CN102901827B - 一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒 - Google Patents
一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102901827B CN102901827B CN201210283107.2A CN201210283107A CN102901827B CN 102901827 B CN102901827 B CN 102901827B CN 201210283107 A CN201210283107 A CN 201210283107A CN 102901827 B CN102901827 B CN 102901827B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- kit
- antibody
- agglutinin
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active - Reinstated
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属分子生物学特别是糖生物学领域,涉及检测CA125表面Tn抗原的试剂盒。具体涉及一种检测CA125表面Tn抗原的的抗体-凝集素ELISA试剂盒。所述试剂盒通过包被在96孔板上的CA125抗体捕获血清中的CA125,继而利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量,可用于判断CA125升高患者是否患有恶性妇科肿瘤。本发明所述的试剂盒检测省时,所需血清样本易于取得,用于区分良恶性CA125升高患者准确度高。
Description
技术领域
本发明属分子生物学特别是糖生物学领域,涉及检测CA125(cancer antigen125,癌抗原125)表面Tn抗原的试剂盒。具体涉及一种检测CA125表面Tn抗原的的抗体-凝集素ELISA试剂盒。
背景技术
现有技术公开了癌抗原125是一种高度糖基化的粘蛋白,其中糖链部分约占整个分子质量的20%-70%。有研究表明,约80%的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高,其水平的显示能够很好的反应机体肿瘤负荷,因此,癌抗原125(cancer antigen 125,CA125)成为目前妇科最常用的血清肿瘤标志物以及临床卵巢癌治疗后的主要监测随访指标。据研究显示,除了卵巢癌,血清CA125水平在许多其他良、恶性疾病中也发现有异常升高,如:血清CA125水平在1%左右的健康女性中有升高,在6%左右的子宫内膜异位症、盆腔炎、妊娠等妇产科良性疾病中有升高,在肝硬化、慢性活动性肝炎、急性心衰等内科疾病以及部分胰腺癌、肺癌、肝癌等其他系统癌症患者中也有升高。此外,无论良性或恶性腹水患者,其血清CA125水平都显示有异常升高。据临床诊断发现,目前妇科良性疾病出现了较高的发病率,如子宫内膜异位症在育龄妇女中发病率高达15%以上,同时其临床表现如盆腔包块、盆腔积液等与卵巢癌临床表现类似,因此,致使对其的诊疗方案的制定带来了困难,且给有关患者带来不必要的精神负担。
大量的研究表明,恶性肿瘤常伴随着糖链合成、降解以及连接相关分子的异常改变,从而导致其合成的蛋白出现异常糖基化状态。生理状况下,所述CA125由苗勒氏管上皮,即输卵管内膜、子宫内膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宫颈内膜,腹膜、胸膜以及心包膜等间皮组织,支气管上皮、支气管粘膜下腺,以及角膜和结膜上皮合成分泌。在卵巢癌患者中,癌组织能表达高水平的CA125,并分泌入血,因此,卵巢癌患者血清中的CA125主要来源于癌组织,且具有特殊的糖基化状态。
本领域研究者试图利用上述糖基化状态差异,区分良性或恶性疾病引起的CA125升高,从而进一步提高临床诊断的准确性,但迄今为止,尚未见有关用于CA125表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷,提供一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒,尤其是一种用于CA125表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒;本发明的试剂盒能通过包被在96孔板上的CA125抗体捕获血清中的CA125,继而利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量,可用于判断CA125升高患者是否患有恶性妇科肿瘤。
具体而言,本发明的用于CA125表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒,其特征在于,其包被一种抗CA125抗体(克隆号:[X325]),通过包被的CA125抗体捕获血清中的CA125,用糖链识别分子检测CA125表面Tn抗原含量。
本发明的试剂盒的检测原理采用双抗体夹心法ELISA;
本发明的试剂盒的检测对象为妇科病患者血清;
本发明的试剂盒适用人群为血清CA125水平升高的妇科病患者血清,尤其是血清CA125水平大于35U/ml的患者人群;
本发明试剂盒的糖链识别分子为特异性识别Tn抗原的凝集素VVA。
本发明中,所述的CA125抗体是一种糖蛋白,由于其Fc段的糖链有可能与凝集素发生结合,从而干扰抗原糖链结构的检测,因此,本发明的试剂盒的制备中引入了抗体糖链氧化衍生化处理步骤,其中:使用(4-[4-N-马来酰亚胺]盐酸丁酸肼)(4-[4-N-maleimidophenyl]butyric acid hydrazide hydrochlorid,MPBH)作为交连剂,利用其酰肼末端与高碘酸钠氧化糖环产生的醛基结合,利用马来酰亚胺末端与半胱氨酸-甘氨酸二肽上的巯基结合,从而在结构上破坏Fc段糖链,同时利用空间位阻效应防止凝集素与其结合,最终降低抗体糖链所产生的背景信号。
本发明中,所述试剂盒的CA125抗体包被于96孔板后经氧化衍生化处理以清除抗体糖链引起的背景信号;其中,所述的氧化衍生化处理中,氧化液为含20mM NaIO4的0.1M醋酸钠溶液,pH5.5;衍生化试剂为溶于PBS的1mMMPBH;封闭液为溶于0.1PBST的0.1mM Cys-Gly。
