CN1884519A

CN1884519A - 一种提高大豆抗虫性的转基因方法

Info

Publication number: CN1884519A
Application number: CNA2006100855927A
Authority: CN
Inventors: 喻德跃; 张曼; 孙海燕; 阚贵珍; 王慧
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2006-06-26
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2026-06-26
Also published as: CN100451113C

Abstract

本发明为一种提高大豆抗虫性的转基因方法，属于大豆转基因育种方法，是将吡喃酮合酶基因g2ps1利用花粉管通道法转入大豆，对转基因植株苗期进行卡那霉素鉴定，筛选出抗卡那植株，进一步进行PCR鉴定及RT－PCR鉴定，并结合室内喂养斜纹夜蛾的抗虫性鉴定，选育出转基因抗虫大豆材料，养虫结果表明两个转基因材料喂养的幼虫重及蛹重与对照喂养的之间都存在显著差异(显著水平P＞P0.05)，说明与对照相比，转基因材料能明显抑制斜纹夜蛾的生长发育。

Description

一种提高大豆抗虫性的转基因方法

一、技术领域

本发明----一种提高大豆抗虫性的转基因方法，属于大豆转基因育种方法。

二、技术背景

大豆富含蛋白质和油脂，是人们重要的蛋白质和食油来源，也是重要的工业原料，有着悠久的种植历史，同时各种病虫害的危害也一直困扰着人们。其中大豆食叶性害虫是我国大豆生产的主要害虫，我国各大豆产区均有大豆食叶性害虫危害，尤其南方和黄淮大豆区。1990年豆天蛾在河南新乡暴发(刘珍，1991)；1992-1993年棉铃虫在华北大发生；1966年沛县大造桥虫暴发；1989年沿河地区大造桥虫重发；1992年和1993年豆卷叶螟暴发；1994和1998年斜纹夜蛾发生量较大。仅2001、2002两年黑河市三个县大豆受害面积达80余万亩，其中减产三成以上的就达40万亩(张道明等，2002)。迄今已明确了南京地区大豆食叶性害虫有来自21个科的49个种，其中斜纹夜蛾，大豆造桥虫，豆卷叶螟是最重要的虫种。大豆食叶性害虫常常成为大豆高产稳产的限制因素之一。因此，选育高抗虫害的品种显得尤为重要。

培育抗虫大豆品种有以下两种途径：

一是应用传统技术。即从现有大豆资源(包括应用物理或化学诱变技术获得的新资源)中广泛筛选，获得抗虫材料，并用杂交、回交等技术进行转育，从而培育新品种。可是传统育种技术由于抗源缺乏、育种周期长等原因不能满足农业生产选育抗病虫品种的要求。因此，生产上不得不大量使用农药，造成环境污染、生态平衡破坏、病虫害加剧的恶性循环。

二是利用基因工程技术。用基因工程手段将抗虫基因导入农作物细胞中并使其稳定表达和遗传，从而培育抗虫农作物新品种已经成为现代农业和作物育种发展的方向。在大豆上转移目的基因的研究，人们主要是应用农杆菌介导或基因枪法，但由于大豆的组织培养一直是一个难以突破的问题，所以在大豆上利用农杆菌介导或基因枪法转基因，很难得到再生植株，而利用花粉管通道法转基因则可直接转化大豆的受精卵或合子获得转基因种子，容易由种子获得再生植株，克服组织培养这一难关。但利用花粉管通道法将目的基因转入大豆研究，在国内外的文献中未见很多的报道。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是一种提高大豆抗虫性的转基因方法，通过基因工程技术引入外源基因，快速培育抗虫大豆新品系(种)，有效防治大豆虫害、保护环境、提高我国大豆品质和产量及其市场竞争力。

技术方案

本发明----一种提高大豆抗虫性的转基因方法，包括：

1)以包含有吡喃酮合酶基因g2ps1的农杆菌phtt376，利用花粉管通道法转化大豆波高、南农73-935。

2)从T1代开始，对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将抗卡那植株进一步做PCR鉴定，PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl2，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl，PCR扩增反应条件：预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min，选择PCR鉴定结果为阳性的材料；

3)T2代仍然对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将卡那抗性植株做PCR鉴定，PCR扩增体系同上，选择PCR鉴定结果为阳性的材料。再以此材料进一步做RT-PCR鉴定，大豆总RNA采用‘天为时代公司植物RNA提取试剂盒’提取，PCR扩增体系同上，选择RT-PCR鉴定结果为阳性的材料；

