CN102827098B - 1,3,4-噁二唑类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种1,3,4-噁二唑类衍生物及其合成方法，以及衍生物作为荧光指示剂用于细胞内钙离子(Ca²⁺)的检测。该方法包括如下步骤：在惰性气体保护下，将1,3,4-噁二唑衍生物和钙离子响应基团，通过wittig反应，制得产物粗品；将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。该1,3,4-噁二唑类衍生物表现出对Ca²⁺高的灵敏度和好的选择性，大的Stocks位移，成比率测量等优点；由于该指示剂在结合Ca²⁺前后颜色有较大的变化，可方便地通过裸眼识别判断；此外，该指示剂还可负载于细胞中，在激光共聚焦显微镜下可方便检测到细胞内Ca²⁺信号及其浓度的变化。

Description

1,3,4-噁二唑类衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及噁唑类化合物，具体是一种噁二唑类衍生物及其制备方法，以及该噁二唑类衍生物作为荧光指示剂在检测细胞内钙离子中的应用。

背景技术

钙离子作为第二信使广泛参与了细胞的各种生理活动的调控，如肌肉的收缩、心脏的跳动、内分泌、外分泌腺的分泌、糖原的合成分解、电解质的转运、多种激素、酶类和神经递质的释放、DNA的合成、细胞的代谢与功能的调节等。在正常细胞中，细胞内游离的Ca²⁺浓度约为0.1μmol/L～1.0μmol/L，细胞外钙离子浓度比细胞内钙离子浓度高1万倍，约为1.5mmol/L。细胞内外浓度梯度的存在是Ca^2＋作为细胞信使的基础。当细胞受到刺激时，胞内Ca^2＋浓度将升至1～10μmol/L，从而引起一定的生理反应。许多研究表明，人体的疾病和衰老过程是由于各种原因所致的机体Ca²⁺调节失衡，细胞内Ca²⁺含量增加、导致细胞内、外Ca²⁺浓度差下降而引起的。因此，准确测定细胞内Ca²⁺的浓度及动态的变化具有非常重要的意义。

目前，测定细胞内Ca²⁺的方法有生物发光蛋白法、有机显色剂法、离子传感器法、微电极法、核磁共振法、荧光指示剂法等。理想的胞内Ca²⁺的测定方法是在亚细胞水平无损伤地、直接、迅速、实时地观察细胞内任意部位的Ca²⁺的动态变化而不影响细胞内正常的生理、生化过程；而且要求指示剂与Ca²⁺结合的响应速度快于胞内Ca²⁺信号引起的相关生理和生化反应的速度；此外，还要求指示剂的选择性好，灵敏度和时空分辨率高。这里，荧光指示剂法以其高的灵敏度和选择性、响应速度快等优点显示出独特的优势，并且，荧光显微成像技术可通过使用Ca²⁺荧光指示剂实现细胞内Ca²⁺的高时空分辨。

现在可用的Ca²⁺荧光指示剂分为比率型和非比率型两类。比率型荧光指示剂是采用两个测定波长处荧光强度的比值，利用指示剂与Ca²⁺结合前后的荧光强度的变化作为定量测定的基础。该方法可有效消除因指示剂负染不匀、生物样品厚度不均及设备等因素引起的误差，从而得到比非比率型荧光指示剂更准确的测定结果。比率型荧光指示剂分为激发比率型和发射比率型两种。现在可用的商业化的比率型Ca²⁺荧光指示剂（包括激发型和发射型）只有几种，如：Fura-2,Indo-1等，但是这些指示剂有的需要紫外光的激发，导致生物样品的损伤和生物样品自身荧光的干扰(a.Grynkiewicz,G.等人，J.Biol.Chem.1985,260,3440-3450.b.Gee,K.R.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2000，10，1515-1518)；有的由于其解离常数（K_d）值较小，不适合用于测定细胞或者生物样品高浓度Ca²⁺的区域和动态Ca²⁺的变化,如：Bis-fura-2,Fura-red等(Takahashi,A.等人，physiological reviews,1999,79,1089-1125)。因此，发展Ca²⁺指示剂的焦点就集中在：可见光或近红外的激发、好的选择性、高的灵敏度、大的Stokes位移、成比率测量等，并且该指示剂能够很方便负载于细胞或组织中，利用荧光显微成像技术实现对细胞内Ca²⁺的高时空分辨。

发明内容

本发明的目的之一是提供1,3,4-噁二唑衍生物；目的之二是提供该衍生物的制备方法，该方法工艺简单、成本低廉；目的之三是提供该衍生物的用途，即该衍生物可作为荧光指示剂检测细胞内的Ca²⁺，该指示剂对Ca²⁺有高的灵敏度和选择性，且对Ca²⁺的测定表现为成比率的激发或发射，并能够有效减小激发光和细胞或生物样品自身荧光的干扰，还可凭借裸眼来判断指示剂与Ca²⁺结合的情况。