本发明进一步提供了利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量,以进行判断CA125升高是否为恶性妇科肿瘤的方法。
本发明的用于CA125表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒,对收集的血清CA125水平升高的90余例妇科病患者的血清进行体外检测,其包括步骤:
1)收集血清样本,按常规血清分离方法处理;
2)抗体糖链衍生化;
3)凝集素检测CA125表面Tn抗原;
4)计算CA125表面Tn抗原含量
X=Log10(Asample/Ablank)
其中,X为CA125表面Tn抗原相对含量,Asample为样品孔的吸光度,Ablank为空白对照孔德吸光度;
根据特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量,判断CA125升高患者是否患有恶性妇科肿瘤。
结果显示,以0.2为界值,CA125表面Tn抗原诊断恶性CA125升高的灵敏度和特异度分别为82.5%和74.5%。
本发明的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒可用于诊断恶性妇科肿瘤。
与现有技术比较,本发明的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒,具有检测省时,所需血清样本易于取得,用于区分良、恶性CA125升高患者准确度高的优点。
为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1显示了CA125表面Tn抗原诊断、CA125升高的灵敏度和特异度。
具体实施方式
本发明将通过具体的实施例进行示例性的说明,其中,如有未尽之处,可参见《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社,北京)等实验手册以及市售的试剂和仪器的使用说明。
实施例1
1)收集血清样本
收集血清CA125水平升高的妇科病例91例,包括40例恶性妇科肿瘤患者,51例妇科良性疾病患者;按常规血清分离方法,首先抽取5ml静脉血,促凝管中凝固后2000g离心10分钟,吸出上层血清,-80℃冻存,使用前4℃解冻。
2)抗体糖链衍生化
(1)包被:CA125抗体(克隆号:[X325])以包被液(pH9.6,0.05MNa2CO3-NaHCO3溶液)稀释至1μg/ml,加入酶标板,100μl/孔,4℃,过夜;
(2)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板三次;
(3)封闭:封闭液(含1%BSA的1*PBS),200μl/孔,37℃,1h;
(4)氧化:氧化液(含20mM NaIO4的0.1M醋酸钠溶液,pH5.5),200μl/孔,4℃,避光,2.5h;
(5)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板三次;
(6)MPBH:MPBH工作液(1mM溶于PBS),200μl/孔,室温,2h;
(7)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板三次;
(8)Cys-Gly:0.1mM Cys-Gly溶于0.1PBST,200μl/孔,4℃,过夜。
3、凝集素检测CA125表面Tn抗原
(1)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板三次;
(2)抗原:血清100μl/孔,37℃,90分钟,以PBS作为阴性对照;
(3)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板三次;
(4)Biotin-VVA:以Lectin稀释液(1%BSA溶于0.1PBST,含0.1mM Ca2+)稀释VVA至10μg/ml,100μl/孔,室温,1h;
(5)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板六次;
(6)Streptavidin-HRP:100μl/孔,室温,30分钟;
(7)洗板:0.1PBST,200μl/孔,洗板六次;
(8)显色:TMB显色液,100μl/孔,室温,避光,10分钟;
(9)终止:终止液,100μl/孔,振荡混匀;
(10)检测:酶标仪检测各孔A405值。
4、计算CA125表面Tn抗原含量
X=Log10(Asample/Ablank)
其中,X为CA125表面Tn抗原相对含量,Asample为样品孔的吸光度,Ablank为空白对照孔德吸光度;
以0.2为界值,CA125表面Tn抗原诊断恶性CA125升高的灵敏度和特异度分别为82.5%和74.5%(如图1所示)。
对于CA125水平处于各个区间的患者,分别计算CA125表面Tn抗原含量取截断值为0.2时,其用于鉴别良恶性疾病的准确率,结果如表1所示,在各区间内CA125表面Tn抗原的诊断准确率均在70%以上,当CA125水平大于200U/ml时,其诊断准确率达到83.3%。
表1CA125表面Tn抗原用于鉴别良恶性CA125升高的准确性
Claims (7)
1.一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒,其特征在于,其包含包被一种抗CA125抗体的96孔板和特异性识别Tn抗原的凝集素VVA,通过包被的CA125抗体捕获血清中的CA125,用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量;
所述抗CA125抗体的克隆号为[X325]。
2.按权利要求1所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒,其特征在于,其采用抗体-凝集素ELISA。
3.按权利要求1所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒,其特征在于,检测对象为妇科病患者血清。
4.按权利要求1或3所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒,其特征在于,所述的血清是CA125水平大于35U/ml的妇科病患者血清。
5.制备权利要求1的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒的方法,其特征在于,其包括抗体糖链氧化衍生化处理步骤:其中,采用4-(4-N-马来酰亚胺)盐酸丁酸肼作为交联剂,用其酰肼末端与高碘酸钠氧化糖环产生的醛基结合,用马来酰亚胺末端与半胱氨酸-甘氨酸二肽上的巯基结合,以在结构上破坏Fc段糖链,和用空间位阻效应防止凝集素与其结合,最终降低抗体糖链所产生的背景信号。
