGA关系：1/25、1/20、1/15和1/10。将溶液置于4°C温育1小时后在15,000×g离心15分钟以清除没有被GM1胶束包封的不溶性Ptx物质。最后将样品置于蒸馏水或者20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中透析24小时以彻底清除DMSO。通过HPLC测定与胶束结合的PTX。
图4：将GM1溶液与浓度递增的Ptx混合，以得到如下Ptx摩尔关系：1/100、1/50、1/25、1/20、1/15、1/10和1/5。通过HPLC测定掺入GM1胶束的Ptx的量。
图5：将Ptx按照如下比例载入到神经节苷脂胶束中：1/10、1/15、1/20和1/25。载入过程用时30分钟，其中
Figure BDA00002427418700086
载入温度为0°C；GM1经过55°C预热，Ptx载入温度为0°C；
Figure BDA00002427418700088
GM1经过55°C预热，Ptx载入温度为25°C；中GM1的预热和载入都在55°C进行。通过HPLC测定以可溶形式掺入GM1胶束中的Ptx的量。
图6：将非肿瘤来源的VERO和MA细胞与浓度递增的如下物质混合：a)-
Figure BDA000024274187000810
Ptx的DMSO溶液、b)-
Figure BDA000024274187000811
Ptx-GM1比例为1/25的胶束、c)-
Figure BDA000024274187000812
GM1胶束以及d)-
Figure BDA000024274187000813
白蛋白-Ptx-GM1复合物的胶束。混合温育24小时后，用MTT化验标记法测定细胞活性。
图7：将肿瘤来源的HEP-2和HELA细胞与浓度递增的如下物质混合：a)-
Figure BDA000024274187000814
Ptx的DMSO溶液、b)-Ptx-GM1比例为1/25的胶束、c)-
Figure BDA000024274187000816
GM1胶束和d)-
Figure BDA000024274187000817
GM1-Ptx-白蛋白复合物的胶束。混合温育24小时后，用MTT法测定细胞活性。
图8：将GM1
Figure BDA000024274187000818
和比例为1/25的Ptx-GM1复合物
Figure BDA000024274187000819
样品与浓度递增的Dox混合，以得到摩尔关系为1/10、1/5、1/2.5和1/1的Dox-GM1复合物。通过分光光度法在492nm测定掺入胶束中的Dox的量。
图9：将包含5mg/ml GM1的GM1胶束与数量递增的纯化人血清白蛋白混合，以达到如下浓度：0.83、1.67、5、15和30mg/ml(终浓度)；它们代表的GM1-Alb关系(w/w)分别为：6/1
Figure BDA00002427418700091
3/1
Figure BDA00002427418700092
1/1
Figure BDA00002427418700093
1/3
Figure BDA00002427418700094
和1/6
Figure BDA00002427418700095
于37°C温育3小时。图A对应完整的色谱运行过程，而图B代表了A中所标出的插入框，并对应于分子量较高的色谱峰。
图10：将包含5mg/ml GM1且Ptx-GM1摩尔关系为1/25的Ptx-GM1胶束与数量递增的纯化人血清白蛋白混合，以达到如下浓度：0.83、1.67、5、15和30mg/ml(终浓度)；它们所代表的GM1-Alb关系(w/w)分别为6/1
Figure BDA00002427418700096
3/11/1
Figure BDA00002427418700098
1/3
Figure BDA00002427418700099
和1/6
Figure BDA000024274187000910
于37°C温育3小时。图A对应于整个色谱运行过程，而图B代表了图A中所标出的插入框，并且对应于分子量较高的色谱峰。
图11：将Ptx-GM1摩尔关系为1/25的Ptx-GM1胶束与数量固定的纯化人血清白蛋白混合，以达到1/1的GM1-Alb比例(w/w)。于4°C温育1小时
Figure BDA000024274187000911
4小时
Figure BDA000024274187000912
和24小时
Figure BDA000024274187000913
图A对应了整个色谱运行过程，而图B代表了图A中所标出的插入框，并且对应于分子量较高的色谱峰。
图12：将Ptx-GM1摩尔关系为1/25的Ptx-GM1胶束与数量固定的纯化人血清白蛋白混合，以达到1/1的GM1-Alb比例(w/w)。于37°C温育1小时
Figure BDA000024274187000914
4小时
Figure BDA000024274187000915
和24小时图A对应了整个色谱运行过程，而图B代表了图A中标出的插入框，并且对应于分子量较高的色谱峰。
图13：将Ptx-GM1摩尔关系为1/25的Ptx-GM1胶束与数量固定的纯化人血清白蛋白混合，以达到1/1的GM1-Alb比例(w/w)。于55°C温育1小时
Figure BDA000024274187000917
和4小时
Figure BDA000024274187000918
图中还包括了在55°C温育4小时的白蛋白样品，作为在该温度下蛋白稳定性的对照。
图14：将GM1溶液与AmB混合以得到GM1/AmB为1/51/15/1和25/1
Figure BDA000024274187000923
的最终摩尔关系。绘制每个样品从300至500nm的吸光光谱。图中附有溶于乙醇的AmB样品
Figure BDA000024274187000924
