CN102827481B - 一种角蛋白高弹柔性生物膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种角蛋白高弹柔性生物膜及其制备方法，所述的角蛋白高弹柔性生物膜由天然角蛋白纤维经还原法得到的纯角蛋白溶液制得，所得的角蛋白膜具有良好的弹性及韧性，弹性伸长率可控范围为10％-400％，弹性回复率为95％-100％。所述的角蛋白高弹柔性生物膜由纯角蛋白制成，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在生物医药领域具有广泛的应用前景。作为原材料的角蛋白溶液可由废弃羊毛或其它无纺用价值的动物纤维材料制备，原料来源广泛，成本低廉，加工工艺简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种角蛋白高弹柔性生物膜及其制备方法，属于生物材料技术领域。
背景技术
利用天然生物材料的优异生物相容性和生物可降解性开发新型生物材料一直是人们十分关注的研究课题，以角蛋白为主要原料制备的生物材料就是其中的一个重要分支。目前，角蛋白生物材料已成功应用于人工皮肤、骨修复材料、敷料、药物缓释、绷带等领域。
对从天然材料中提取角蛋白并将其转化为粉末、膜、涂料等的研究始于20世纪70年代。相关技术在国内外技术文献中已屡见报道。
日本学者山内清在1996年发表论文Preparation of stable aqueous solution ofkeratins，and physiochemical and biodegradational properties of films(Journal of Biomedical Materials Research，Vol.31，1996：439-444)，详细论述了角蛋白溶液及角蛋白膜的制备方法，并对角蛋白及角蛋白溶液的基本理化性能和角蛋膜的生物降解性进行研究，此后，角蛋白生物膜材料迅速发展。
此后，山内清研究小组又于2004年报道了加入交联剂乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和丙二醇二环氧丙酯(GDE)的角蛋白生物膜材料的制备方法(Fabrication andcharacterization of chemically crosslinked keratin films，Materials Scienceand Engineering C，Vol.24，2004：441-446)。并通过对成纤细胞的培养对角蛋白生物膜的生物相容性进行研究，结果表明角蛋白材料表现出优异的生物相容性和机械性能。
中国专利(201010161425.2)，该发明提供了一种羽毛角蛋白膜的制备方法，获得的角蛋白膜具有生物可降解性，机械性能良好，易剥离，可作为药物载体，用于膜剂药物的制备中，具有载药量大，药物的释放速度快的特点。
中国专利(201110037377.0)，该发明提供了一种生物医学工程领域使用的角蛋白材料的制备方法。用于制备片状、颗粒型及具有各种异型结构的角蛋白材料，适用于生物医学工程使用的损伤的修复材料、皮肤被覆材料、医学美容用材料和防组织粘连材料。
中国专利(200910048839.1)提供了一种角蛋白晶须增强的生物相容性同质复合膜及其制备方法。通过成膜工艺控制晶须在角蛋白膜中的取向，能够制备力学各向异性的生物膜材料，极大的提高了生物膜的力学性能和在应用领域的适应性。
以上文献和专利技术制备的角蛋白膜材料是以角蛋白为主要成分的生物膜材料，由于角蛋白提取物直接用于制备角蛋白膜为脆性材料，几乎不具有实用性能，因此，必须添加一定量的交联剂或增塑剂来提高角蛋白膜的柔韧性以满足用途需求，但同时也对角蛋白材料的生物相容性和降解性为产生了影响。从角蛋白自身结构来看，角蛋白大分子本身具有弹性的α螺旋结构，且通过对角蛋白自身交联结构的改变和设计，可以实现在不添加交联剂情况下制备具有良好弹性和韧性的纯角蛋白膜生物材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种柔软、具有高弹性的角蛋白生物膜材料及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种角蛋白高弹柔性生物膜。其特征在于，角蛋白膜由天然角蛋白纤维经还原法得到的纯角蛋白溶液制得，角蛋白膜具有良好的弹性及韧性，弹性伸长率可控范围为50％-400％，弹性回复率为98％-99％。