6.按权利要求5的方法,其特征在于,所述氧化衍生化处理中,氧化液为含20mMNaIO4的0.1M醋酸钠溶液,pH5.5;衍生化试剂为溶于PBS的1mM 4-(4-N-马来酰亚胺)盐酸丁酸肼;封闭液为溶于0.1PBST的0.1mM Cys-Gly。
7.一种特异性识别Tn抗原的凝集素VVA在制备检测CA125表面Tn抗原含量的制剂中的用途;其中,通过下述步骤检测CA125表面Tn抗原含量:
1)收集妇科病患者血清样本,按常规血清分离方法处理;
2)抗体糖链氧化衍生化;
3)凝集素检测血清样本中CA125表面Tn抗原;
4)计算CA125表面Tn抗原含量
X=Log10(Asample/Ablank)
其中,X为CA125表面Tn抗原相对含量,Asample为样品孔的吸光度,Ablank为空白对照孔的吸光度。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210283107.2A CN102901827B (zh) | 2012-08-09 | 2012-08-09 | 一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210283107.2A CN102901827B (zh) | 2012-08-09 | 2012-08-09 | 一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102901827A CN102901827A (zh) | 2013-01-30 |
CN102901827B true CN102901827B (zh) | 2015-03-11 |
Family
ID=47574178
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210283107.2A Active - Reinstated CN102901827B (zh) | 2012-08-09 | 2012-08-09 | 一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102901827B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109781986B (zh) * | 2019-03-11 | 2022-03-25 | 复旦大学附属妇产科医院 | 一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法 |
CN113466456A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院 | 用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体afp-l3的elisa试剂盒及检测方法 |
CN113325183B (zh) * | 2021-06-01 | 2022-11-15 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种用于鉴别诊断em/fem的试剂盒 |
CN114965990B (zh) * | 2022-03-21 | 2023-05-16 | 复旦大学附属妇产科医院 | 一种糖类抗原CA125表面Tn抗原检测用校准品缓冲液及其制备方法、检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5686431B2 (ja) * | 2011-01-28 | 2015-03-18 | 学校法人 京都産業大学 | 卵巣癌の検出方法、並びに、キット |
-
2012
- 2012-08-09 CN CN201210283107.2A patent/CN102901827B/zh active Active - Reinstated
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
ANALYSIS OF THE PROTEIN AND GLYCAN PARTS OF CA125 ANTIGEN;BOJANA MILUTINOVIC et al;《Arch. Biol. Sci》;20071231;第59卷(第2期);97-103 * |
Different Levels of Sialyl-Tn Antigen Expressed on MUC16 in Patients With Endometriosis and Ovarian Cancer;Akita, Kaoru et al;《International Journal of Gynecological Cancer》;20120531;第22卷(第4期);531–538 * |
Heterogeneity of the CA125 antigen that coexpresses Sialyl Tn and CA199 antigens;Hiroshi Kobayashi et al;《Acta Obst Gynaec Jpn》;19930930;第45卷(第9期);980-986 * |
Mucin Carbohydrate Antigens (T, Tn, and Sialyl-Tn) in Human Ovarian Carcinomas: Relationship With Histopathology and Prognosis;Ghazizadeh et al;《HUMAN PATHOLOGY》;19970831;第28卷(第8期);960-966 * |
Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays;Songming Chen et al;《Nature Methods》;20070408;第4卷;437-444 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102901827A (zh) | 2013-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102901827B (zh) | 一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒 | |
WO2007021860B1 (en) | QUANTITATIVE ASSAYS FOR PDGFR-β IN BODY FLUIDS | |
Kadirovna | Immunological Indicators of Blood and Saliva in Diseases of the Oral Cavity Mucosa in Patients with Covid-19 Complicated by Stage I and II AG | |
Zhao et al. | Inferior vena cava collapsibility index is a valuable and non-invasive index for elevated general heart end-diastolic volume index estimation in septic shock patients | |
CA2808611A1 (en) | Detecting circulating cartilage oligomeric matrix protein in liver cirrhosis | |
Peng et al. | Correlation between endothelial dysfunction and left ventricular remodeling in patients with chronic kidney disease | |
Yang et al. | Prediction of renal allograft acute rejection using a novel non-invasive model based on acoustic radiation force impulse | |
dos Santos Silva et al. | Glycosylation products in prostate diseases | |
Huang et al. | Serum and tissue expression of gelatinase and Twist in breast cancer. | |
WO2016082445A1 (zh) | 肽基精氨酸脱亚胺酶2在制备肿瘤临床诊断试剂中的应用 | |
Gizzo et al. | Could kidney glomerular filtration impairment represent the “Achilles heel” of HE4 serum marker? A possible further implication | |
CN108572251B (zh) | 肝硬化早期小分子标志物及其应用 | |
CN104655859A (zh) | 乳腺癌的诊断标志物 | |
CN104820096B (zh) | 一种判断早期胃癌风险检测用标志物的量的联合标准量及在筛查早期胃癌方面的应用 | |
CN104792900B (zh) | 一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法 | |
Ifeanyi et al. | A Review on Fibroid and Haptoglobin | |
Cameron | Seromucoid in the diagnosis of cancer | |
Phoolchund et al. | OC-034 Outcome Of Patients Considered Unsuitable For Liver Transplantation–A Missed Opportunity For Palliative Care? | |
RU2321854C2 (ru) | Способ ранней диагностики рака предстательной железы | |
Micu et al. | The added value of CA125, HE4, and CA72-4 as markers for ovarian endometriosis diagnosis | |
Yaqub et al. | FP513 CLINICAL PROFILE AND MANAGEMENT OF PATIENTS WITH DIABETIC KIDNEY DISEASE: DATA FROM A HOSPITAL BASED REGISTRY ESTABLISHED IN A LOW INCOME COUNTRY | |
Galkina et al. | FP515 Tubular damage markers are useful for the diagnosis of kidney injury in patients with normoalbuminuric diabetic nephropathy | |
Binder et al. | High serum concentrations of relaxin correlate with dissemination of breast cancer | |
Haider et al. | EVALUATION OF PROSTATIC SPECIFIC ANTIGEN IN BENIGN AND MALIGNANT BREAST DISEASE IN WOMEN | |
Sakty et al. | A comparative study of the diagnostic and prognostic value of squamous cell carcinoma antigen and alfa-foeto protien in hepatocellular carcinoma before and after therapeutic intervention |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150311 Termination date: 20210809 |
|
RR01 | Reinstatement of patent right | ||
RR01 | Reinstatement of patent right |
Former decision: Termination of patent rights for unpaid annual fees Former decision publication date: 20220812 |