做为AmB单体状态的对照。比例为1/5和1/1的样品以聚集物形式存在，其最大吸光波长为345nm；而比例为5/1和25/1的样品则以单体形式存在，其最大吸光波长为365、385和410nm。
图15：用浓度固定为16μg/ml的AmB制备摩尔关系为5/1
Figure BDA000024274187000925
2.5/1
Figure BDA00002427418700101
1/1(-+-)和1/2.5
Figure BDA00002427418700102
的AmB-GM1胶束。制备GM1
Figure BDA00002427418700103
对照胶束和AmB
Figure BDA00002427418700104
对照胶束，以便研究它们单独存在时各自的效果；并且制备一个正对照
Figure BDA00002427418700105
和一个负对照
Figure BDA00002427418700106
以观察微生物生长情况。将不同的GM1-AmB制品和它们各自的对照与浓度为1x105细胞/ml的白色念珠菌(Candida albicans)溶液于96孔板中混合，并在37°C温育24小时。对板中的样品进行连续稀释，直至AmB最终浓度达到0.0625μg/ml。温育后，用分光光度法在波长610nm测量溶液的浑浊度，浑浊度表明了微生物的生长状况。
发明内容
本发明涉及水溶性药物组合物，其包含至少一种治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一种化合物，并且其中至少一种治疗活性成分为疏水性药物。优选地，所述疏水性药物选自抗肿瘤药物和抗真菌药物。
特别地，本发明的组合物应该适合用于病人静脉注射给药。更具体地，本发明的组合物为无菌半透明的注射剂。
优选地，本发明的药物组合物包括至少一种鞘糖脂，其优选选自神经节苷脂。在具体实施方式中，所述神经节苷脂选自单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂、三唾液酸神经节苷脂或它们的混合物。更具体地，单唾液酸神经节苷脂选自GM1、GM2或其混合物，二唾液酸神经节苷脂选自GD1a、GD1b或其混合物，而三唾液酸神经节苷脂则为GT1。本发明涉及药物组合物，其包含单唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂混合物，或二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂混合物，或者单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物。
具体实施方式
为了充分利用胶束结构作为负载和传递系统，将药物释放到血流中，有必要根据以下几个关键方面改善“背景技术”中所提到的胶束的表现：
1.避免由稀释现象而引起的胶束解体相关问题，
2.获得其表面，或物理化学和/或电学性质模拟红血球的结构，以避免它们之间的相互作用，和
3.使胶束被多聚物或蛋白包被，所述多聚物或蛋白可以i)稳定胶束-药物复合物和/或ii)充当将胶束传递到靶位点的试剂，
4.为了避免RES造成的药物快速释放到血流中而获得尽量小的结构，
5.另一方面，其分子量应大于40kDa，以避免被肾系统迅速清除。
本发明人开发了一种新型技术，极大地改善了以上“背景技术”中所提到的问题，特别地，本发明人研发了基于稳定纳米胶束的新型制剂，其可载入高浓度疏水药物。
由此，本发明在利用诸如神经节苷脂之类的两性分子的基础上，提出了新型胶束的用途。与其他所有聚合物胶束相反，这些分子的特征在于其显示了极低的临界胶束浓度(cmc)。神经节苷脂尤其是GM1和GM2单唾液酸神经节苷脂的cmc为约10-8M，这极大地增强了胶束结构的稳定性。特别地，提出了在高于cmc的浓度下使用神经节苷脂。这样可以获得高唾液酸含量的结构，从而获得与红血细胞相似的电负性。
前面已经提到过在神经节苷脂分子中和在诸如血型糖蛋白的糖蛋白中存在唾液酸对于细胞膜表面特性的重要性。此外，唾液酸还对GR的寿命以及循环中的血小板和淋巴细胞起到作用。酶解清除唾液酸会暴露半乳糖末端，导致循环中的GR被迅速清除并被肝脏巨噬细胞(Kupffer cell)俘获。
在具体实施方式中，本发明人阐述了带有紫杉醇的神经节苷脂胶束的分子量(MW)在150至350kDa的范围。
本发明人已阐明神经节苷脂胶束具有高度稳定型，特别是那些通过透析法由GM1形成的胶束。结果显示总胶束中大约有25%在透析72小时后消失，这些结果与Formisano等发表的结果(“Critical micelle concentrations ofgangliosides”;1979,Biochemistry 18:1119-1124)相符合。然而，当胶束中载入了例如Ptx或Dtx的疏水性药物而形成GM1-Ptx或GM1-Dtx复合物的时候，通过透析损失的GM1和药物量则分别低于5%和10%；这说明疏水分子自身可以调节胶束解体机制，从而有利于胶束形式的稳定。同理，神经节苷脂胶束，特别是GM1组成的胶束可以载入其他肿瘤药物，比如Doxo，从而形成GM1-Doxo复合物。
在具体实施方式中，由神经节苷脂，特别是GM1神经节苷脂组成的胶束系统可以在同一胶束表面同时掺入两种肿瘤药物：最疏水的药物比如Ptx或Dtx进入胶束核心，而最亲水的药物比如Doxo进入另一胶束区域；这样即可获得稳定的水溶性GM1-Ptx-Doxo三元复合物。
在本发明提出的条件下，GM1纳米胶束以及GM1-Ptx或GM1-Ptx-Doxo胶束可以自发地通过疏水样相互作用以非共价方式与白蛋白分子相互作用，从而组成新型的高度稳定的复合物或结构。通过白蛋白与受体(SPARK)的结合，所述复合物可以引发穿越内皮细胞而向间质性介质的胞吞转运；如白蛋白-Ptx复合物(称为ABI007)所显示的，这里即为肿瘤组织所在区域。
