CN102887834A

CN102887834A - 1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟及其应用

Info

Publication number: CN102887834A
Application number: CN2011102026962A
Authority: CN
Inventors: 叶霜; 陈晓翔
Original assignee: SHANGHAI BIO-SUITE Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIO-SUITE Co Ltd
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2013-01-23

Abstract

本发明公开了一种1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟及其应用，本发明基于对FTY720的构效分析，成功合成了包括1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟。可用于制备治疗肺损伤和/或肺纤维化的药物和/或免疫抑制剂类药物，为治疗肺损伤、肺纤维化提供了一种更加有效、更加安全的可选药物，为具有式(1)所示的化合物或其盐：

Description

1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟及其应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟及其盐在治疗肺纤维化药物中的应用。

背景技术

肺纤维化，如特发性肺纤维化、结缔组织病继发的肺间质病变/肺纤维化、放射或其他理化因素相关的肺纤维化等，是一组临床常见的难治性疾病。肺脏间质组织由胶原蛋白、弹性蛋白及蛋白醣类构成，当成纤维细胞受到免疫、理化因素伤害时，会分泌胶原蛋白进行肺间质组织的修补，进而造成肺脏纤维化；亦即肺脏受到伤害后机体修复产生的结果。

大多数间质性肺疾病都有共同的病理基础过程。初期损伤之后有肺泡炎，随着炎性-免疫反应的进展，肺泡壁、气道和血管最终都会发生不可逆的肺部瘢痕(纤维化)。炎症和异常修复导致肺间质细胞增殖，产生大量的胶原和细胞外基质。肺组织的正常结构为囊性空腔所替代，这些囊性空腔有增厚的纤维组织所包绕，此为晚期的“蜂窝肺”。肺间质纤维化和“蜂窝肺”的形成，导致肺泡气体-交换单元持久性的丧失。

肺纤维化发展过程中肺泡塌陷是失去上皮细胞的结果。暴露的基底膜可直接接触和形成纤维组织，大量肺泡塌陷即形成密集的瘢痕，形成蜂窝样改变。蜂窝样改变是瘢痕和结构重组的一种表现。

目前临床上缺少抗肺纤维化有效的药物，唯有对症治疗，但疗效不佳。所以人们从不同角度对抗肺纤维化药物进行了研发。目前国外临床使用和在研的药物除了传统的免疫抑制剂、抗氧化剂、抗炎症药物外，主要针对与纤维化发生发展相关的细胞因子的拮抗剂和胶原纤维生物合成和翻译后加工过程的抑制剂，但是至今尚无太多的实质性进展。在日本抗纤维化药物吡菲尼酮治疗肺维化的临床试验显示了一定疗效，但由于证据不足，美国FDA未批准。目前我国临床常用对症治疗、抗炎、抗氧化剂和激素治疗等方法，效果不确定。如激素用于减轻放射性肺炎/肺纤维化的临床症状，但对于患者最终脏器纤维化并无太多的裨益。相反由于激素造成机体的抵抗力下降甚至被认为会使患者的平均寿命更短。结缔组织病继发肺间质病变/肺纤维化的发生率可达50％，并且往往成为其最突出的死亡原因。传统的激素和细胞毒药物治疗效果不佳，如系统性硬化症合并的慢性肺间质纤维化、皮肌炎/多肌炎合并的急/亚急性间质性肺炎，尤其是后者临床经过可呈进行性的呼吸衰竭，中位数生存期仅9-10个月，治疗乏术。由此可见，目前临床上治疗各种原因引起的肺纤维化急需一个作用机制明确、疗效良好、无明显毒副作用的药物。

