CN102808034A - 一种在蚕卵期鉴别家蚕吐丝颜色的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的方法。本发明所述方法利用基因工程技术提取待测家蚕基因组DNA，用特异引物进行PCR扩增反应，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物的种类和长度判断家蚕吐丝颜色。本发明所述鉴定方法操作简便快速，在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色准确性高。通过本发明所述方法可以在蚕卵阶段将不具有吐黄色丝结黄茧的能力的家蚕进行区分，极大地减少了育种过程中的饲养工作量及饲养成本。

Description

一种在蚕卵期鉴别家蚕吐丝颜色的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种在蚕卵期鉴别家蚕吐丝颜色的方法，具体的是利用家蚕BmStart1基因特定区域的DNA结构，鉴别Cbp基因和Cbp-like基因的转录mRNA与翻译蛋白质类型，在蚕卵期特异性鉴别家蚕吐丝颜色。

背景技术

家蚕（Bombyx mori）也称桑蚕，是被产业化利用大量生产丝蛋白纤维的昆虫。家蚕是完全变态昆虫，一生经过卵、幼虫、蛹、成虫等四个形态上和生理机能上完全不同的发育阶段，其中卵是胚胎发生、发育形成幼虫的阶段，幼虫是摄取食物营养的生长阶段，蛹是从幼虫向成虫过渡的变态阶段，成虫是交配产卵繁殖后代的生殖阶段。整个世代只幼虫期摄食，并为蛹和成虫期的生命活动积贮营养，尤其是4、5龄幼虫大量摄食桑叶，快速合成丝蛋白质，其中5龄幼虫食桑量占全龄幼虫用桑量的85%，5龄幼虫生长至最大体重时，比蚁蚕体重增加近1万倍。

蚕丝是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，也称茧丝。它与羊毛一样，是人类最早利用的动物纤维之一。家蚕天然彩色茧是人类早已发现的资源，有黄红茧系、黄绿茧系和白茧系3类。黄红茧系包括淡黄、金黄、肉色、红色、蒿色、锈色等多种茧色；黄绿茧系包括竹绿（淡绿）和绿色两种。其中白茧系是国内外养蚕业普遍生产的蚕茧，现代缫丝工业也主要利用家蚕白色茧丝，并通过化学染色等工艺生产有色丝绸产品，而在丝绸染整加工过程中的染料等化学物质，有相当一部分含有对人体有害的物质，印染废水则成为工业污水的重要整治目标。黄红茧系、黄绿茧系不进行染色就能够生产有色丝纺织品，更加符合现代养蚕业发展和丝织工业生产的要求，也是国内外纺织品市场的高端产品。家蚕天然彩色茧丝纤维吸湿导湿性能强、抑菌性能优，吸收紫外线与抗氧化等护肤能力好，具有色彩天然、色泽雅致等突出性能，生产的纤维产品色泽柔和、无毒无害、色彩自然，是高档天然绿色纺织材料。家蚕天然彩色茧丝纤维生产过程不需要染色，能够有效减少丝绸印刷的污染，对环境和人体友好，具有重大经济利用价值和重要的社会发展意义。但近百年来，彩色茧原料生产一直未能解决茧色杂、易褪色、丝质差、丝量低和茧形不正（橄榄形或三角形）等茧丝纤维特性的重大缺陷，家蚕彩色茧精细化加工技术也因为没有合格的原料茧，无法开展技术研究与突破，存在无法纺制细纤高档天然彩色丝线、无法生产高档面料的行业技术瓶颈。因此迫切需求创新天然彩色茧品种，促进优质天然彩色茧原料生产。

家蚕形成茧色的物质来源于幼虫取食的桑叶（饲料），桑叶中的天然色素在体内与色素转运蛋白结合后，才能够被家蚕消化道吸收，并进一步通过血液转移进入丝腺，最终形成有色茧。家蚕丝腺中色素的积累，主要发生在5龄幼虫期，但最终需要到幼虫发育完成、吐丝结茧后才能够看到茧色。因此按照常规方法通过茧色进行有色茧品种培育，需要投入巨大的幼虫饲养人力和物力。创新茧色判别方法，减少鉴别过程的人力和物力投入，缩短鉴别过程所需时间，提高鉴别准确性，是目前家蚕有色茧品种培育过程迫切需要解决的问题。