4)对T2代转基因材料进行室内喂养斜纹夜蛾的抗性鉴定实验，抗虫性鉴定采用室内饲喂法。于大豆开花期，采摘植株上完全展开叶，养虫容器为大号一次性有盖塑料杯，每杯接种1日龄斜纹夜蛾幼虫6头，重复三次，采集各材料的叶片(转基因植株和对照植株)喂养，28C，光照14h/d，每天更换新鲜叶片两次。喂养至第十天时称每杯幼虫重。同时观察斜纹夜蛾生长状况，第十天时对照植株喂养的斜纹夜蛾长至5龄，转基因植株喂养的斜纹夜蛾长至4龄，称重后每天记录幼虫化蛹情况，待每杯幼虫完全化蛹后第四天称蛹重。将幼虫重及蛹重两组数据进行方差分析。以此作为评价转g2ps1基因大豆的抗性指标。两个转基因材料波高、南农73-935喂养的幼虫重及蛹重与对照喂养的之间都存在显著差异，显著水平P＞0.05，该材料即为获得的通过抗性鉴定的转基因材料。

有益效果

与传统的技术相比较，本发明所提供的一种提高大豆抗虫性的转基因方法，具有如下优点：

本发明提供的方法选育了抗虫转基因大豆材料，转基因材料喂养的幼虫重及蛹重与对照喂养的之间都存在显著差异(显著水平P＞P0.05)，说明转基因材料能明显抑制斜纹夜蛾的生长发育。利用本方法可显著提高抗虫性大豆的育种效率。

四、附图说明

图1：转基因大豆T1代的g2ps1基因PCR扩增图

M：标准分子量；P：阳性对照；C：阴性对照；H：空白对照1-6：转基因植株

图2：转基因大豆T2代的g2ps1基因PCR扩增图

M：标准分子量；P：阳性对照；C：阴性对照；1-13：转基因植株箭头所示为目的条带

图3：转基因大豆T2代g2ps1基因的RT-PCR扩增图

CK：对照；M：标准分子量；C：阴性对照T：转基因植株箭头所示为目的条带

图4：品种波高喂养第十天斜纹夜蛾幼虫生长状况对比图

CK：对照波高品种喂养 TG：转基因波高植株喂养

图5：品种波高喂养的斜纹夜蛾幼虫化蛹对比图

CK：对照波高品种喂养 TG：转基因波高植株喂养

五、具体实施方式

1)以包含有吡喃酮合酶基因g2ps1的农杆菌phtt376(Stefan Eckermann et al，1998，Nature 396：p387～390)，利用花粉管通道法转化大豆品种波高和南农73-935(大豆品种波高和南农73-935均为公知公用品种，国家大豆改良中心(南京)对外销售)。

2)从T1代开始，对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，对抗卡那霉素植株进一步进行PCR鉴定，PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl2，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl，PCR扩增反应条件：预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min，选择PCR鉴定结果为阳性的材料(图1)。

3)T2代仍然对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将卡那抗性植株做PCR鉴定，PCR扩增体系同上，选择PCR鉴定结果为阳性的材料(图2)，再以此材料进一步做RT-PCR鉴定，大豆总RNA提取采用北京天为时代科技有限公司的‘RNApure无毒性RNA提取试剂盒’，PCR扩增体系同上，选择RT-PCR鉴定结果为阳性的材料(图3)。

4)T2代转基因材料采用室内喂养法鉴定转基因材料对斜纹夜蛾(购于江苏省农科院植保所)的抗性，喂养至第十天时称每杯幼虫重(图4)。同时观察斜纹夜蛾生长状况，第十天时对照植株喂养的斜纹夜蛾长至5龄，转基因植株喂养的斜纹夜蛾长至4龄，称重后每天记录幼虫化蛹情况，待每杯幼虫完全化蛹后第四天称蛹重(图5)。将幼虫重及蛹重两组数据进行方差分析，两个转基因材料波高、南农73-935喂养的幼虫重及蛹重与对照喂养的之间都存在显著差异，显著水平P＞P0.05，该材料即为获得的通过抗性鉴定的转基因材料。