另一方面，在具体实施方式中，可以预先将GM1-Ptx复合物注射到装有人白蛋白，人全血清或人全血浆的输液袋中，从而将其递送到人体中；在此，GM1-Ptx复合物与白蛋白特异结合，使GM1-Ptx-Alb或GM1-Ptx-Doxo-Alb的三元或四元复合物具有生物活性。
本发明中组合物的优点之一在于由于其cmc低(约10-8M)，这些神经节苷脂胶束的高稳定性提高了疏水生物活性物质在水介质中保持可溶性的能力；因此，提高了在此结构中的生物活性物质循环时间。另一方面，由于该组合物极大减少了不良副作用，从而使其治疗活性得到显著改善。
因此，本发明的目的之一是介绍一种包含由唾液酸鞘糖脂-胶束构成的载体的制剂，即经过调整高于其cmc的唾液酸鞘糖脂或鞘糖脂的混合物，尤其是神经节苷脂胶束，更具体地，是单唾液酸神经节苷脂，优选GM1、GM2胶束或它们的混合物，其允许非共价地掺入疏水药物。特别地，本发明包括以神经节苷脂-纳米胶束作为载体的制剂，其中所述神经节苷脂为GM1，其允许以非共价方式掺入疏水药物，例如Ptx、Dtx或两性霉素B，从而产生高度水溶性的复合物，该复合物可以通过与诸如白蛋白之类的血浆蛋白之间的疏水相互作用而被其以非共价的方式选择性地包被。
因此，本发明的目的之一是产生水溶性药物组合物，其包含至少一种治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一种或多种化合物，并且其中至少一种治疗活性物质为疏水性药物。在具体实施方式中，所述治疗活性物质选自抗肿瘤药物和抗真菌药物；在其他实施方式中，则选自抗生素和类固醇激素。
在本发明中所使用的，术语“治疗活性物质”、“药物”、“主要活性成分”、“活性药物”和“生物活性物质”应该理解为等同含义。
依照优选的实施方式，本发明的药物组合物可适用于静脉注射给药。更优选地，所述药物组合物为稳定而半透明的静脉注射用组合物。特别地，本发明的水溶性药物组合物可以被冻干，或者以冻干的形式存在。在这种情况下，可以用诸如蒸馏水，盐溶液(NaCl 0.9%)，磷酸盐缓冲液(PBS)，5%的葡萄糖蒸馏水溶液和5%的葡萄糖盐溶液的溶剂将所述组合物重溶。本发明的又一具体目的在于生产水溶性无菌冻干药物组合物，所述组合物可以重悬，从而使抗肿瘤药物，比如Dtx或Ptx的最终浓度达到0.1至10mg/ml的范围，优选0.1至6mg/ml，更优选1至6mg/ml。
优选地，本发明中的水溶性药物组合物应包含至少一种治疗活性物质和一种或多种鞘糖脂；后者优选选自神经节苷脂。更优选地，在神经节苷脂中，优选单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂、三唾液酸神经节苷脂或它们的混合物。在更优选的实施方式中，所述单唾液酸神经节苷脂选自GM1、GM2或它们的混合物；所述二唾液酸神经节苷脂选自GD1a、GD1b或它们的混合物，而所述三唾液酸神经节苷脂则为GT1。同理，优选的神经节苷脂混合物选自于单唾液酸神经节苷脂和二唾液酸神经节苷脂的混合物，单唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物，二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物以及单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物。
优选在本发明的水溶性药物组合物中，疏水性药物以非共价方式与神经节苷脂结合，且神经节苷脂形成纳米胶束。更优选地，纳米胶束的pH在pH 3至pH 7的范围。在更优选的实施方式中，纳米胶束的pH在pH 4至pH 6的范围。
特别地，本发明的水溶性药物组合物，其纳米胶束平均小于200nm，更具体地，小于100nm，优选介于10nm和80nm之间，更优选介于10nm和50nm之间。
神经节苷脂为两性分子，具有由鞘氨醇和脂肪酸(比如硬脂酸)组成的亲脂部分，和由碳水化合物组成的亲水部分，其至少包括1到4个单糖和1到3个唾液酸分子，从而产生已知的各种神经节苷脂。已知这些复杂的糖脂为水溶性酸并且透析性能极差。由于神经节苷脂主要与神经组织膜相关联，所以人们提出其可在跨膜信息传输中起到作用(Ledeen R.W.y col.,1998,“Sphinglolipids assignaling modulators in the nervous system”.Annals of the New Cork Academy ofScience Vol 845)。特别是GM1单唾液酸神经节苷脂与鼠小脑中的神经元分化过程相关(Willinger M.and Schachner M.,1980,“GM1 ganglioside as a marker forneuronal differentiation in mouse cerebellum”,Dev Biol.74(1):101–117)并且与霍乱毒素受体相关(Wu,G.and Leeden,1988,“The ganglioside-GM1 is the specificreceptor for the cholera toxin”,Anal R..Biochem.,vol.173,p.368-375)。
本发明所使用的神经节苷脂可从包含这些脂质的动物中获得。具体地，可以获取自动物的神经组织，例如选自哺乳和非哺乳动物的动物，例如猫、牛、猪、马和鱼。
本发明中的神经节苷脂胶束具有多方面用途，不仅可以溶解并结合高水溶性分子或大分子，还可以溶解并结合不溶性分子。胶束为胶质的结合体，其包含强各向异性的区域和由外到内递减的水溶性梯度。这是使得胶束可以广泛地溶解其他溶质的性质之一。
