CN102827824A - 高强度长寿命包埋微生物的光化学制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及常温有氧条件下，一种简便的高强度长寿命包埋微生物的光化学制备方法及相应的配方。根据此方法及配方制备的包埋微生物活性高，强度大，在流化反应器中的运行寿命可超过1.5年以上。由于光化学合成方法具有常温下进行，有氧下操作的特点，并且包埋材料具有生物相容性的特点，因此可广泛应用于多种微生物、酶、蛋白质及非微生物种类物质的包埋，并可大规模工业化制备。

Description

高强度长寿命包埋微生物的光化学制备方法

技术领域

本发明涉及常温有氧条件下，一种简便的高强度长寿命包埋微生物的光化学制备方法。

背景技术

固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域，以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。包埋固定化技术具有包埋微生物密度高，耐外界环境冲击能力强，固液分离简单，操作简单等优点，因此在化工，废水处理等领域具有非常广泛的应用前景。 但是目前的包埋菌普遍存在活性低、寿命短的缺点，因此，难以工业化应用。因此，如何在保证包埋载体内微生物活性的基础上，提高载体的寿命，使之在反应器中长期稳定运行是目前的难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有包埋微生物活性不高，载体强度较低的缺点。通过调整有机、无机材料之间的配比，在光化学引发下，可在常温有氧条件下对微生物进行包埋固定。由于将微生物在接近生理条件下包埋于载体中，保持了微生物的活性；另外，调整有机物、无机物之间的比例，制备处理高强度长寿命的包埋菌。此载体在流化反应器中的运行时间可超过1.5年以上。此方法简单、方便、易于操作。

本发明的方法如下：

制备方法一：

1.常温下，将适量的丙烯酰胺溶解于60ml的水中，加入一定量的亚甲基双丙烯酰胺，搅拌至溶解，得A溶液；     2.在A溶液中加入稀酸调整溶液pH至1-5.5，搅拌均匀，加入2ml乙烯基硅氧烷，及8 ml四甲氧基硅烷（或硅酸四乙酯），搅拌至水解，得溶液B；

3.加入PBS缓冲液到B溶液中至其为中性；然后加入待包埋的微生物，搅拌均匀，得混合液C；

4.在混合液C中加入安息香二甲醚溶液0.4ml，四甲基乙二胺1.6ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

5.将4中的反应液置于辐照光源下辐照2-6分钟，进行固化；

6.根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

制备方法二：

1.常温下，将适量的丙烯酰胺溶解于一定体积（a ml）的去离子水中，加入一定量的亚甲基双丙烯酰胺，搅拌至溶解，得A溶液；     2.在体积为b（a+b=60） ml的去离子水中，加入稀酸调整溶液pH至1-5.5，搅拌均匀，加入2ml乙烯基硅氧烷，及8 ml四甲氧基硅烷（或硅酸四乙酯），搅拌至水解，得溶液B；

3.溶液A与B共混均匀，加入PBS缓冲液到混合溶液中至其为中性；然后加入待包埋的微生物，搅拌均匀，得混合液C；

4.在混合液C中加入安息香二甲醚溶液0.4ml，四甲基乙二胺1.6ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

5.将4中的反应液置于辐照光源下辐照2-6分钟，进行固化；

6.根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

制备方法三：

1.常温下，将适量的丙烯酰胺溶解于60ml的水中，加入一定量的亚甲基双丙烯酰胺，搅拌至溶解，得A溶液；     2.在A溶液中加入稀酸调整溶液pH至1-5.5，搅拌均匀，加入2ml乙烯基硅氧烷，及8 ml四甲氧基硅烷（或硅酸四乙酯），搅拌至水解，得溶液B；

3.在溶液B中加入一定量的去离子水，将溶液B进行减压蒸馏，去除甲醇或乙醇类挥发物质，并使2中得到的体积不变，得溶液C；

4.加入PBS缓冲液到C溶液中至其为中性；然后加入待包埋的微生物，搅拌均匀，得混合液D；

5.在混合液D中加入安息香二甲醚溶液0.4ml，四甲基乙二胺1.6ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

6.将5中的反应液置于辐照光源下辐照2-6分钟，进行固化；

7.根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

制备方法四：

1.常温下，将适量的丙烯酰胺溶解于一定体积（a ml）的去离子水中，加入一定量的亚甲基双丙烯酰胺，搅拌至溶解，得A溶液；     2.在体积为b（a+b=60）ml的去离子水中，加入稀酸调整溶液pH至1-5.5，搅拌均匀，加入2ml乙烯基硅氧烷，，及8 ml四甲氧基硅烷（或硅酸四乙酯），搅拌至水解，得溶液B，将溶液A和溶液B共混得到混合溶液；

