CN102875731A

CN102875731A - 一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN102875731A
Application number: CN2012104213953A
Authority: CN
Inventors: 薛屏; 李新燕; 夏维涛; 王居兰; 宋肖单; 李鹏
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明涉及一种聚合物载体的制备方法，尤其是涉及一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，该方法为将Fe²⁺、Fe³⁺盐作为磁源前驱物，通氮下溶解于极性有机溶剂甲酰胺中，用浓氨水调节溶液pH值为8-11后，60-90℃熟化30-60min，在碱性条件下形成磁流体，表面活性剂作为分散剂，乙烯基化合物为单体，非极性有机物作分散介质，引发剂作用下采用反相悬浮技术进行交联聚合，产物在磁场中用丙酮洗涤分离后用有机溶剂清洗，室温下真空干燥即得该载体；本发明方法独特、合成成本低、过程简捷、省去了Fe₃O₄的制备和表面修饰程序、有利于工业化应用、可以获得磁性、珠状、大孔青霉素酰化酶固定化载体，其用途用于青霉素酰化酶固定化制备高活性易分离的固定化酶。

Description

一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种聚合物载体的制备方法，尤其是涉及一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法及其用途。

背景技术

青霉素酰化酶即PGA是生产半合成β-内酰胺类抗生素的工业用酶，其重要的应用在于催化青霉素G生产半合成β-内酰胺类抗生素所需的关键中间体6-氨基青霉烷酸即6-APA。目前，世界范围内近90%的6-APA是利用固定于天然高分子或合成树脂载体的青霉素酰化酶生物催化剂生产的。尽管固定化PGA在医药工业中的应用已有近三十年，但新型适合于工业化应用的固定化PGA载体的制备研究仍具有一定的挑战性。磁性载体制备固定化酶，固定化酶分离、洗涤和回收操作简便，有利于实现工业化大规模生产，而利用外部磁场控制磁性固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，能够有效地提高固定化酶的催化效率。

目前制备聚合物磁性微球的方法主要有高分子包埋法，单体聚合法和原位法，其中单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下, 采用不同的聚合方式，在引发剂作用下聚合制备高分子磁性微球。与包埋法相比，单体聚合法合成磁性聚合物微球的尺度易控制，且球形规整。利用原位法制备高分子磁性微球，微球的磁响应性较弱，且工艺过程复杂，实用性较低。

美国专利公告号为US 4339337公开了一种悬浮聚合制备磁性聚合物微球的方法，是将经亲油化处理的磁性Fe₃O₄微粒和亲油性烯类单体及油性引发剂组成的油相分散在含表面活性剂的水相中，形成水包油型悬浮液，加热引发聚合形成磁性微球。实验结果表明，仅管Fe₃O₄微粒表面经过烃油亲油性处理，但在聚合过程中仍出现团聚，部分Fe₃O₄微粒与烯类单体相发生分离，得到的微球磁性弱，均质性差。

中国专利公告号为CN 1566169A公开了微悬浮聚合法是用油酸类表面活性剂包覆Fe₃O₄微粒后分散于苯乙烯中形成磁流体，磁流体与二乙烯苯和油性引发剂过氧化苯甲酰混合，滴加到含十二烷基硫酸钠和十六醇乳化剂的水溶液中，先引发聚合反应一段时间后，再滴加甲基丙烯酸等功能性单体与水溶性引发剂过硫酸钾水溶液，再进行二次聚合，形成复合微球。分析上述制备过程和实验可知，该发明存在一些不足：（1）采取二次引发聚合，制备程序多，过程长。（2）所制备的磁性微球缺少特异的功能性基团，不利于在生物医学、特别是在固定化酶及细胞分离等领域的应用。

目前还没有一种合成成本低、过程简捷、省去了Fe₃O₄的制备和表面修饰程序、有利于工业化应用的大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种方法独特、合成成本低、过程简捷、省去了Fe₃O₄的制备和表面修饰程序、有利于工业化应用、可以获得磁性、珠状、大孔青霉素酰化酶固定化载体的大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法。

本发明的另一目的是该大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体用于青霉素酰化酶固定化制备高活性易分离的固定化酶。

本发明通过如下方式实现：

一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：该方法为将Fe²⁺、Fe³⁺盐作为磁源前驱物，通氮下溶解于极性有机溶剂甲酰胺中，用浓氨水调节溶液pH值为8-11后，60-90℃熟化30-60 min，在碱性条件下形成磁流体，表面活性剂作为分散剂，乙烯基化合物为单体，非极性有机物作分散介质，引发剂作用下采用反相悬浮技术进行交联聚合，产物在磁场中用丙酮洗涤分离后用有机溶剂清洗，室温下真空干燥即得该载体；

所述Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔比为1 : 0.5-2，所述Fe²⁺、Fe³⁺铁盐为FeCl₂、FeCl₃ 、FeSO₄和Fe₂(SO4)₃中二种或两种以上，甲酰胺磁流体溶液中Fe²⁺、Fe³⁺离子总的质量浓度为2-10%；