胶束可以溶解不可溶的有机物质，这是由于其可将所述物质掺入到它的高疏水区域。位于烃链最外端部分的3或4个碳原子均为反式，因此该部分的流动性较差。因此，此区域的疏水性弱，而由此可以部分水合。这样就在纯疏水区和纯亲水区之间呈现了一个过渡区域。进入该区域的分子必定与脂链的疏水部分和极性头的溶剂化区域都稍稍相容，因此必然表现为两性分子。当主要活性成分具有疏水性时，它们倾向于通过和脂肪酸的疏水链相互作用而直接定位于胶束深部。
至于胶束极性头部，其组成成分范围广泛；这意味着每种胶束可能具有一系列不同的表面性质，这可以用来结合一系列活性物质。在这种离子胶束中，极性头部可以结合大量的反离子；而由此与电解质浓缩液相似。此外，见于经载入胶束中的弥散性离子双层还延伸到所谓的腹层(stern layer)。
胶束可以溶解活性物质并且构成了俘获和掺入不溶或部分不溶分子的优良系统。人们提出这种分子分配可能限于相对较小的分子，小分子可以适应脂肪酸链的高度各向异性结构，这是因为它们占据了中间区域或是它们可被容纳在脂肪酸链中。由此胶束可以充当用于将完全或部分不溶于水的药物直接运输进入硬脂酸烃链的活性物质。
本发明阐述了包含生物活性药物的脂质胶束的多种组合物及其获得方法和用途。本发明一方面阐述了一系列的胶束制剂，其可掺入生物活性药物，还可掺入pH介于3和7之间的缓冲溶液。
在本发明的具体实施方式中，所述水溶性药物组合物包含5份和15份单唾液酸神经节苷脂，配以1份二唾液酸神经节苷脂(En una realización particular,la composición farmacéutica soluble en agua de la invención comprende alrededorde 1 parte de disialogangliósidos por cada alrededor de entre 5y 15 partes demonosialogangliósidos)。在另一实施方式中，所述组合物包含5份和15份单唾液酸神经节苷脂，配以1份三唾液酸神经节苷脂(En otra,comprende alrededor de1parte de trisialogangliósidos por cada alrededor de entre 5y 15 partes demonosialogangliósidos)。在另外的实施方式中，所述组合物包含1份三唾液酸神经节苷脂和10份二唾液酸神经节苷脂。
在另一具体实施方式中，本发明的水溶性药物组合物包含一种或多种鞘糖脂，其选自包含糖苷域共价偶联叶酸的神经节苷脂，或包含唾液酸共价偶联叶酸的神经节苷脂。具体地，包含共价偶联叶酸的神经节苷脂占组合物中总神经节苷脂的0.5%和15%。
在本发明的优选实施方式中，水溶性药物组合物包含Ptx或多烯紫杉醇(Dtx)。优选其中的Ptx或Dtx药物与神经节苷脂之间的摩尔比例介于1:10和1:100之间。更优选，Ptx或Dtx介于0.1mg/ml到6mg/ml之间，而神经节苷脂介于4mg/ml至300mg/ml之间。在另一个具体实施方式中，本发明的水溶性药物组合物包含Doxo，且Doxo与神经节苷脂之间的摩尔比例为1:1和1:50。在另一个特别优选的实施方式中，本发明的水溶性药物组合物包含Doxo及选自Ptx和Dtx的至少一种药物，每种药物与神经节苷脂之间的摩尔比例为1:10和1:100。
在本发明另一优选实施方式中，所述水溶性药物组合物包含两性霉素B，优选两性霉素B与神经节苷脂之间的摩尔比例介于2:1至1:5之间，更优选两性霉素B与神经节苷脂之间的摩尔比例为01:1。在另一优选的实施方式中，所述组合物包括的两性霉素B介于0.1mg/ml至10mg/ml之间而神经节苷脂则介于0.18mg/ml至10mg/ml之间。
在本发明特别优选的实施方式中，所述水溶性药物组合物包含神经节苷脂纳米胶束，其以非共价方式由人血清白蛋白、重组人血清白蛋白或牛白蛋白包被，更优选，由包含脂肪酸的人血清白蛋白包被。更具体地，由含或不含脂肪酸的人血清白蛋白进行包被，其中GM1-白蛋白比例为2:1(W/W)。
在另一具体实施方式中，本发明包括水溶性药物组合物，其中神经节苷脂纳米胶束由包含共价偶联叶酸的白蛋白包被，更具体地，与叶酸共价偶联的白蛋白的量占总白蛋白的1到20%之间。
例如，当向患者给药时，可将本发明的水溶性药物组合物注射到包含人白蛋白的塑胶袋中(类似输液用塑胶袋)，以容许GM1-Ptx、GM1-Dtx、GM1-Ptx-Doxo、GM1-AmB纳米胶束与白蛋白结合。
值得注意的是，相对于根据例如美国专利No.5,171,578和No.5,077,056中所描述的利用脂质体脂双层间的跨膜电位向脂质体载入生物活性剂的一般方法，本发明中所描述的胶束载入过程显示了重要的差别。
本发明的制剂可以通过被动载入的方法制备。例如，可以使用例如在低温或高温下温育，以在此期间自发进行掺入的简单方法，将浓度的生物活性药物包封到神经节苷脂纳米胶束中。另一方面，人血清白蛋白自发地以疏水样相互作用的方式非共价地包被GM1胶束表面；这种包被最终产生由GM1-药物-白蛋白构成的三元复合物，或者当白蛋白包含共价方式掺入的叶酸时，产生四元复合物：GM1-药物-白蛋白-叶酸。
所述过程可概述如下：通过缓慢振荡，使GM1单唾液酸神经节苷脂稀释于蒸馏水中，随后，于4和8°C静置至少24小时。此温育时间允许神经节苷脂胶束形成尺寸小于200nm的稳定结构。然后，将神经节苷脂胶束与包含完全可溶的疏水性肿瘤药物的溶剂(如乙醇或二甲基亚砜)混合，其中所述神经节苷脂胶束与所述溶剂的体积比为1/10(vol/vol)。将样品于4和8°C温育至少4小时。然后，通过透析将有机溶剂从神经节苷脂胶束中除去。使用在pH合适的静脉注射用药物级溶液进行所述透析。将掺入药物、基本不含有机溶剂且pH值适宜的胶体制剂在15,000和30,000×g离心15分钟以清除没有掺入胶体的不溶性的不良疏水化合物。