2-对辛基苯乙基-2-氨基丙二醇(简称FTY720)(2-amino-2-(2-[4-octyl-phenyl]ethyl)-1，3-propanediol hydrochloride)是一个新型免疫抑制剂，为子囊菌亚门(ascomycete)赤僵菌(Isaria sinclarii)发酵菌丝体天然提取物的化学合成的类似物，其化学结构类似于神经鞘氨醇(sphingosine)和神经酰胺(ceramide)，从结构上区别于FK506(普乐可复)，环孢霉素A，以及雷帕霉素等真菌多肽。FTY720可以明显延长动物异体皮肤、心脏、肝脏、肾脏的移植存活时间，并且毒副作用相对少见。该药显示对多发性硬化疗效显著，近期已通过美国FDA批准以该适应症上市。FTY720治疗其他自身免疫性疾病动物模型有效的报道多见，如自身免疫性糖尿病小鼠模型，实验性自身免疫性色素膜-视网膜炎，自身免疫性甲状腺炎大鼠，实验性变应性脑脊髓膜炎，佐剂性关节炎模型大鼠，以及MRL/lpr狼疮动物模型。但FTY720也有许多问题有待解决，特别是对心血管系统具有较大的毒副作用。

发明内容

本发明的目的是提供1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，是FTY720的类似物，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的另一目的是提供所述化合物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，为具有如式(1)所示的化合物或其盐：

本发明所述的化合物为1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟；

所述的盐为盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐等无机盐或有机盐；

优选盐酸盐。

本发明的设计思想：

1.2-对辛基苯乙基-2-氨基丙二醇(FTY720)的一个显著特点是其结构由1个亲水部分(氨基醇)和1个亲脂部分(碳链)所组成，而两性分子是这类化合物产生毒性和特殊理化性质的主要原因，因此，在新化合物设计中保留这两部分是必需的。

2.2-氨基-2-取代-1，3-丙二醇不同化合物的作用功效主要依赖于侧链烷烃中苯环的位置；季碳和苯环之间的最佳碳链长度是两个碳原子，苯环上取代位置以对位为宜，因此，保留苯环是必需的，且以对位为取代。

3.烷基链的长短变化仅对毒性有影响，当季碳和苯环之间的最佳碳链长度是两个碳原子，活性最明显，但是，苯环对位的取代基通常是可修饰的部分。

基于以上构效关系的分析，我们着手对苯环对位的取代基进行改造，根据生物电子等排原理，我们将FTY720中苯环4位上的直碳链换为取代碳链，之后，再在该碳链的苄位上增加羟亚胺基得到本发明新的化合物。

本发明化合物制备路线如下：

动物试验证明，本发明所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，具有预防肺纤维化的作用或具有治疗肺纤维化的作用，或者同时具有预防肺纤维化的作用和具有治疗肺纤维化的作用，可用于制备治疗肺纤维化的药物。

本发明还包括一种组合物，包括治疗有效量的所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟和医药学上可接受的载体。所述载体，如香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用载体物质，并采用本领域公知的方法，制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂或针剂，制剂通常含有重量百分比为1-70％的有效成分，较佳重量含量为5-50％；

本发明的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，可经口服或静脉注射，施加于需要治疗的患者，剂量一般为0.2～10mg/kg体重，具体可根据患者的年龄、病情等，由医师决定。

本发明的有益效果：本发明基于对FTY720的构效分析，成功合成了包括1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟。本发明化合物能够对博来霉素诱导的肺纤维化起到保护作用，明显延长模型小鼠的存活率，疗效显著优于吡菲尼酮；该化合物可显著改善肺纤维化的组织病理学、减少胶原纤维的沉积、减少促纤维化相关因子TGF-β和α-SMA的生成，体外实验证实其可明显抑制成纤维细胞的增殖和趋化。因此，本发明可用于制备治疗肺损伤和/或肺纤维化的药物和/或免疫抑制剂类药物，为治疗肺损伤/肺纤维化提供了一种更加有效、更加安全的可选药物。

附图说明

图1小鼠生存曲线图。

图2小鼠肺部纤维化HE染色结果。

A为正常组(未经博来霉素造模的健康小鼠)肺部纤维化HE染色图；

B为博来霉素造模小鼠第7日肺部纤维化HE染色图；

C为博来霉素造模小鼠第21日肺部纤维化HE染色图；

D为博来霉素造模小鼠经本发明化合物治疗第21日肺部纤维化HE染色图。

图3小鼠肺部纤维化Masson染色、及TGF-β、α-SMA免疫组化结果。

图4BS-1对成纤维细胞趋化的抑制效应。

使用LPA刺激HFL细胞后，Transwell实验显示BS-1对成纤维细胞的迁移有显著抑制效应，在1，10，100nM时均显著。

图5中，实时监测BS-1对人成纤维细胞(HFL)增殖的抑制效应.