所述的天然角蛋白纤维优选为羊毛、牛毛、猪毛、兔毛、人发或驼毛。
所述的还原法所用试剂为还原剂、蛋白质变性剂的组合物。
所述的还原剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钾或偏重亚硫酸钠，还原剂的质量百分比浓度为7％-12％。
所述的蛋白质变性剂优选为尿素、硫脲或溴化锂，蛋白质变性剂的摩尔浓度为6-10M。
所述的纯角蛋白溶液的制备方法为：
第一步：将天然角蛋白纤维依次进行开松、除杂、清洗和干燥处理后，切断成3-6mm的纤维段，以固液比为2.5-10g/250ml浸入到含有还原剂和蛋白质变性剂的溶液中在50-90℃搅拌2-6h，搅拌器转速为100-400r/min；
第二步：将搅拌后所得的混合物用80-120目筛网过滤除去未反应的天然角蛋白纤维，离心处理去除滤液中的细小杂质，离心速度3000-7000rpm，离心时间0.2-1h，而后取上清液。
第三步：室温条件下，在无氧环境下快速脱盐去除溶液中的小分子物质，而后浓缩，得到纯角蛋白溶液，浓度为2％-5％。
所述的角蛋白高弹生物膜的制备方法为：将角蛋白溶液浇铸于成膜容器中，在温度为40-60℃的条件下固化5-24h。
所述的角蛋白高弹生物膜的弹性性能调控方法为：将浓度为0.01-0.03％过氧化氢水溶液按质量百分比1∶100缓慢滴入纯角蛋白溶液中，以调整角蛋白溶液中大分子的交联速度和交联程度，调控角蛋白高弹膜的弹性。也可不加入氧化剂，使角蛋白溶液在空气中自然氧化。
本发明提供了一种制备弹性可调控、高纯度的高弹角蛋白生物膜的方法，与以往角蛋白膜的制备方法不同，在角蛋白膜的制备过程中不使用交联剂改善角蛋白膜的脆性，而是通过调节角蛋白溶液中蛋白质大分子巯基的交联度和交联反应速度，从角蛋白大分子结构的层面改善角蛋白膜的韧性，且能够赋予角蛋白膜极高的弹性。
采用无氧环境下快速脱盐的方法避免了常规透析脱盐周期长的弊端，且最大程度的保全了蛋白质大分子交联反应的活性基团。常规3-5天的透析过程一方面容易使还原法得到的角蛋白大分子在透析液中发生氧化反应，不利于大分子在成膜过程中形成交联，影响成膜机械性能；另一方面长时间的透析过程会造成蛋白质结构的改变，甚至出现蛋白质重结晶等问题。
采用极稀的过氧化氢溶液对角蛋白溶液的交联速度和交联结构进行调控，在调节角蛋白膜的弹性性能的前提下，并不引入其他杂质，确保了角蛋白高弹生物膜的纯度和作为生物医用材料使用的安全性。
本发明所述的角蛋白弹性生物膜具有与聚氨酯膜相近的弹性性能，且具有很高的角蛋白纯度，可作为生物医用材料使用，具有广阔的市场前景。可以采用废弃的动物纤维作为原料，价格低廉，来源广泛，生产方法简单易行，经济效益显著。
附图说明
图1为本发明方法得到的角蛋白高弹柔性生物膜照片。
具体实施方式
下面通过实施例来具体说明本发明。
实施例1
将洗净的废弃羊毛切断成3-5mm长的纤维段，以固液比为1g/100ml浸入到250ml偏重亚硫酸钠和尿素的溶液中，其中，所述溶液是通过将偏重亚硫酸钠加到6M尿素水溶液中得到，偏重亚硫酸钠的质量浓度为7％，在90℃下对混合物搅拌2h，搅拌器转速200r/min。80目筛网过滤后，7000rpm离心分离0.2h后取上清液，氮气保护条件下采用过滤组件快速脱盐去除溶液中低分子量盐类物质后浓缩得到质量百分比浓度为2％的角蛋白溶液。
将浓度为0.01％的过氧化氢水溶液按质量百分比1∶100缓慢滴入纯角蛋白溶液中，而后，将角蛋白溶液浇铸于成膜容器中，在温度为40℃的条件下固化24h。得到弹性伸长率为212％的角蛋白高弹生物膜。
实施例2
将洗净的牛毛切断成3-5mm长的纤维段，以固液比为4g/100ml浸入到250ml亚硫酸钾和硫脲的溶液中，其中，所述溶液是通过将亚硫酸钾加到10M硫脲水溶液中得到，亚硫酸钾的质量浓度为12％，在50℃下对混合物搅拌4h，搅拌器转速100r/min。120目筛网过滤后，3000rpm离心分离1h后取上清液，氮气保护条件下采用过滤组件快速脱盐去除溶液中低分子量盐类物质后浓缩得到质量百分比浓度为5％的角蛋白溶液。