随后，将包含捕获或包封的抗肿瘤药物或抗真菌药物的纳米胶束透明含水制剂与纯化人白蛋白，包含共价偶联叶酸的纯化人白蛋白，人全血浆或人全血清温育，以便确保白蛋白/GM1胶束的相互作用。此温育在37°C进行8小时，或于55°C进行30分钟。最后将由GM1和Ptx或GM1-Ptx-白蛋白复合物组成的制剂冻干。
因此，本发明还涉及用于获得胶束的方法，所述胶束包含至少一种疏水性生物活性药物的胶束的程序，所述方法包括如下步骤：
(a)将神经节苷脂溶解于蒸馏水或pH介于3与7之间的盐溶液中，保持其浓度一直高于cmc，并将溶液于4°C静置至少24小时；
(b)向按前一步骤所得到的神经节苷脂胶束溶液中加入大约10%的包含所选生物活性药物的二甲基亚砜或乙醇溶液；
(c)将所述混合物在介于4和8°C之间的低温或45和60°C之间的高温下温育足够的时间，优选1到4小时，以保证生物活性药物正确掺入到胶束中；随后，
(d)在介于4和8°C之间的温度下，将包含生物活性成分的胶束溶液在蒸馏水溶液或pH介于3与7之间的药学可接受的溶液中透析24小时，以彻底清除有机溶剂；
(e)将GM1-药物组成的胶束与人血清白蛋白混合，在介于45和60°C之间的温度下温育1小时，或在37°C温育8小时，以便形成GM1-药物-白蛋白三元复合物；
(f)将前一步骤中所得的掺入疏水性生物活性药物的GM1胶束透明含水溶液通过0.1或0.2微米的过滤消毒；
(g)将无菌胶束冻干；和
(h)最后，将冻干的胶束重悬于药学可接受的溶液中，用于治疗疾病的静脉注射给药。
可以用光谱技术或适当的色谱技术，如高压液相色谱(HPLC)，测定掺入到神经节苷脂纳米胶束中的不同生物活性药物(Ptx、Dtx、Doxo、AmB等)的量。
可以用合适的溶剂进行神经节苷脂纳米胶束的载入。特别地，可以使用预先溶解于诸如乙醇或二甲基亚砜之类的有机溶剂中的抗肿瘤药物，如Dtx或Ptx来进行胶束的载入。在具体实施方式中，用于将多烯紫杉醇和紫杉醇掺入到神经节苷脂纳米胶束中的乙醇或二甲基亚砜的量占总体积的1到15%。同理，也可在4到6°C之间的温度进行载入。
可通过适用于此目的的方法清除用于纳米胶束载入的溶剂和/或游离的治疗活性物质。例如，可以通过透析或用Sephadex G25分子过滤法清除。
如前所述，可使用上述被动掺入法将一种或多种药物载入到这些稳定的单唾液酸神经节苷脂纳米胶束中。概括来说，利用本发明的纳米胶束组合物可以获得大多数疏水性药物的透明含水溶液，这些药物倾向于分配于并稳定存在于神经节苷脂胶束中由神经酰胺组成的疏水部分。
类似于Ptx、Dtx、Dox、AmB和黄体酮的且可以掺入到本发明的组合物中的其他药物则由油/水分配系数定义，作为标准油/水混合物(如辛醇/水)中的量度，所述油/水分配系数应大于1，优选大于5。此类中的代表药物包括前列腺素，二硝酸异山梨酯，睾酮，硝化甘油，雌二醇，维生素E，可的松，地塞米松及其酯，和戊酸倍他米松。
依其结构与形式的不同，神经节苷脂胶束在掺入药物时显示了不同的性能。从这个意义上来讲，本发明人所得到的结果清楚地表明了当寡糖亲水链的长度由GM1降低到GM2并进一步降到GM3时，这些脂质的结构发生了变化。这意味着GM1和GM2保持了胶束结构，而GM3不再具有胶束结构，而是具有囊泡结构。这些结构变化导致药物掺入减少；其中GM1掺入能力最强，GM2较低，而GM3则大大降低，这要归咎于它所形成的结构效力最低(参见图1)。
电子显微镜研究表明本发明中的GM1胶束不是球形而是椭圆体。此结果揭示疏水药物/胶束混合物使胶束尺寸发生了改变。与预期相反，这种改变说明在GM1胶束中掺入紫杉醇形成GM1-Ptx复合物会使其分子量减小(参看图2)。
不参考任何特定的解释，该结果至少可用两种假设解释：药物致使胶束中的GM1单体数量减少，或者药物致使胶束形式改变，使其由椭圆体变成球状从而形成较小的流体力学半径，最后产生较低的分子量。
另一方面，众所周知，聚集数(aggregation number)是影响胶束几何结构的因素，而聚集数则由单体结构而定。特别是在本研究中，当形成GM1胶束的GM1单体中硬脂酸被氟乙酰基取代时，产生了命名为LIGA的新型化合物。这种新型GM1胶束的聚集数由300变到100-120个GM1单位(LIGA)。这使得胶束尺寸减小，并显著降低了药物掺入(参看图3)。
实施例
实施例1
在GM1神经节苷脂中载入紫杉醇
将包含30、100、300和600mg GM1神经节苷脂的样品溶解于2ml蒸馏水(pH 5)中或溶解于2ml 20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中，振荡以使其完全溶解。将溶液于4或8°C静置至少24小时。然后将透明溶液于50,000×g离心15分钟，上清液通过0.22微米孔过滤。
从每一浓度的溶液(分别为15mg/ml、50mg/ml、150mg/ml和300mg/ml)中取0.5ml试样，并将其与50μl紫杉醇(Ptx)含量递增的DMSO混合，以达到以下的Ptx-GM1摩尔比例：1/100、1/50、1/25、1/20、1/15、1/10和1/5。将溶液置于4°C温育1小时，然后于15,000×g离心15分钟以清除没有包封于GM1胶束内的不溶性紫杉醇物质。最后，为了除去所有DMSO，将样品置于蒸馏水或20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中透析24小时。
用HPLC测定掺入GM1胶束的Ptx的量。图4显示，当所述比例为1/100至1/25时，与GM1结合并保持可溶的Ptx所占的百分比几乎是恒定的；在上述比例范围，掺入的Ptx量占添加到介质中Ptx总量的95%。当所述比例由1/25增高到1/5时，观察到与GM1结合的可溶性Ptx的量分别下降到90%、60%、30%，以至10%。
实施例2
温度对在GM1胶束中载入Ptx的影响