本发明提供的一种1,3,4-噁二唑类衍生物，其结构式为：

其中，R₁至R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或锂离子。

上述结构式（I）的一种1,3,4-噁二唑类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

a.在惰性气体保护下，将2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑和钙离子响应基团按照摩尔比1:1，通过wittig反应4小时，制得产物粗品；

b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品；

所述的4-烷氧基为4-甲氧基、4-乙氧基或4-丙氧基。

合成路线：

上述2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑的合成参照文献：(a)刘国华，杨平，蒋宛莉，郭晓稚，许贵宝，蒋雪璋，沈梁，王筱梅，功能材料，2005,36,600-604；(b)Guo,X.Z.;Wang,X.M.;Du,Y.K.;Hua,N.P.;Shen,M.;Jiang,W.L.;Yang,P.Chinese Chem.Lett.2005,16,597-600；钙离子响应基团的合成参照文献：a)Tsien,R.Y.Biochemistry1980,19,2396-2404；b)Grynkiewicz,G.;Poenie,M.;Tsien,R.Y.J.Biol.Chem.1985,260,3440-3450.）。

本发明提供的另一种1,3,4-噁二唑类衍生物，其结构式为：

其中，R₁至R₄、R₆、R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或锂离子。

上述结构式（II）的一种1,3,4-噁二唑类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

a.在惰性气体保护下，将2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑和钙离子响应基团按照摩尔比2:1，通过wittig反应4小时，制得产物粗品；

b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品；

所述的4-烷氧基为4-甲氧基、4-乙氧基或4-丙氧基。

合成路线：

上述2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑的合成参照文献：(a)刘国华，杨平，蒋宛莉，郭晓稚，许贵宝，蒋雪璋，沈梁，王筱梅，功能材料，2005,36,600-604；(b)Guo,X.Z.;Wang,X.M.;Du,Y.K.;Hua,N.P.;Shen,M.;Jiang,W.L.;Yang,P.Chinese Chem.Lett.2005,16,597-600。钙离子响应基团的合成参照文献：a)Tsien,R.Y.Biochemistry1980,19,2396-2404.；b)Grynkiewicz,G.;Poenie,M.;Tsien,R.Y.J.Biol.Chem.1985,260,3440-3450.）。

上述结构式（I）和（II）的1,3,4-噁二唑类衍生物可作为检测细胞内钙离子的荧光指示剂，例如用于模拟生物体系中Ca²⁺的检测，生物活细胞和活组织内Ca²⁺的分析检测和荧光成像检测，以及与临床医学相联系的不同细胞或组织中Ca²⁺的测定。

与现有技术相比，本发明合成的1,3,4-噁二唑类衍生物作为Ca²⁺荧光指示剂属于比率型指示剂，能够有效消除因指示剂负染不匀、生物样品厚度不均及设备等因素引起的误差，从而得到比非比率型荧光指示剂更准确的测定结果。而且，该指示剂具有大的Stokes位移，能够有效减小激发光和细胞或生物样品自身荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，减少对生命体系的损伤，有利于活体的检测。本发明的荧光指示剂是基于分子内电荷转移(ICT)设计的，因此，钙离子响应基团与Ca²⁺的结合导致了钙离子响应基团供电子能力的减弱，表现出吸收和发射光谱的大的蓝移及指示剂与Ca²⁺结合前后颜色的变化，这样可凭借裸眼来判断指示剂与Ca²⁺结合的情况。另外，将该指示剂通过激光共聚焦显微成像技术可检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的Ca²⁺。1,3,4-噁二唑类Ca²⁺荧光指示剂还具有合成方法简单，成本低廉，具有很大的实际应用价值。

附图说明

图1本发明实施例2的1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光指示剂与不同浓度的Ca²⁺在Hepes缓冲液中（pH=7.2）的发射光谱曲线。

图2自然光下和紫外灯下本发明实施例2的1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光指示剂结合Ca²⁺前后的颜色变化，其中：a)自然光下，颜色由橙色变为几乎无色；b)紫外灯下，颜色由红色变为绿色。

图3本发明实施例4的1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光指示剂与不同浓度的Ca²⁺在Hepes缓冲液中（pH=7.2）的激发光谱曲线。

图4自然光下和紫外灯下本发明实施例4的1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光指示剂结合Ca²⁺前后的颜色变化，其中：a)自然光下，颜色由橙色变为很淡的黄色；b)紫外灯下，颜色由红色变为黄绿色。

图5本发明实施例1的1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光指示剂测定人脐静脉内皮细胞（(HUVEC)静息态的Ca²⁺的激光共聚焦显微成像，呈现明亮的绿色。