3.在混合溶液中加入一定量的去离子水，将其进行减压蒸馏，去除甲醇或乙醇，剩余溶液体积与2中得到的溶液的体积相同，得混合液C；

4.加入PBS缓冲液到C溶液中至其为中性；然后加入待包埋的微生物，搅拌均匀，得混合液D；

5.在混合液D中加入安息香二甲醚溶液0.4 ml，四甲基乙二胺1.6ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

6.将5中的反应液置于辐照光源下辐照2-6分钟，进行固化；

7.根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

该种包埋菌制备方法可在常温有氧条件下，通过光源辐照，达到对透明及不透明体系，以及相应的包埋体系进行光化学高效引发，使之固化，并得到高活性及长寿命的包埋菌。特别适用于包埋固定化微生物或其它非生物的固定包埋体系。

该包埋对透明、不透明的包埋体系进行光化学引发进行固化包埋，一般包括以下步骤：

步骤一，将4.8 g-9 g的丙烯酰胺或含双键的预聚物或其它含双键的单体溶解于60 ml的去离子水中，并加入适当的交联剂，搅拌溶解，得溶液A；或者

将4.8 g-9 g的丙烯酰胺或含双键的单体或预聚物溶解在体积为a ml的去离子水中，加入交联剂，得溶液A’；

步骤二，用稀酸将步骤一中得到的溶液A调整至pH为1-5.5，在调整pH后的溶液中加入乙烯基硅氧烷1-4ml，及四甲氧基硅烷或硅酸四乙酯19-16ml，搅拌至水解，得溶液B；或者

用稀酸将b ml的去离子水调整至pH为1-5.5，其中a+b=60，在调整pH后的溶液中加入乙烯基硅氧烷1-4ml，及硅酸四乙酯或四甲氧基硅烷19-16ml，搅拌至水解，得溶液B’，将溶液A’与B’共混均匀得到混合溶液；

步骤三，采用PBS缓冲液加入到上一步骤得到的溶液中，调整其pH为中性；然后加入1-6g的待包埋的微生物，搅拌均匀，得混合液D；

步骤四，在步骤三中得到的混合液中加入安息香二甲醚，四甲基乙二胺以及过硫酸钾，使其在包埋体系中的浓度分别为0.1-1.2%(m/v, g/ml)，0.7-5％（m/v, g/ml）以及0.1-0.6%（m/v, g/ml），快速搅拌均匀；

步骤五，将步骤四中得到的反应液置于辐照光源下辐照2-6分钟，进行固化；

步骤六，根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

其中，在一优选实施方式中，在上述步骤二与三之间，还进一步进行以下步骤：在保持体积不变的情况下，将步骤二得到的溶液减压蒸馏至无醇类挥发物质，得溶液C。

在一优选实施方式中，在步骤一中，所述的单体在溶液中的浓度为：每100ml溶液中含的预聚物或单体的含量为9～14 g；交联剂在溶液中的质量体积百分数为0.2～1%(m/v)。

在一优选实施方式中，在步骤二中，乙烯基硅氧烷在溶液中的浓度为：每100ml溶液中含的预聚物的含量为3-15ml；四甲氧基硅烷或硅酸四乙酯在反应液中的浓度为：每100ml溶液中含的预聚物的含量为10-25ml；

在一优选实施方式中，在步骤三中，反应液中所加入的微生物或其它包埋对象在溶液中的质量体积百分数为3.2～20%（m/v）。

在一优选实施方式中，在步骤四中，所述的过硫酸钾、安息香二甲醚及四甲基乙二胺在溶液中的含量分别是0.2-0.5% (m/v, g/ml), 0.3-1.0%(m/v, g/ml), 2-4％（v/v, ml/ml）。

在一优选实施方式中，在步骤四中，所述照射为3-6分钟。

在一优选实施方式中，所述含双键的单体或预聚物是丙烯酰胺、丙烯酸、聚乙二醇预聚物等。

在一优选实施方式中，乙烯基硅氧烷是指含有乙烯基的硅氧烷，例如，但不限于，乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷等。