如实施例1中所示，将Ptx按照1/10、1/15、1/20、1/25的摩尔关系载入到神经节苷脂胶束中，但每个载入过程分别在如下温度下进行30分钟：
1)A-0°C(对照)；
2)B-GM1预热至55°C并于0°C载入Ptx；
3)C-GM1预热至55°C并于25°C载入Ptx；
4)D-GM1预热与载入都在55°C进行。
温育过后，将样品于15,000×g离心15分钟，并使用蒸馏水在4°C透析24小时。最后，用HPLC测量掺入GM1胶束的可溶形式Ptx的量。图5显示，当所述比例为1/25时，Ptx载入时的温度变化没有明显提高掺入率；在所有条件下，载入率均超过90%。然而，在更高的比例下，观察到与0°C相比，在55°C进行载入的Ptx载入率分别增加了20%、50%和80%。
实施例3
Ptx-GM1与Ptx对肿瘤和非肿瘤细胞培养影响的体外对比研究
将不同类型的细胞，肿瘤细胞(如HEP-2和Hela细胞)以及非肿瘤细胞(如VERO和MA细胞)，置于包含2%牛胎血清的MEM培养基(Natocor-Villa CarlosPaz-Córdoba-Argentina)中，于含5%CO2的CO2培养箱中培育至汇合。在细胞培养中加入不同浓度的下述组合物：
a)–溶于DMSO的Ptx，作为正对照；
b)–摩尔比例为1/25的Ptx-GM1胶束；
c)–与b)中同样浓度的GM1胶束，作为GM1自身作用的对照；和
d)–白蛋白-Ptx-GM1复合物的胶束。
培养24小时后，由MTT法测定细胞存活率。
图6和7表明单独的GM1并不能对任何类型的细胞构成影响，而溶于DMSO的Ptx和Ptx-GM1制剂则在浓度达到10ng/ml使肿瘤细胞在24小时内全部死亡，在达到100ng/ml时非肿瘤细胞在24小时内全部死亡。当制剂包含白蛋白-Ptx-GM1三元复合物时，需要在肿瘤细胞中达到20ng/ml的浓度，在非肿瘤细胞中达到200ng/ml的浓度才能得到同样效果。
实施例4
在GM1或Ptx-GM1胶束中掺入阿霉素
通过搅拌，将10、30、150、300和600mg纯化的GM1单唾液酸神经节苷脂溶解于2ml蒸馏水(pH 5)或20mM的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5)中，直至其完全溶解。将溶液在介于4和8°C之间的温度下静置至少24小时。将溶液于50,000×g离心15分钟，上清液通过0.22μm微孔过滤。使用该制剂进行两份阿霉素载入试验：
(a)阿霉素与GM1，和
(b)阿霉素与Ptx-GM1的复合物。
对于a)从包含15mg/ml,75mg/ml,150mg/ml和300mg/ml的每种制剂中取0.5ml试样，将其与50μl阿霉素溶液混合以使Dox-GM1复合物的摩尔比例达到1/15、1/10、1/5、1/2.5和1/1。将溶液再次于4°C放置1小时后，在15,000×g离心15分钟，以除去可能存在的不溶性聚集物。最后，将样品于4°C透析24小时以除去可能存在的游离阿霉素。
对于b)预先将Ptx载入到GM1胶束中使Ptx-GM1的摩尔比例为1/25，然后按a)中所描述的进行试验。
用分光光度法在490nm测定掺入到GM1胶束中的阿霉素的量。
图8显示，当摩尔比例从1/15到1/10时，结合于GM1和Ptx-GM1的Doxo百分比几乎保持恒定。当所述比例从1/5升高到1/1时，观察到GM1胶束的Doxo量分别减少了5%、8%至55%，而Ptx-GM1胶束的Doxo量则减少了15%、20%和62%。
实施例5
在GM1和Ptx-GM1胶束中掺入白蛋白
制备如上述实施例中所描述的GM1和Ptx-GM1胶束，其包含5mg/ml GM1并且Ptx-GM1的摩尔关系为1/25。将这些胶束与增量的纯化人血清白蛋白(Laboratorio de Hemoderivados dependiente de la Universidad Nacional deCórdoba)混合以达到如下终浓度：0.83、1.67、5、15和30mg/ml。将样品置于37°C温育3小时。
如图9和图10所示，当把GM1和Ptx-GM1胶束与白蛋白一起在37°C温育时，观察到由于结合作用而出现了由GM1、Alb和Ptx组成的分子量不同的三类群体。其中之一的分子量约为600-700kDa，并且分子量随白蛋白浓度而逐渐升高，另一类群的分子量为500-550kDa，而最后一个类群的分子量为180-190kDa。
另一方面，Ptx-GM1摩尔关系为1/25且包含5mg/ml GM1的Ptx-GM1胶束与5mg/ml白蛋白同样于4、37和55°C这三个温度下温育1至24小时。
图11、12和13分别对应了与白蛋白在4、37和55°C下的温育，如图所示，在所检测的三个温度下，Ptx-GM1复合物与介质中所添加的白蛋白相互作用。这种相互作用在较高温度下更快地达到最大峰值。
实施例6
在GM1胶束中掺入两性霉素B(AmB)
复合物形成的光谱分析
将0.9ml包含不同浓度GM1的H2O与0.1ml AmB的DMSO溶液(40mg/ml)混合以使得GM1/AmB的最终摩尔比例为：1/5、1/1、5/1和25/1。所述样品于室温下温育10分钟后，在4°C透析24小时。最后，将所得溶液在15,000×g离心15分钟以清除可能存在的不溶性聚集物。为了确定掺入GM1胶束中的AmB量，从溶液取样并稀释于200倍乙醇中，测量在410nm下的吸光度并与经同样条件处理的AmB对照曲线进行对比。
此外，用300到500nm的光谱分析评估所存在的单体状态或AmB聚集状态。为此，在水中进行稀释，以便不改变聚集状态(参看图14)。在每个所测比例下，当AmB浓度增加时，峰强度即发生变化。这可以解释为AmB存在两个主要光谱状态：单体形式在365、385和410nm吸光度最大，而AmB聚集形式在345nm吸光度最大。
实施例7
载入两性霉素B的胶束对白色念珠菌的生长抑制活性