图6本发明实施例3的1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光指示剂测定人脐静脉内皮细胞（(HUVEC)静息态的Ca²⁺的激光共聚焦显微成像，呈现明亮的黄绿色。

具体实施方法

实施例1：

（1）2-(4-乙氧基)-苯基)-5-(4-甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑的合成：

4-甲基苯甲酸(1.81g,13.3mmol)，加入2mLSOCl₂，搅拌回流反应3h后，该反应混合物减压浓缩，得到黄色的溶液，即：对甲基苯甲酰氯。将此冷却的黄色溶液缓慢滴加到含有4-乙氧基亚苯基肼（2.18g,12.1mmol）和1.1mL的吡啶的10mL氯仿溶液中，将此混合溶液搅拌回流3h后，减压浓缩，冷却，得到混合物固体。将此固体混合物用水洗至中性后，干燥。将此干燥混合物加入热乙醇重结晶，得到3.24g白色晶体。将此白色晶体真空干燥后，加入10mL POCl₃回流7h后，减压浓缩，冷却，得到固体混合物。将此固体混合物用NaAC（50%，w/w）溶液洗至中性后，再用冰水洗两次，然后用100mL的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压浓缩，得到淡黄色晶体产物1.47g，产率60%。熔点：129-132°C.The¹H NMR(600MHz,CDCl3)data areδ8.00(d,Ar-H,2H),7.91(d,Ar-H,2H),7.30(d,Ar-H,2H),7.05(d,Ar-H,2H),4.10(q,-CH₂-,2H),2.34(s,CH₃-,3H),and1.32(t,CH₃-,3H).

（2）溴化产物2-(4-乙氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑的合成：

由（1）制备的产物（1.47g），加入到含有0.95g(5mmol)N-溴代琥珀酰亚胺和0.015g过氧化苯甲酰的12mL干燥的苯溶液中，该混合物搅拌、回流5h后，溶剂苯通过旋转蒸发后，剩余混合物通过热乙醇重结晶得到产物1.70g，约90%的产率。熔点：104-108°C。The¹HNMR(600MHz,CDCl₃)data areδ8.00(d,Ar-H,2H),7.95(d,Ar-H,2H),7.30(d,Ar-H,2H),7.05(d,Ar-H,2H),4.10(q,-CH2-,2H),4.60(s,-CH2-,2H),and1.32(t,CH3-,3H).

（3）Ca²⁺响应基团5’-醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酯的合成：

1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸乙酯6.0g(10.2mmol)加入到含有21mL干燥吡啶的30mL DMF溶液中，在冰浴、搅拌下，缓慢滴加16mL POCl₃溶液，滴加完后，在0°C条件下继续反应0.5h，撤去冰浴，缓慢升温至70°C反应1h后，然后室温反应过夜。用100mL氯仿萃取反应产物两次，合并萃取液，并用水洗萃取液至中性后，加入Na₂SO₄干燥过夜，过滤除去干燥剂后，减压浓缩。将该浓缩液通过硅胶柱纯化，石油醚/乙酸乙酯（1:1）为洗脱剂，得到3.41g白色固体，产率54%。The¹H NMR(600MHz,CDCl₃)data areδ9.63(s,-CHO,1H),7.51(d,Ar-H,1H),7.30(d,Ar-H,1H),6.88(dd,Ar-H,2H),6.65(d,Ar-H,2H),6.38(d,Ar-H,1H),4.58(s,-CH2-CH2-,4H),4.32(s,-CH2-,8H),4.12(q,-CH2-,8H),and1.32(t,CH₃-,12H).

（4）1,3,4-噁二唑类衍生物的合成：

化合物2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑1.70g(4.73mmol)，三苯基膦1.36g（4.89mmol）加入到25mL干燥的苯中，加热、搅拌、回流反应4h后，减压除去溶剂苯，得到白色固体膦盐2.9g。NaH0.16g(4mmol)加入到5mL的石油醚中，在N₂保护下搅拌20min后，弃去溶剂石油醚，加入15mL干燥的CH₂Cl₂和白色固体膦盐2.0g(3.24mmol)，室温搅拌1h后，加入2.0g5’-醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酯，继续室温搅拌4h后，该反应产物浓缩，并通过硅胶柱纯化，正己烷/乙酸乙酯（1:1）作为洗脱剂，得到黄色固体产物1.7g，产率60%。熔点：62-64°C。The¹H NMR(600MHz,CDCl₃)data areδ8.04(d,Ar-H,2H),7.82(d,Ar-H,2H),7.56(d,Ar-H,2H),7.38(d,Ar-H,H),7.30(d,Ar-H,H),7.04(d,Ar-H,3H),6.91(s,Ar-H,1H),6.80(dd,Ar-H,1H),6.66(dd,1H and d,1H),6.96(d,-CH=CH-,2H),4.60(s,-CH2-CH2-,4H),4.31(s,-CH2-,8H),4.12(q,-CH2-.10H),1.31(t,CH3-,15H).The¹³C NMR(600MHz,CDCl₃)data areδ171,170,164,161,145,132,128.6,127,126.8,126.7,125.5,121,118,116,114,110,67,65.5,61.2,61.1,14.7and14.0.MALDI-TOF-MS:m/z:calcd for C₄₈H₅₄N₄O₁₂ ⁺:878,found:901.5798(M⁺+Na⁺).Anal.Calcd for C₄₈H₅₄N₄O₁₂:C,65.59;H,6.19;N,6.37;O,21.84.Found:C,65.78;H,6.20;N,6.39;O,21.89.