图中绿线1是LPA刺激组(1um)，红线2是HFL1细胞对照组，蓝线3是BS-15uM干预组。第42小时，施加各组刺激因素。刺激后可见BS-1对HFL细胞增殖有明显的抑制效应。

具体实施方式

实施例1

2-苯乙醇对甲苯磺酸酯(B-1)的制备

将2-苯乙醇(24.4g，0.2mol)溶于二氯甲烷(250mL)中，加入三乙胺(60.7g，0.6mol)，然后加入对甲苯磺酰氯(38.1g，0.2mol)，室温搅拌过夜。次日，抽滤，减压除去溶剂。用乙酸乙酯(300mL)溶解所得的粗产物，加入饱和碳酸钾水溶液(200mL)，室温下搅拌1h，分出有机层，用1M盐酸水溶液(400mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得白色晶体B-1(51g，收率92％)¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ2.43(3H，s)，2.96(2H，t，J＝7.2Hz)，4.20(2H，t，J＝7.2Hz)，7.11(2H，d，J＝7.8Hz)，7.22-7.30(5H，m)，7.69(2H，d，J＝7.8Hz).

2-苯基碘乙烷(B-2)的制备：

将B-1(138g，0.5mol)溶于丙酮(300mL)中，加入碘化钠(375g，2.5mol)，加热回流9h，有大量白色固体生成。反应结束后，加入水(300mL)，乙酸乙酯(80mL)，搅拌至固体全部溶解，水层用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机层，用10％保险粉(Na₂S₂O₄)水溶液洗涤(50mL×3)，再用水洗涤(50mL×3)，有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，减压蒸馏纯化液体，得无色液体(96g，91％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ3.17(2H，t，J＝7.8Hz)，3.34(2H，t，J＝7.8Hz)，7.17-7.35(5H，m).

2-乙酰氨基-2-[2-(苯基)乙基]丙二酸二乙酯(B-3)的制备

分散在矿物油中的NaH(含量60％，2.85g，71.5mmol)悬浮于新蒸无水DMF(40mL)中，冷至0℃。乙酰氨基丙二酸二乙酯(14.35g，66mmol)溶于新蒸DMF(30mL)中，缓慢滴入上述溶液中，室温搅拌0.5h。然后将反应瓶置于冰浴中，冷至0℃后，将B-2(16.9g，72.5mmol)滴入上述溶液中，撤去冰浴，室温反应1h，加热至60℃反应3h。反应结束后，将反应体系倾入100mL冰水中，用EtOAc萃取(30mL×3)，合并有机层，用饱和食盐水洗涤(20mL×3)，无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，得白色固体(22g，97％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.25(6H，t，J＝7.2Hz)，1.99(3H，s)，2.48(2H，t，J＝8.7Hz)，2.70(2H，t，J＝8.7Hz)，4.20(2H，q，J＝7.2Hz)，4.21(2H，q，J＝7.2Hz)，6.78(1H，s)，7.14-7.29(5H，m).

N-[1，1-二(羟甲基)-3-苯基丙基]乙酰胺(B-4)的制备

B-3(16g，50mmol)，CaCl₂(11g，100mmol)溶于EtOH(180mL)和H₂O(30mL)中，分三次加入NaBH₄(7.6g，200mmol)，室温反应过夜。次日，加入2M盐酸水溶液(30mL)，分层，水层用EtOAc(30mL×3)萃取，合并有机层，用饱和食盐水溶液(20mL×3)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，得无色油状液体(8.85g，76％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.96(s，3H)，2.04(t，J＝8.1Hz，2H)，2.65(m，2H)，3.63(d，J＝11.4Hz，2H)，3.87(d，J＝11.4Hz，2H)，6.02(s，1H)，7.18-7.31(m，5H).