用浓度固定为16μg/ml的AmB制备摩尔比例为1:5、1:2.5、1:1和2.5:1的GM1-AmB胶束。另外制备GM1胶束和AmB对照。将体积100μl的不同GM1-AmB制剂及其各自的对照与900μl浓度为1x105细胞/ml的白色念珠菌溶液在96孔板中混合，并在37°C温育24小时。在板内进行连续稀释使AmB的终浓度达到0.0625μg/ml。温育后，用分光光度法在610nm检测溶液的浑浊度，所述浑浊度代表了微生物的生长。图15表明比例为1:5的GM1-AmB复合物与AmB对照产生了同等水平的细胞生长抑制。另一方面，在1:2.5和1:1的比例所产生的生长抑制仅略低于对照组。比例为2.5/1的GM1-AmB复合物则对细胞的生长产生了极低的抑制。

Claims (49)

1.水溶性药物组合物，其特征在于，包含至少一种治疗活性物质和选自唾液酸鞘糖脂、鞘糖脂或唾液酸鞘糖脂和鞘糖脂的混合物的至少一种物质，其中所述治疗活性物质中的至少一种为疏水性药物。
2.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述疏水性药物选自抗肿瘤药物和抗真菌药物。
3.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其可通过注射给药。
4.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其为可注射的无菌半透明物质。
5.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述鞘糖脂选自神经节苷脂。
6.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂选自单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂、三唾液酸神经节苷脂或它们的混合物。
7.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述单唾液酸神经节苷脂选自GM1、GM2或它们的混合物。
8.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述二唾液酸神经节苷脂选自GD1a、GD1b或它们的混合物。
9.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述三唾液酸神经节苷脂为GT1。
10.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含单唾液酸神经节苷脂和二唾液酸神经节苷脂的混合物。
11.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含单唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物。
12.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物。
13.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂的混合物。
14.如权利要求10所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含1份二唾液酸神经节苷脂和0.1至10份的单唾液酸神经节苷脂。
15.如权利要求11所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含1份三唾液酸神经节苷脂和0.1至10份的单唾液酸神经节苷脂。
16.如权利要求12所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含1份三唾液酸神经节苷脂和0.1至10份的二唾液酸神经节苷脂。
17.如权利要求4所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含一种或多种鞘糖脂，所述鞘糖脂选自包含糖苷域共价偶联叶酸的鞘糖脂，或包含唾液酸共价偶联叶酸的鞘糖脂。
18.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述包含共价偶联叶酸的神经节苷脂占所述组合物中总神经节苷脂的0.5%到15%。
19.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂组合物包含1%到25%的与聚乙二醇共价偶联的磷脂酰乙醇胺。
20.如权利要求5所述的水溶性药物组合物，其特征在于，一种或多种所述疏水性药物非共价地与神经节苷脂结合，且所述神经节苷脂以胶束形式存在。
21.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含紫杉醇，且紫杉醇/神经节苷脂摩尔比例介于1:10和1:100之间。
22.如权利要求20所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含多烯紫杉醇，且多烯紫杉醇：神经节苷脂的摩尔关系介于1:10和1:100之间。
23.如权利要求21或22所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含0.1mg/ml至约6mg/ml的紫杉醇或多烯紫杉醇，以及4mg/ml至300mg/ml的神经节苷脂。
24.如权利要求20-23中任一项所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束的pH介于3和7之间。
25.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束的pH介于4和6之间。