在一优选实施方式中，所述交联剂是N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。

本发明的另一目的在于提供由上述方法制备的包埋载体。

在本发明中，所述术语“包埋对象”是指可包埋固定的微生物、细菌、酶等。包括但不限于活性污泥、微生物（例如硝化菌）、酶等。这些待包埋的物质来自废水处理或其它化学生化行业领域生产处理过程。

在本发明中，所述术语“交联剂”是指含有不饱和双键的化学交联剂，包括但不限于N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。

在本发明中，所述术语“含双键的单体或预聚物”是指丙烯酰胺、丙烯酸、聚乙二醇预聚物，包括但不限于聚乙二醇预聚物、丙烯酰胺、丙烯酸等。

在本发明中，所述术语“辐射光源”包括但不限于紫外光源（例如500W高压汞灯或其它类似辐照源）等。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明的包埋菌制备方法及配方，不仅可用于透明体系的微生物或非微生物包埋，还可适用于非透明体系的微生物或非微生物体系的包埋。并且所得的包埋菌载体强度高，寿命长，在流化反应器中的使用寿命超过1.5年以上。而且，本发明中的光化学引发剂高效，光化学固化简单快速，时间一般在4分钟内，并且聚合体系简单，成本较低，适合于大规模的包埋菌制备。

具体实施方案

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

步骤一，丙烯酰胺7g溶解在60ml水中，加入N, N′-亚甲基双丙烯酰胺0.36 g，搅拌至溶解；

步骤二，在步骤一所得溶液中加入稀酸调整pH为1-5.5，然后加入乙烯基三乙氧基硅烷2ml，及硅酸四乙酯（纯度98％；阿拉丁试剂公司提供）8ml，搅拌至水解；

步骤三，将PBS缓冲液加入到步骤二得到的溶液中，调整其pH为中性；然后4g 活性污泥，搅拌均匀；

步骤四，在步骤三中得到的混合液中加入安息香二甲醚溶液0.4 ml，四甲基乙二胺1.6ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

步骤五，将步骤四中得到的反应液置于辐照光源下辐照4分钟，进行固化；

步骤六，根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

实施例2

步骤一，丙烯酰胺6g溶解在20ml水中，加入N, N′-亚甲基双丙烯酰胺0.24 g，搅拌至溶解，得溶液A；

步骤二，于40ml去离子水中加入稀酸调整pH为1-5.5，然后加入乙烯基三乙氧基硅烷3ml，及硅酸四乙酯（纯度98％；阿拉丁试剂公司提供）10ml，搅拌至水解；

步骤三，将PBS缓冲液加入到步骤二得到的溶液中，调整其pH为中性，再将溶液A加入其中；然后加入6g 活性污泥，搅拌均匀；

步骤四，在步骤三中得到的混合液中加入安息香二甲醚溶液0.3 ml，四甲基乙二胺2ml，过硫酸钾饱和溶液5ml，快速搅拌均匀；

步骤五，将步骤四中得到的反应液置于辐照光源下辐照4分钟，进行固化；

步骤六，根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

实施例3

步骤一，丙烯酰胺6g溶解在60ml水中，加入N, N′-亚甲基双丙烯酰胺0.32 g，搅拌至溶解；

步骤二，在步骤一所得溶液中加入稀酸调整pH为1-5.5，然后加入乙烯基三甲基硅氧烷3ml，及四甲氧基硅烷（纯度98％，阿拉丁试剂公司提供）10ml，搅拌至水解；

步骤三，将PBS缓冲液加入到步骤二得到的溶液中，调整其pH为中性；然后加入4g硝化菌，搅拌均匀；

步骤四，在步骤三中得到的混合液中加入安息香二甲醚溶液0.2 ml，四甲基乙二胺1.2ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