N-[1，1-二[(乙酰氧基)甲基]-3-苯基丙基]乙酰胺(B-5)的制备

取B-4(8.8g，37mmol)溶于THF(100mL)中，室温搅拌，加入Ac₂O(14mL，148mmol)，然后加入Et₃N(20.6mL，148mmol)，最后加入DMAP(0.275g，1.8mmol)。室温反应2h。反应结束后，将反应体系倒入H₂O(20mL)中，加入少量乙酸乙酯(5mL)，静置分层。用EtOAc(10mL×3)萃取，合并有机层用饱和NaCl水溶液(10mL×3)洗涤，有机层用无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂。得白色固体(9.83g，83％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.97(s，3H)，2.10(s，6H)，2.22(t，J＝8.7Hz，2H)，2.61(t，J＝8.7Hz，2H)，4.35(s，4H)，5.69(s，1H)，7.17-7.32(m，5H).

N-[1，1-二[(乙酰氧基)甲基]-3-(4-乙酰基苯基)丙基]乙酰胺(B-6)的制备

在干燥的100mL二口瓶中加入无水三氯化铝(6g，45mmol)，研细，抽换氩气3次，往体系中加入干燥过的二氯甲烷(30mL)，置于冰浴下搅拌数分钟后用注射器往体系中滴加丙酰氯(1.6mL，18mmol)。然后，在氮气的保护下，体系中加入2-乙酰氨基2-[2-(苯基)乙基]-1，3-丙二醇二乙酸酯(B-5)(2.9g，9mmol)，移去冰浴，升温至45℃反应8h。反应完后将体系倾入浓盐酸(15mL)和冰水(30mL)中，分层，有机相再用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相，用饱和碳酸氢钠洗涤，最后用饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，旋蒸除溶剂得粗产物B-6(2.5g，76％)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.22(t，J＝7.2Hz，3H，)，1.99(s，3H)，2.10(s，6H)，2.24(t，J＝8.7Hz，2H)，2.66(t，J＝8.7Hz，2H)，2.98(q，J＝7.2Hz，2H)，4.34(s，4H)，5.71(s，1H)，7.27(d，J＝8.4Hz，2H)，7.89(d，J＝8.4Hz，2H).

N-[1，1-二[(乙酰氧基)甲基]-3-4-[1-(羟亚胺基)丙基]苯基]丙基]乙酰胺(BS-3)的制备

在50mL单口瓶中加入B-6(2g，5.3mmol)、盐酸羟胺(1.1g，15mmol)和醋酸钠(1.3g，15mmol)后加乙醇(8mL)和水(8mL)，升温至回流反应8h，然后冷却至室温。乙酸乙酯(20mL×3)萃取。无水硫酸钠干燥。旋蒸除溶剂得粗产物(BS-3)(2g，5.1mmol，96％)。

A-3

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.16(t，J＝7.2Hz，3H)，1.99(s，3H)，2.11(s，6H)，2.22(t，J＝8.7Hz，2H)，2.62(t，J＝8.7Hz，2H)，2.80(q，J＝7.2Hz，2H)，4.35(s，4H)，5.73(s，1H)，7.20(d，J＝8.1Hz，2H)，7.53(d，J＝8.1Hz，2H).

1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟(BS-1)的制备

将BS-3(2g，5mmol)置于50mL单口瓶中，加入甲醇(8mL)，水(8mL)和氢氧化锂一水化合物(1.05g，25mmol)升温至回流，然后反应8h。乙酸乙酯(30mL×6)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析(开始只用乙酸乙酯冲，然后用EtOH/MeOH＝9∶1淋洗)。得目标产物A-1(1.1g，3.9mmol，80％)。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ1.02(t，J＝7.2Hz，3H)，1.50(m，3H)，2.38-2.63(m，2H)，2.68(q，J＝7.2Hz，2H)，3.20-3.29(m，4H)，7.20(d，J＝8.4Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4Hz，2H)，11.09(s，1H).