所述分散介质为疏水性有机物，其为四氯乙烯与环正庚烷、己烷、正己烷中的任意一种的混合物，二者体积比为1:1 – 1:5；

所述分散剂是复合表面活性剂，由司班类表面活性剂与聚乙二醇、乙基纤维素、硬脂酸钙和十二烷基硫酸钠中的任意一种或两种复配而成，分散剂中司班类表面活性剂与任意一种或任意两种的重量配比为1:10–1:80, 分散剂的质量是分散介质质量的5-40%；

所述乙烯基化合物单体为丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、丙烯醇、丙烯醛、丙烯酸及其衍生物、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺或二乙烯基苯的任意两种或三种的混合物，任意两种的重量配比1:1–1:4, 三种的重量配比为1:1:1–2:1:5；

所述引发剂为偶氮类引发剂或过氧化物类引发剂，引发剂加入的质量为乙烯基化合物单体质量的2–20%；

所述分散介质的质量为乙烯基化合物单体的10–60倍；

所述聚合反应在搅拌机转速为400–700 r/min，反应温度50–70℃，时间4–10 h；

所述大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体用于青霉素酰化酶固定化制备高活性易分离的固定化酶。

本发明有如下效果：

1）方法独特、合成成本低、过程简捷：本发明提供的方法为将Fe²⁺、Fe³⁺盐作为磁源前驱物，通氮下溶解于极性有机溶剂甲酰胺中，用浓氨水调节溶液pH值为8-11后，60-90℃熟化30-60 min，在碱性条件下形成磁流体，表面活性剂作为分散剂，乙烯基化合物为单体，非极性有机物作分散介质，引发剂作用下采用反相悬浮技术进行交联聚合，产物在磁场中用丙酮洗涤分离后用有机溶剂清洗，室温下真空干燥即得该载体。

2）获得磁性、珠状、大孔青霉素酰化酶固定化载体：本发明提供的方法Fe₃O₄粒子被包裹于聚合物的网络中，珠状载体平均孔径在20-50 nm, 孔体积在0.2-1.0 cm³/g范围，比饱和磁化强度在5-20 emu/g范围，研究发现，分散剂的用量、分散介质的配比、Fe²⁺、Fe³⁺离子浓度、引发剂用量、聚合反应温度对产物的孔径、粒径、球形和磁性能均有不同程度的影响。在一定范围内，增加Fe²⁺、Fe³⁺甲酰胺磁流体和引发剂用量，提高聚合温度，降低分散介质中正庚烷与四氯乙烯的配比，以获得磁性、珠状、大孔青霉素酰化酶固定化载体。

3）制备的载体性能好：采用本发明提供的方法制备的载体的微球具有大孔结构，平均孔径在20-50 nm,，孔体积在0.2-1.0 cm3/g范围，其含有环氧基和酰胺基等功能性基团，Fe₃O₄粒子主要被包裹于聚合物的网络结构中。其中，环氧基团含量在0.1-1.0 mmol/g范围；球形规整，微球之间没有出现粘连，微球磁响应性强，具有超顺磁性，比饱和磁化强度（s）在5-20 emu/g范围。

4）省去了Fe₃O₄的制备和表面修饰程序、有利于工业化应用：在相同的固定化条件下制备固定化PGA，结果表明，不同聚合条件制备的磁性载体对固定化酶的活性有显著的影响，本发明公开的是Fe²⁺、Fe³⁺甲酰胺磁流体存在下，反相悬浮聚合技术一步制备珠状、大孔径、含环氧基团的磁性聚合物载体的方法，这对于获得活性高、易分离控制和适宜于工业化应用。

5）用其制得的固定化酶催化活性高，在磁场作用下快速分离回收和重复使用，避免了生物催化剂在使用过程中的操作损失。如用本方法合成的载体固定化PGA后，催化青霉素G钾水解反应制备6-APA的表观活性可达785 IU/g 以上，以干重计。本发明磁性聚合物的特征之四在于，用其制备的固定化PGA的催化活性高，在操作过程中易分离回收和重复使用，且不发生磁聚集现象。

具体实施方式

实施例1：

将0.66 g FeCl₂·4H₂O和1.82 g FeCl₃·6H₂O置于15 mL甲酰胺中，60℃恒温加热下剧烈搅拌10 min时升温至90℃，加入氨水调节pH为8~9，熟化1 h后形成磁流体。在装有恒速搅拌机、氮气管和冷凝管的反应器中加入40 mL四氯乙烯和110 mL的正庚烷，水浴加热至60℃后，在搅拌、通入氮气下依次加入0.20 g 司班-60和9.0 g硬脂酸钙，再加入2.8g甲基丙烯酸缩水甘油酯、3.8 g N, N′-亚甲基双丙烯酰胺和上述制备的磁流体，搅拌30 min后加入1.0 g偶氮二异丁腈，控制搅拌机转速为450 r/min，在氮气保护下聚合7 h。产物在磁场中经分离、丙酮和正庚烷洗涤后，真空干燥至恒重，测得其平均孔径为32.1 nm，孔体积为0.53 cm3/g，s值为7.8 emu/g，环氧基团含量 0.45 mmol/g。以合成的磁性珠状载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为635 IU/g。