步骤五，将步骤四中得到的反应液置于辐照光源下辐照4分钟，进行固化；

步骤六，根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

实施例4

步骤一，丙烯酰胺5g溶解在60ml水中，加入N, N′-亚甲基双丙烯酰胺0.4 g，搅拌至溶解；

步骤二，在步骤一所得溶液中加入稀酸调整pH为1-5.5，然后加入乙烯基三乙基硅氧烷3ml,及硅酸四乙酯10ml，搅拌至水解；

步骤三，在步骤二得到的溶液中加入13ml的去离子水，并将其减压蒸馏至无乙醇；

步骤四，将PBS缓冲液加入到步骤三得到的溶液中，调整其pH为中性；然后加入4g酶，搅拌均匀；

步骤五，在步骤四中得到的混合液中加入安息香二甲醚溶液0.2 ml，四甲基乙二胺1.2ml，过硫酸钾饱和溶液4ml，快速搅拌均匀；

步骤六，将步骤五中得到的反应液置于辐照光源下辐照4分钟，进行固化；

步骤七，根据需要将固化后的包埋菌切割成相应的尺寸及大小。

以上实施例1-4制备的包埋菌强度大，可在流化反应器中运行1年以上。它们在含氨氮废水及含苯酚的废水处理中表现出良好的去除效果。可在6小时内对550 mg/l浓度范围内的氨氮废水达到95％的去除率；在5小时内对600 mg/l 浓度范围内的苯酚废水达到98％的去除率。

尽管已参考示例性具体实施方式描述本发明，本领域技术人员将理解的是在不偏离本发明的范围的情况下可进行各种变化且可用等同替代方式替代与其对应的元件。此外，在不偏离本发明的基本范围的情况下，可进行多种修饰以使特定的情况或材料适应本发明的教导。

尽管已通过参考各种特定的具体实施方式对本发明进行了描述，将理解的是在描述的创造性概念的精神和范围内可进行多种变化。本发明的意图是不受限于所描述的具体实施方式，但是将具有由所附的权利要求书的语言所定义的全部范围。

Claims (9)

1.一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，

步骤一，将4.8 g-9 g的丙烯酰胺或含双键的单体或预聚物溶解在60ml的去离子水中，加入交联剂，得溶液A；或者

将4.8 g-9 g的丙烯酰胺或含双键的单体或预聚物溶解在体积为a ml的去离子水中，加入交联剂，得溶液A’；

步骤二，用稀酸将步骤一中得到的溶液A调整至pH为1-5.5，在调整pH后的溶液中加入乙烯基硅氧烷1-4ml，及四甲氧基硅烷或硅酸四乙酯19-16ml，搅拌至水解，得溶液B；或者

用稀酸将b ml的去离子水调整至pH为1-5.5，其中a+b=60，在调整pH后的溶液中加入乙烯基硅氧烷1-4ml，及四甲氧基硅烷或硅酸四乙酯19-16ml，搅拌至水解，得溶液B’，将溶液A’与B’共混均匀得到混合溶液；

步骤三，将PBS缓冲液加入到上一步骤得到的溶液中，调整其pH为中性；然后加入1-6g的微生物或其它包埋对象，搅拌均匀；

步骤四，在步骤三中得到的混合液中加入的安息香二甲醚溶液，四甲基乙二胺，以及过硫酸钾饱和溶液，迅速搅拌均匀；其中过硫酸钾在包埋体系中的百分比为0.1-0.6%(m/v, g/ml)，安息香二甲醚在包埋体系中的百分比为0.1-1.2%(v/v, ml/ml)，四甲基乙二胺在包埋体系中的百分比为0.7-5％（m/v, g/ml）；

步骤五，将步骤四中得到的反应液置于辐照光源下辐照2-6分钟，进行固化；

步骤六，根据需要将固化后的包埋微生物载体切割成相应的尺寸及大小。

2.如权利要求1所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，在上述步骤二与三之间，还进一步进行以下步骤：在保持体积不变的情况下，将步骤二得到的溶液减压蒸馏至无醇类挥发物质，得溶液C。

3.如权利要求1或2所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述的单体在溶液A中的浓度为：每100ml溶液中含的预聚物或单体的含量为9～14 g；交联剂在溶液中的质量体积百分数为0.2～1%(m/v)。

4.如权利要求1或2所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，在步骤三中，反应液中所加入微生物或其它包埋对象在溶液中的质量体积百分数为3.2～20%（m/v）。

5.如权利要求1或2所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，在步骤四中，所述的过硫酸钾、安息香二甲醚及四甲基乙二胺在溶液中的含量分别是0.1-0.55 %(m/v, g/ml), 0.2-1.0 %(m/v, g/ml), 1-5％（v/v, ml/ml）。

6.如权利要求1或2所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，在步骤五中，所述照射为3-6分钟。

7.如权利要求1或2所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，所述含双键的单体或预聚物是丙烯酰胺、丙烯酸、聚乙二醇预聚物。

8.如权利要求1或2所述的一种包埋微生物载体的光化学制备方法，其特征在于，所述交联剂是N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法制备的包埋载体。