具体方法如下：

1.花粉管通道法转化大豆

在7-8月份大豆盛花期，早晨6时左右选择植株中上部未开放的花蕾(此时花冠颜色较鲜亮，花冠与花萼等高或花冠高于花萼1mm)，将写好的纸牌挂到花梗部，并将同一位置多余的花去掉。下午3:00以后进行花粉管通道导入。左手夹住花柄靠花的底端(不去花瓣)，并用右手中的剪刀轻轻地划开龙骨瓣，将大豆花的柱头适量的剪掉，既保证花粉管存在，又保证随后的液滴能顺花粉管进入子房。用微量注射器对准剪去的柱头，注射质粒DNA溶液(冰盒存放)，待第一次滴的缓冲液挥发干后(约10分钟)，再滴第二次，每次注射10μl左右。

2.苗床筛选

苗期初步筛选用卡那霉素抗性鉴定。方法是将脱脂棉撕成小条沾取400ppm的卡那霉素溶液，粘附于大豆两片真叶上，采用同受体材料相同的空白对照，进行涂抹。3天后所有沾有卡那霉素溶液的不含有外源基因的大豆叶片均出现明显的黄色斑块，而转入外源基因的叶片仍为正常绿色，无任何症状。经苗床初步筛选后获得卡那抗性的大豆苗，挂牌重点观察记录，常规大田正常生产管理。并进行PCR分子标记检测。

3.大豆DNA的提取及纯化

CTAB法提取大豆DNA：

1)将1g冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。磨好的叶片倒入50ml离心管中，加入CTAB的提取液[缓冲液的组成：CTAB 2％(W/V)，Tris-HCl 0.1M，EDTA(pH8.0)0.05M，NaCl 1.0M]，每10min搅拌一次，8000rpm/min离心，将上清转移到新管。

2)加入等体积的氯仿抽提，低温在摇床上摇动一个小时，并将上清转移至新管，用等体积的异丙醇沉淀DNA，在室温下放置10-20min。

3)将DNA用小棒挑出，在70％酒精中洗涤1小时，离心，弃酒精，并在干净的超净工作台上吹干。用10ml HS-TE溶液溶解沉淀，加适量10mg/ml RNase过夜。

4)用PH 7.0饱和酚抽提一次、氯仿抽提两次，将上清用2V纯酒精沉淀，摇匀后-20℃放置30min，将DNA用小棒挑出，在70％酒精中洗涤1小时，离心，弃酒精，并在干净的超净工作台上吹干。用适量的TE缓冲溶液溶解沉淀，溶解后的DNA经紫外光谱测定A260/230与A260/280，符合DNA扩增要求后分装保存。

4.质粒DNA的大量提取及纯化

质粒DNA的大量提取及纯化参照萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，2002，分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社。具体如下：

1)配制1000mlLB培养基(Tryptone 10g，Yeast extract 5g，Nacl 10g，用10M NaOH调至pH7.0，加蒸馏水至1000ml，)，每200mlLB平均分装于500ml的三角瓶中，高压自动灭菌锅灭菌。

2)等灭菌的培养基冷却后在超净工作台上加氨苄至终浓度为100ppm。然后于每瓶中加1ml含目的基因的大肠杆菌预培养物(先挑取在LB固体培养基上培养的已含目的基因大肠杆菌单菌落，于液体LB中37℃，震荡培养至对数生长期)，振荡培养(200次/min)12h。

3)将培养物转入500ml的离心瓶中，4000rpm/min，倒去上清，将沉淀在底部的菌落分装到50ml离心管中。

4)离心管中加5ml溶液I[50mM Glucose，25mM Tris-HCL(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)，高压灭菌，4℃储存备用]，重悬沉淀，充分振荡以溶解沉淀。

5)加10ml新配制的溶液II[0.2M NaOH，1％SDS]，盖紧管盖，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内溶物，冰浴10-20min。

6)加7.5ml用冰预冷的溶液III[100ml中含3M乙酸钾，11.5ml冰乙酸]，盖紧管盖，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10-20min，这时应有白色沉淀。

7)8000rpm/min，4℃离心20min，用4层灭过菌的纱布把上清液过滤到一50ml离心管中，加0.6V的异丙醇，充分混匀，室温放置10-20min，4500rpm/min于室温离心20min回收质粒DNA。

8)小心倒掉上清，敞开管口倒置离心管使上清流尽，用70％乙醇洗涤沉淀和管壁。倒出70％乙醇，并将离心管倒置在超净工作台上的干净纸巾上，以使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。用4mlTE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM Na₂-EDTA(pH8.0)]溶解沉淀，并加10mg/ml RNase至终浓度20ug/ml，过夜。