Tabunoki H等（2002）,Tsuchida等（2004），Sakudoh等（2005，2007），牛艳山等（2010）报道了一种类胡萝卜素结合蛋白（Carotenoid binding protein，CBP）基因，其蛋白质产物与类胡萝卜素特别是叶黄素（Lutin）的吸收、转运密切相关，是黄红色茧成色的关键基因。CBP作为胞质溶胶中的类胡萝卜素载体与C基因编码的CAMEO2蛋白作为细胞表面的跨膜受体协同作用，共同介导类胡萝卜素的运输（Sakudoh et al.,2010）。牛艳山等通过检验一种类胡萝卜素结合蛋白（Carotenoid binding protein，CBP）基因Cbp和Cbp-like基因转录的mRNA结构，或者检测CBP蛋白质产物，可以确认检测个体的类胡萝卜素结合蛋白基因类型，进而在家蚕幼虫期即可判断家蚕吐丝颜色。但家蚕Cbp基因和Cbp-like基因主要在5龄幼虫丝腺和消化管转录表达，鉴定Cbp基因和Cbp-like基因转录和表达产物类型需要杀死幼虫取出丝腺或消化管组织，无法同时实现鉴定家蚕吐丝颜色与留种两全。

为此，寻找一种在保证家蚕幼虫存活的前提下于蚕茧形成前鉴定家蚕吐丝颜色的方法，对于提高家蚕天然彩色茧品种培育、减少育种过程中的饲养工作量及饲养成本具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种在蚕卵期快速、准确、特异性鉴别家蚕吐丝颜色的方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的方法，提取待测家蚕蚕卵的基因组DNA，用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增反应，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，判断家蚕吐丝颜色；

若同时具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或者仅具有一条SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，则家蚕吐黄色茧丝；

若仅具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，则家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。

家蚕基因转录的mRNA和翻译的蛋白质序列，虽然依赖于该基因的外显子序列，但其内含子序列和顺式调节子等其它序列有时也影响基因转录的mRNA和翻译的蛋白质序列。家蚕的BmStart1基因位点是一个复杂的多基因重叠位点，Cbp基因是其中1个重叠基因。家蚕的Cbp基因重叠范围内的DNA有4种不同序列，这种DNA序列的差异，既有Cbp基因外显子的序列差异，也有影响Cbp基因mRNA转录本的内含子序列差异，导致在结不同颜色蚕茧的家蚕的色素吸收和储存组织的Cbp基因和Cbp-like基因mRNA转录本有多于4种不同序列，翻译的蛋白质序列和功能也有差异。Cbp基因重叠范围内的DNA序列虽然变化很多，但其中存在能够区分结黄色茧家蚕与结其它颜色茧家蚕的特异序列。本发明所述方法利用家蚕BmStart1基因特定区域的DNA结构，鉴别Cbp基因和Cbp-like基因的转录mRNA与翻译蛋白质类型，进而在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色。

在一个具体实施方式中，本发明以提取的家蚕蚕卵的基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物PCR扩增家蚕特征DNA序列，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，从4个不同蛾区蚕卵中鉴别出具有吐黄色丝的蚕卵蛾区。结果显示PCR扩增产物同时具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列或者仅具有一条SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的1号蛾区和2号蛾区的家蚕吐黄色茧丝；PCR扩增产物仅具有一条SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列的1号蛾区和2号蛾区的家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。

在一个具体实施方式中，本发明进一步以提取的家蚕蚕卵的基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物PCR扩增家蚕特征DNA序列，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，从100个蛾区蚕卵中鉴别出幼虫具有吐黄色丝功能的蚕卵蛾区。结果显示PCR扩增产物同时具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQID NO：4所示的核苷酸序列或者仅具有一条SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的1号蛾区和3号蛾区的家蚕吐黄色茧丝；PCR扩增产物仅具有一条SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列的2号、4号-100号蛾区的家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。本发明所述鉴别家蚕吐丝颜色的方法准确率为100%。通过本发明所述方法可以将不具有吐黄色丝结黄茧的能力的蛾区2号、4号至100号的98个蛾区销毁，极大的减少了育种过程中的饲养工作量。

本发明还提供了一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的试剂盒，包括具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。

在一些实施例中，本发明所述在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的试剂盒还包括PCR扩增反应缓冲液、dNTP、Taq酶中的一种或几种。

本发明还提供了一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的DNA分子组，由SEQID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成。

本发明提供了一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的方法。本发明所述方法利用基因工程技术提取待测家蚕基因组DNA，用特异引物进行PCR扩增反应，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物的种类和长度判断家蚕吐丝颜色，用以区分家蚕是否吐有色茧丝。本发明所述鉴定方法操作简便快速，在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色准确性高。通过本发明所述方法可以在蚕卵阶段即可将不具有吐黄色丝结黄茧的能力的家蚕进行区分，极大的减少了彩色茧品种育种过程中的饲养工作量及饲养成本。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种在蚕卵期鉴别家蚕吐丝颜色的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。

实施例1：

为了从收集的遗传资源的4个蛾区蚕卵中鉴别出具有吐黄色丝的蚕卵蛾区，本实施例进行了如下的步骤：

（1）在孵化E6d至E12d的孵化后期，从每个蚕卵蛾区中各取3-10粒蚕卵，以商用DNA提取试剂盒（Qiagen公司）提取蚕卵胚胎的基因组DNA，保存于-80℃备用。