实施例2：

1.32 g FeCl₂·4H₂O和1.82 g FeCl₃·6H₂O，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为30.0 nm，孔体积为0.60 cm3/g，s值为8.3 emu/g，环氧基团含量 0.38 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为612 IU/g。

实施例3：

甲酰胺为30 mL，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为39.4 nm，孔体积为0.51 cm3/g，s值为6.3 emu/g，环氧基团含量 0.43 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为662 IU/g。

实施例4：

司班-60的用量为0.40 g，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为31.2 nm，孔体积为0.58 cm3/g，s值为6.9 emu/g，环氧基团含量 0.47 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为674 IU/g。

实施例5：

硬脂酸钙的用量为13.5 g，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为30.4 nm，孔体积为0.66 cm3/g， s值为5.7 emu/g，环氧基团含量 0.56 mmol/g。以合成的磁性珠状载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为604 IU/g。

实施例6：

正庚烷的用量为150 mL，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为30.7 nm，孔体积为0.50 cm3/g，s值为5.0 emu/g，环氧基团含量 0.41 mmol/g。以合成的磁性珠状载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为654 IU/g。

实施例7：

控制搅拌转速为600 r/min，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为34.6 nm，孔体积为0.52 cm3/g，s值为5.3 emu/g，环氧基团含量 0.44 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为630 IU/g。

实施例8：

聚合温度为70℃，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。合成样品的平均孔径为30.7 nm，孔体积为0.58 cm3/g，s值为5.6 emu/g，环氧基团含量 0.42 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为622 IU/g。

实施例9：

甲基丙烯酸缩水甘油酯用量为2.0 g、N-乙烯吡咯烷酮为1.0 g，N, N′-亚甲基双丙烯酰胺为3.6 g，其余组分的用量和制备条件与实施例4相同。合成样品的平均孔径为30.8 nm，孔体积为0.69 cm3/g，s值为5.8 emu/g，环氧基团含量 0.32 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为785 IU/g。

实施例10：

甲基丙烯酸缩水甘油酯用量为2.0 g、甲基丙烯酸羟乙酯为1.0 g，N, N′-亚甲基双丙烯酰胺为3.6 g，其余组分的用量和制备条件与实施例4相同。合成样品的平均孔径为30.7 nm，孔体积为0.64 cm3/g，s值为5.6 emu/g，环氧基团含量 0.34 mmol/g。以合成的磁性珠状含环氧基载体固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G钾制备6-APA水解反应，固定化酶的表观活性为745 IU/g。

Claims

1.一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：该方法为将Fe²⁺、Fe³⁺盐作为磁源前驱物，通氮下溶解于极性有机溶剂甲酰胺中，用浓氨水调节溶液pH值为8-11后，60-90℃熟化30-60 min，在碱性条件下形成磁流体，表面活性剂作为分散剂，乙烯基化合物为单体，非极性有机物作分散介质，引发剂作用下采用反相悬浮技术进行交联聚合，产物在磁场中用丙酮洗涤分离后用有机溶剂清洗，室温下真空干燥即得该载体。

2.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述Fe²⁺和Fe³⁺的摩尔比为1 : 0.5-2，所述Fe²⁺、Fe³⁺铁盐为FeCl₂、FeCl₃ 、FeSO₄和Fe₂(SO4)₃中二种或两种以上，甲酰胺磁流体溶液中Fe²⁺、Fe³⁺离子总的质量浓度为2-10%。

3.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述分散介质为疏水性有机物，其为四氯乙烯与环正庚烷、己烷、正己烷中的任意一种的混合物，二者体积比为1:1 – 1:5。

4.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述分散剂是复合表面活性剂，由司班类表面活性剂与聚乙二醇、乙基纤维素、硬脂酸钙和十二烷基硫酸钠中的任意一种或两种复配而成，分散剂中司班类表面活性剂与任意一种或任意两种的重量配比为1:10–1:80, 分散剂的质量是分散介质质量的5-40%。

5.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述乙烯基化合物单体为丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、丙烯醇、丙烯醛、丙烯酸及其衍生物、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺或二乙烯基苯的任意两种或三种的混合物，任意两种的重量配比1:1–1:4, 三种的重量配比为1:1:1–2:1:5。

6.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述引发剂为偶氮类引发剂或过氧化物类引发剂，引发剂加入的质量为乙烯基化合物单体质量的2–20%。

7.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述分散介质的质量为乙烯基化合物单体的10–60倍。

8.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的制备方法，其特征在于：所述聚合反应在搅拌机转速为400–700 r/min，反应温度50–70℃，时间4–10 h。

9.如权利要求1所述的一种大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体的用途，其特征在于：所述大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠状聚合物载体用于青霉素酰化酶固定化制备高活性易分离的固定化酶。