1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟的盐酸盐(BS-2)的制备

将BS-1(0.56g，2mmol)溶于甲醇(2mL)中，向体系慢慢滴加1M的盐酸水溶液(2mL)，室温搅拌2h。除溶剂，得最终目标产物的盐酸盐A-2(0.64g，2mmol，100％)。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ1.02(t，J＝7.2Hz，3H)，1.82(m，3H)，2.5-2.7(m，4H)，3.53(s，4H)，4.0-5.5(br，2H)，7.24(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57(d，J＝8.4Hz，2H)，7.99(s，3H)，10.29(s，0.3H)，11.07(s，0.7H).

实施例2

本发明化合物对肺纤维化模型的治疗效应

2.1博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型的建立

8-12周龄C57Bl/6小鼠，SPF级层流架无菌饮食喂养，经气管软骨环间隙向心端注射0.05-0.075units(2-3units/kg体重)博来霉素(以下简称BLM，购自Gensia SicorPharmaceuticals)，注射时体位直立，注射后旋转体位以保证博来霉素在肺内均匀分布。

2.2生存曲线测定

将BLM造模成功的小鼠分为三组，本发明的化合物1组和吡菲尼酮(购自常州航宇医药)组分别从第二天开始给予本发明化合物1mg/kg和吡菲尼酮500mg/kg，每天尾静脉注射一次。未处理组不给药。

给药后小鼠生存曲线见图1，由图1可看出本发明化合物1能显著延长BLM造模的肺纤维化小鼠的生存时间，在28d时的生存率可达90％，而吡菲尼酮则只有50％左右，未处理组完全死亡。这说明本发明化合物1较之吡菲尼酮能显著延长BLM诱导的肺纤维化模型小鼠的生存时间。

2.3对肺部纤维化的病理改变

将BLM造模成功的小鼠分为三组，本发明化合物1组和吡菲尼酮组分别从第二天开始给予本发明化合物化合物1mg/kg和吡菲尼酮500mg/kg，每天尾静脉注射一次。未处理组不给药。另设立未经博来霉素造模的健康小鼠作为正常组。

各组小鼠右下肺组织常规固定后，经固定后，常规石蜡包埋，制成病理切片。

2.3.1.HE染色

切片在二甲苯中脱蜡8分钟后移入二甲苯和纯酒精(1∶1，质量比)混合液中5分钟左右。加入100％、95％、85％或70％酒精(体积比)，各级为3分钟。最后经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色10分钟。水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。流水冲洗15～30分钟，即细胞核呈蓝色，蒸馏水短洗。0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。二甲苯透明(二次)，共约10分钟。封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。光镜下观察，结果见图2。

2.3.2Masson染色

切片脱蜡至水，后用1％高锰酸钾氧化切片5min，水洗、草酸漂白1min。再用蒸馏水洗，天青石蓝染5min水洗，摔去余液，滴染Mayer氏苏木素3-5min，流水冲洗5-10min。丽春红苦味酸饱和液染5min，1％醋酸水溶液洗，1％磷钼酸分化切片约5min，蒸馏水洗，1％淡绿或者甲苯胺蓝滴染30s，1％醋酸水溶液洗切片，95％酒精分化，无水酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封固。光镜下观察，结果见图3。

2.3.3TGF-β、α-SMA免疫组化染色

切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3min。如果有必要，每张切片加1滴过氧化氢液室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3min。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的抗α-SMA抗体(1∶30稀释，DAKO公司)、或抗TGF-β抗体(1∶50稀释，DAKO公司)，室温下孵育90分钟。PBS冲洗3x5min。除去PBS液，每张切片1∶10000的兔抗大鼠-辣根过氧化物酶(DAKO公司)50μl，室温下孵育40分钟。PBS冲洗3x3min。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-5分钟。自来水冲洗，苏木素复染，用0.1％HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝，中性树胶封固，封片。光镜下观察，结果见图3。