（2）以步骤（1）提取的4种家蚕基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系和反应程序如下，每个样品重复检测3次，

PCR扩增反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体系总量25μL。

PCR反应程序为：

（3）以加入EB的1.2%琼脂糖电泳检测步骤（2）获得的各蛾区蚕卵DNA模板的PCR扩增产物的种类与序列长度，以200bp DNA Ladder为序列长度标记。

（4）紫外光条件下观察步骤（3）获得的电泳凝胶，4个蛾区蚕卵的基因组DNA样本的PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果为：

蛾区1号的基因组DNA样本，只有1条长度1100bp的产物；蛾区2号的基因组DNA样本，同时具有1条长度700bp的产物和1条长度1100bp的产物；蛾区3号和蛾区4号的基因组DNA样本都只有1条长度700bp的产物。

（5）将3个蛾区蚕卵从步骤（3）电泳凝胶获得的700bp的产物和1100bp产物分别用PCR Clean-up kit回收，克隆测序后结果为：

蛾区1号来源的1100bp的产物，3个克隆中有2个克隆具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，另1个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有1个碱基的差异。蛾区2号来源的700bp的产物，3个克隆有2个克隆具有SEQID NO：3所示核苷酸序列，另1个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有1个碱基的差异。蛾区2号来源的1100bp的产物，3个克隆有1个克隆具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，有1个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有1个碱基的差异，另1个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有2个碱基的差异。蛾区3号来源的700bp的产物，3个克隆有1个克隆具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，另2个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有1个碱基的差异。蛾区4号来源的700bp的产物，3个克隆有2个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有1个碱基的差异，另1个克隆与具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列仅有2个碱基的差异。

（6）将4个蛾区剩余蚕卵孵化后的蚁蚕分别饲养，蛾区1号、2号和3号的5龄幼虫腹部的体色都为黄色，蛾区4号的5龄幼虫腹部的体色都为无色；吐丝结茧后，蛾区1号的幼虫结出了金黄色茧，蛾区2号的幼虫结出了黄色茧，蛾区3号的幼虫结出了绿色茧，蛾区4号的幼虫结出了白色茧。

因此判定若家蚕同时具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列或仅具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，则家蚕吐黄色茧丝；若家蚕仅SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，则家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。

实施例2：

从100个蛾区蚕卵中鉴别出幼虫具有吐黄色丝功能的蚕卵蛾区。

（1）从每个蚕卵蛾区中取10粒蚕卵孵化处理，在孵化E6d至E12d的孵化后期，提取蚕卵胚胎的基因组DNA，提取的DNA模板保存于-80℃备用。

（2）以步骤（1）提取的各蛾区家蚕基因组DNA为模板，用具有SEQ IDNO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系和反应程序如下，每个样品重复检测3次，

PCR扩增反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体系总量25μL。

PCR反应程序为：

（3）以加入EB的1.2%琼脂糖电泳检测步骤（2）获得的各蛾区蚕卵DNA模板的PCR扩增产物的种类与序列长度，以200bp DNA Ladder为序列长度标记。

（4）紫外光条件下观察步骤（3）电泳凝胶，100个蛾区蚕卵的基因组DNA样本的PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果为：

蛾区1号和蛾区3号的基因组DNA样本，都同时具有1条具有SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的长度700bp的产物和1条具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的长度1100bp的产物，蛾区2号、4号至100号的98个蛾区的基因组DNA样本，都只有1条具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的长度700bp的产物。

将蛾区1号与蛾区3号剩余的蚕卵孵化后蚁蚕全部饲养，5龄幼虫腹部体色都为黄色，吐丝结茧后蛾区1号都为金黄色茧、蛾区3号都为黄色茧，表明这2个蛾区的蚕卵孵化后幼虫具有吐黄色丝结黄茧的能力；将蛾区2号、4号至100号的98个蛾区各取10-20粒卵集中孵化后饲养，5龄幼虫腹部体色为黄色和无色两种，所结蚕茧为深绿色茧、淡绿色茧和白色茧几种茧色，但没有黄色茧，表明本发明所述鉴别家蚕吐丝颜色的方法准确率为100%。通过本发明所述方法可以将不具有吐黄色丝结黄茧的能力的蛾区2号、4号至100号的98个蛾区销毁，极大的减少了育种过程中的饲养工作量。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的方法，其特征在于，

提取待测家蚕蚕卵的基因组DNA，用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增反应，琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，判断家蚕吐丝颜色；

若同时具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或者仅具有一条SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，则家蚕吐黄色茧丝；

若仅具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，则家蚕吐绿色茧丝或者白色茧丝。

2.一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的试剂盒，其特征在于，包括具有SEQID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物。

3.一种在蚕卵期鉴定家蚕吐丝颜色的DNA分子组，其特征在于，由具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA分子和具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA分子组成。