将浓度为0.03％的过氧化氢水溶液按质量百分比1∶100缓慢滴入纯角蛋白溶液中，而后，将角蛋白溶液浇铸于成膜容器中，在温度为60℃的条件下固化5h。得到弹性伸长率为57％的角蛋白高弹生物膜。
实施例3
将洗净的猪毛切断成3-5mm长的纤维段，以固液比为2g/100ml浸入到250ml亚硫酸氢钠和溴化锂的溶液中，其中，所述溶液是通过将亚硫酸氢钠加到8M溴化锂水溶液中得到，亚硫酸氢钠的质量浓度为10％，在70℃下对混合物搅拌6h，搅拌器转速400r/min。100目筛网过滤后，5000rpm离心分离0.5h后取上清液，氮气保护条件下采用过滤组件快速脱盐去除溶液中低分子量盐类物质后浓缩得到质量百分比浓度为4％的角蛋白溶液。
将浓度为0.02％的过氧化氢水溶液按质量百分比1∶100缓慢滴入纯角蛋白溶液中，而后，将角蛋白溶液浇铸于成膜容器中，在温度为50℃的条件下固化20h。得到弹性伸长率为105％的角蛋白高弹生物膜。
实施例4
将洗净的废弃兔毛切断成3-5mm长的纤维段，以固液比为3g/100ml浸入到250ml亚硫酸氢钾和尿素的溶液中，其中，所述溶液是通过将亚硫酸氢钠加到7M尿素水溶液中得到，亚硫酸氢钠的质量浓度为8％，在80℃下对混合物搅拌4h，搅拌器转速200r/min。80目筛网过滤后，4000rpm离心分离0.5h后取上清液，氮气保护条件下采用过滤组件快速脱盐去除溶液中低分子量盐类物质后浓缩得到质量百分比浓度为3％的角蛋白溶液。
将角蛋白溶液浇铸于成膜容器中，在温度为40℃的条件下固化24h。得到弹性伸长率为389％的角蛋白高弹生物膜。
表1过氧化氢水溶液浓度与角蛋白高弹生物膜弹性的关系
从表1可以看出，随过氧乙酸溶液添加量增多，还原法制得的角蛋白大分子的巯基基团被氧化程度高，角蛋白分子的再交联程度增加，所得的角蛋白弹性生物膜的弹性伸长率降低，弹性回复率升高。未加入过氧化氢水溶液的纯角蛋白溶液，在成膜过程中巯基基团重建二硫键的比例低，因而角蛋白弹性膜的弹性性能良好，表现出与聚氨酯纤维相近的弹性性能优良弹性性能。角蛋白膜的弹性性能具有较大范围的可控性，为扩展角蛋白膜作为生物材料的应用领域奠定了良好的基础。
Claims (5)
1.一种角蛋白高弹柔性生物膜的制备方法，该制备方法以天然角蛋白纤维为原料，经还原法得到纯角蛋白溶液，进而成膜固化制备得到角蛋白高弹柔性生物膜，所得生物膜的弹性伸长率可控范围为10％-400％，弹性回复率为95％-100％，其特征在于所述角蛋白高弹柔性生物膜的弹性可控性操作方法为：将浓度为0.01-0.03％过氧化氢水溶液按质量百分比1∶100缓慢滴入纯角蛋白溶液中，以调整角蛋白溶液中大分子的交联速度和交联程度，调控角蛋白高弹柔性生物膜的弹性。
2.根据权利要求1所述角蛋白高弹柔性生物膜的制备方法，其特征在于所述天然角蛋白纤维为羊毛、牛毛、猪毛、兔毛、人发或驼毛。
3.根据权利要求1所述角蛋白高弹柔性生物膜的制备方法，其特征在于所述纯角蛋白溶液的制备方法的具体步骤为：
①将天然角蛋白纤维依次进行开松、除杂、清洗和干燥处理后，切断成3-6mm的纤维段，以固液比为2.5-10g/250ml浸入到含有还原剂和蛋白质变性剂的混合溶液中，在50-90℃下搅拌2-6h，搅拌器转速为100-400r/min；所述还原剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钾或偏重亚硫酸钠，还原剂的质量百分比浓度为7％-12％；所述蛋白质变性剂为尿素、硫脲或溴化锂，蛋白质变性剂的摩尔浓度为6-10M；
②将搅拌后所得的混合物用80-120目筛网过滤除去未反应的天然角蛋白纤维，离心处理去除滤液中的细小杂质，离心速度3000-7000rpm，离心时间0.2-1h，而后取上清液；
③室温条件下，在无氧环境下快速脱盐去除溶液中的小分子物质，而后浓缩即得到浓度为2-5％的纯角蛋白溶液。
4.根据权利要求1所述角蛋白高弹柔性生物膜的制备方法，其特征在于所述成膜固化制备得到角蛋白高弹柔性生物膜的方法是将所得纯角蛋白溶液浇铸于成膜容器中，在温度为40-60℃条件下，固化5-24h即得。
5.权利要求1-4任一项所述角蛋白高弹柔性生物膜的制备方法制备得到的角蛋白高弹柔性生物膜，该生物膜的弹性伸长率为10-400％，弹性回复率为95-100％。
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