2.3.3抑制趋化试验

1)将小室下表面用枪头均匀涂抹上纤维连结蛋白5ug/平方厘米，37℃放置2小时，

2)取对数生长期的细胞，0.25％EDTA-胰酶消化后，用无血清培养基制成细胞悬液，倒置显微镜下计数，

3)上室内加入100ul细胞悬液(含3×104个细胞)和0.1％胎牛血清；下室加入600ulF-12K培养基，其中含20％胎牛血清。其他各组加入相应浓度18∶1LPA5ul(1uM)和(或)1，10，100nM BS-1 5ul；

4)放入CO2培养箱内孵育4小时后，弃去滤膜上、下室的培养液，

5)用棉球擦去上表面未迁移的细胞，在上、下室移入同样体积(上室100μl，下室600μl)的预热的PBS，轻轻吹打PBS，可重复1次，

6)在下室移入4％多聚甲醛600μl，使滤膜下表面浸在其中固定细胞，15min，

7)弃去固定液，倒置transwell小室，使滤膜下表面朝上，自然风干，

8)风干后直接在倒置的transwell小室的滤膜下表面滴上数滴DAPI核染料(0.1ug/ml)，暗盒内避光室温静置30min，

9)PBS清洗一遍，在倒置荧光显微镜下观察计数。

2.3.4Xcelligence实时监测抑制肺成纤维细胞增殖

1)每孔加入90ulF-12K培养基，放入仪器卡座，检测孔板与仪器接触是否良好，

2)根据确定的细胞密度，每孔加入100ul细胞悬液，

3)放入培养箱内静置半小时后，再放回仪器卡座，

4)待24小时细胞全部贴壁后，更换无血清培养基让细胞饥饿过夜，使得细胞同步化，

5)次日清晨加入20％胎牛血清刺激细胞6小时，各组相应加入LPS 2.5ug/ml 5ul和(或)5um BS-1各5ul；

6)仪器每15分钟自动扫描一次，96小时后读取结果。

病理结果显示本发明化合物能有效地改善H.E染色的肺部纤维化病理、减少Masson纤维染色、减少TGF-β和α-SMA的生成，体外试验显示能有效抑制LPA诱导的趋化和肺成纤维细胞的增殖，提示本发明化合物对肺纤维化具有潜在的治疗效果。结果见图2-5。

实施例3

片剂：

制备方法：按上述配方，将粉碎过筛后的实施例1的化合物、蔗糖、玉米淀粉均匀混合，然后与5％乙醇溶液混合，制粒、干燥，之后再与润滑剂硬脂酸钙混合，压片即可。其中，所述的实施例1的化合物粉碎过筛为过60目筛；所述的蔗糖、玉米淀粉和交联聚乙烯吡咯烷酮粉碎过筛为过80目筛；所述的制粒的颗粒粒径大小为20目；所述的干燥的温度较佳的为50℃控制水分质量百分比3％以内。将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸钙，混合均匀，压片。每片重250mg，活性成分含量为20mg。

实施例4

针剂：实施例1的化合物 20mg

注射用水 9.98g

制备方法：将活性成分溶解与注射用水，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装与安瓿瓶中，每瓶1000mg，活性成分含量为20mg/瓶。

Claims

1.1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，其特征在于，为具有式(1)所示的化合物或其盐：

2.根据权利要求1所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，其特征在于，所述的盐为无机盐或有机盐。

3.根据权利要求2所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟，其特征在于，所述的盐为盐酸盐。为盐酸盐、硫酸盐或乙酸盐。

4.一种组合物，其特征在于，包括治疗有效量的权利要求1～3任一项所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟和医药学上可接收的载体。

5.根据权利要求1～3任一项所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟在制备预防肺纤维化药物中的应用。

6.根据权利要求1～3任一项所述的1-[4-[3-氨基-4-羟基-3-(羟甲基)丁基]苯基]-1-丙酮肟在制备治疗肺纤维化药物中的应用。