实施例2：

将实施例1产物1,3,4-噁二唑类衍生物通过LiOH碱性水解，即可得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物锂盐。

实施例3：

Ca²⁺响应基团为5，5’-二醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酯，2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑与钙离子响应基团反应的摩尔比为2:1，其余同实施例1，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

产率56%。熔点：60-62°C。The¹H NMR(600MHz,CDCl₃)data areδ8.02(d,Ar-H,4H),7.80(d,Ar-H,4H),7.56(d,Ar-H,4H),7.38(d,Ar-H,2H),7.30(d,Ar-H,2H),7.04(d,Ar-H,4H,d,-CH=CH-,2H),6.90(d,-CH=CH-,2H),6.85(dd,Ar-H,2H),4.60(s,-CH₂-CH₂-,4H),4.31(s,-CH₂-,8H),4.10(q,-CH₂-.12H),1.30(t,CH₃-,18H).The¹³C NMR(600MHz,CDCl₃)data areδ170,164,159,143,138,128,121,125,115,112,69,65,61,14.8and14.0.MALDI-TOF-MS:m/z:calcd for C₄₈H₅₄N₄O₁₂ ⁺:1168,found:1191.6904(M⁺+Na⁺).Anal.Calcd for C₄₈H₅₄N₄O₁₂:C,67.79;H,5.86;N,7.19;O,19.16.Found:C,67.80;H,5.87;N,7.18;O,19.17.

实施例:4：

将实施例3产物1,3,4-噁二唑类衍生物通过LiOH碱性水解，即可得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物锂盐。

实施例5：

Ca²⁺响应基团为5-甲基-5’-醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酯，其余同实施例1，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例6：

Ca²⁺响应基团为5-F-5’-醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酯，其余同实施例1，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例7:

R₈为甲氧基，其余同实施例1，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例8:

R₈为丙氧基，其余同实施例1，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例9：

Ca²⁺响应基团为5’-醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯，其余同实施例1，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例10：

Ca²⁺响应基团为4,4’-二氟-5，5’-二醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸乙酯，其余同实施例3，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例11:

Ca²⁺响应基团为5，5’-二醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯，R₈为甲氧基，其余同实施例3，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例12：

Ca²⁺响应基团为4,4’-二甲基-5，5’-二醛基-BAPTA-四乙酸甲酯，R₈为甲氧基，其余同实施例3，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例13：

Ca²⁺响应基团为3,3’-二甲基-5，5’-二醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯，R₈为甲氧基，其余同实施例3，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例14：

Ca²⁺响应基团为3,3’-二甲基-5，5’-二醛基-1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯，R₈为丙氧基，其余同实施例3，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

实施例15：

Ca²⁺响应基团为4,4’-二甲基-5，5’-二醛基-BAPTA-四乙酸甲酯，其余同实施例3，得到如下结构的1,3,4-噁二唑类衍生物。

Claims (5)

1.一种1,3,4-噁二唑类衍生物，其特征在于结构式：

其中，R₁至R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或锂离子。

2.如权利要求1所述的一种1,3,4-噁二唑类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

a.在惰性气体保护下，将2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑和钙离子响应基团按照摩尔比1:1，通过wittig反应4小时，制得产物粗品；

b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品；

所述的4-烷氧基为4-甲氧基、4-乙氧基或4-丙氧基。

3.一种1,3,4-噁二唑类衍生物，其特征在于结构式：

其中，R₁至R₄、R₆、R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或锂离子。

4.如权利要求3所述的一种1,3,4-噁二唑类衍生物的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

a.在惰性气体保护下，将2-(4-烷氧基)-苯基)-5-(4-溴甲基)-苯基)-1,3,4-噁二唑和钙离子响应基团按照摩尔比2:1，通过wittig反应4小时，制得产物粗品；

b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品；

所述的4-烷氧基为4-甲氧基、4-乙氧基或4-丙氧基。

5.如权利要求1或3所述的一种噁二唑类衍生物作为检测细胞内钙离子的荧光指示剂。

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