26.如权利要求20-25中任一项所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束平均小于100nm。
27.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束平均介于10nm和60nm之间。
28.如权利要求20所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含阿霉素，且阿霉素/神经节苷脂的摩尔比例介于1:1和1:50之间。
29.如权利要求20所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含阿霉素和至少一种选自紫杉醇和多烯紫杉醇的药物，且每种药物：神经节苷脂的摩尔关系介于1:10和1:100之间。
30.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束的pH介于3和7之间。
31.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束的pH介于4和6之间。
32.如权利要求20所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含两性霉素B，且两性霉素B/神经节苷脂的摩尔比例介于2:1和1:5之间。
33.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含两性霉素B，且两性霉素B/神经节苷脂的摩尔比例为1:1。
34.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其包含0.1mg/ml至10mg/ml的两性霉素B和0.18mg/ml至10mg/ml的神经节苷脂。
35.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束平均小于200nm。
36.如权利要求32-35中任一项所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束平均介于10nm和80nm之间。
37.如权利要求32-36中任一项所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束的pH介于3和7之间。
38.如权利要求32-37中任一项所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述纳米胶束的pH介于4和5之间。
39.如权利要求20-38中任一项所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂纳米胶束由人血清白蛋白、重组人血清白蛋白或牛白蛋白非共价包被。
40.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂纳米胶束由人血清白蛋白非共价包被。
41.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂纳米胶束由含脂肪酸的人血清白蛋白非共价包被。
42.如权利要求40或41所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂纳米胶束由含或不含脂肪酸的人血清白蛋白包被，其比例为GM12:1W/W。
43.如权利要求39所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述神经节苷脂纳米胶束由包含共价偶联叶酸的白蛋白包被。
44.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述共价偶联叶酸的白蛋白占总白蛋白的1至20%。
45.如权利要求6所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其为冻干组合物。
46.如前述权利要求所述的水溶性药物组合物，其特征在于，其由选自蒸馏水、盐溶液(NaCl 0.9%)、磷酸盐缓冲液(PBS)、5%的葡萄糖蒸馏水溶液和5%的葡萄糖盐溶液中的溶剂重溶。
47.如权利要求7，21，22，29或32所述的水溶性药物组合物，其特征在于，在给药前将其注射到装有人白蛋白和适当溶剂的塑胶袋中以使GM1-紫杉醇纳米胶束、GM1-多烯紫杉醇、GM1-紫杉醇-阿霉素、GM1-两性霉素B与白蛋白结合。
48.如权利要求1中所述的水溶性药物组合物，其特征在于，所述疏水性药物选自前列腺素，二硝酸异山梨酯，睾酮，硝酸甘油，雌二醇，维生素E，可的松，地塞米松及其酯，以及戊酸倍他米松。
49.用于获得包含至少一种纳米包封的治疗活性物质的胶束的方法，其特征在于包括：
(a)在蒸馏水中或pH为3到7的盐溶液中溶解神经节苷脂，使其浓度一直保持在cmc之上，并使溶液静置24小时，
(b)在前一步骤中所得的神经节苷脂胶束溶液中加入约10%的包含所选治疗活性物质的二甲亚砜或乙醇溶液，
(c)将所述混合物温育以确保所述治疗活性物质掺入所述胶束，
(d)将包含所述治疗活性物质的胶束溶液在蒸馏水溶液或pH介于3与7之间的药学可接受溶液中透析，以便彻底清除所述有机溶剂，
(e)将由GM1-治疗活性物质复合物组成的胶束与人血清白蛋白一起温育以使GM1-治疗活性物质-白蛋白三元复合物形成；
(f)将前一步骤中所得的包含掺入GM1胶束的所述治疗活性物质的透明含水溶液通过0.22微米孔，以进行灭菌；
(g)将所述无菌胶束冻干，和
(h)最后将所述冻干胶束重悬于药学可接受的溶液中。
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