9)将上述核酸溶液用等体积的碱性饱和酚抽提一次，氯仿抽提两次。4℃，8000rpm/min离心10min，至中间分层中无白色蛋白质。将上清吸到另一只新的离心管，用2V无水乙醇和0.1V NaCl(2M)沉淀，摇匀后-20℃放置2个小时。小心倒掉上清，敞开管口倒置离心管使上清流尽，用70％乙醇洗涤沉淀和管壁。倒出乙醇，并将离心管倒置在超净工作台上的干净纸巾上，以使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。用2mlTE缓冲液溶解沉淀。1.0％琼脂糖电泳检测提取的质粒DNA的质量并估计浓度，溶解后的DNA经紫外光谱测定A260/230与A260/280，符合作为外源DNA导入要求的质量后分装保存。

5.PCR检测

PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl₂，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl。PCR扩增反应条件：预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min。扩增后1％EB琼脂糖凝胶电泳或8％SDS-PAGE聚丙烯酰胺胶检测，结果在转基因大豆中能够扩增出特异条带(分子量为：g2ps1，～1209bp)，而对照中则没有。如图1，图2。

6.RT-PGR检测

大豆总RNA提取采用‘天为时代植物总RNA提取’试剂盒，方法如下：

1)取50-100mg新鲜组织或30mg干重组织，加900μl裂解液RA，在研钵中充分研磨。

2)取出研磨好的匀浆液，转入离心管中，加300μl溶液RB，颠倒离心管数次，混合均匀，放置于冰上5分钟。

3)12,000×g室温离心3分钟，将上清液转入新离心管，加入600μl无水乙醇混匀。取吸附柱CR加入离心管中，将得到的溶液和沉淀分两次转入吸附柱CR。12,000×g离心30秒，弃掉收集管中的废液。

4)加0.7ml漂洗液RW，12,000×g离心30秒，弃废液。

5)加0.5ml漂洗液RW，12,000×g离心30秒，弃废液。

6)将吸附柱放回收集管中，12,000×g离心2分钟，尽量除去漂洗液。

7)将吸附柱转入一个新离心管中，加50-200μl RNase-free水，室温放置2分钟，12,000×g离心2分钟。

8)如果RNA预期得率大于20μg，可重复上步操作一次，合并两次得到得溶液。

PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl₂，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl。PCR扩增反应条件：预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min。扩增后8％SDS-PAGE聚丙烯酰胺胶检测，结果在转基因大豆中能够扩增出特异条带(分子量为：g2ps1，～1209bp)，而对照中则没有。如图3。

7.转基因植株的抗虫性鉴定

抗虫性鉴定采用室内饲喂法：

大豆温室种植，于开花期，采摘植株上完全展开叶，并力求同一部位以保证叶片鲜嫩程度的一致性。叶片采摘后，为避免受强日照或高温的影响而萎蔫，应立即用封口袋装好，放入冰盒内。养虫容器为大号一次性有盖塑料杯，杯盖用针钻出多个小孔，以保证透气。每杯接种1日龄斜纹夜蛾幼虫6头，重复三次，采集各材料的叶片(转基因植株和对照植株)喂养，28℃，光照14h/d，每天更换新鲜叶片两次。

室内喂养斜纹夜蛾至第十天时称每杯幼虫重，同时观察斜纹夜蛾生长状况，第十天时对照植株喂养的斜纹夜蛾长至5龄，而转基因植株喂养的斜纹夜蛾仅长至4龄，见图4。称重后每天记录幼虫化蛹情况，待每杯幼虫完全化蛹后第四天称蛹重，记录所有幼虫化蛹天数，转基因植株喂养的幼虫化蛹时间明显较对照滞后，而且两者蛹个体大小也有明显差异，见图5。方差分析幼虫重及蛹重两组数据，结果表明，两个转基因材料波高、南农73-935喂养的幼虫重及蛹重与对照喂养的之间都存在显著差异(显著水平P＞P0.05)。说明与对照相比，转基因材料能明显抑制斜纹夜蛾的生长发育。

Claims

1、一种提高大豆抗虫性的转基因方法，包括：

1)应用包含有吡喃酮合酶基因g2psl的农杆菌phtt376，利用花粉管通道法转化大豆波高、南农73-935；

2)从T1代开始，对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将抗性植株进一步做PCR鉴定，PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl2，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl，PCR扩增反应条件：预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min，选择PCR鉴定结果为阳性的材料；

3)T2代仍然对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将卡那抗性植株做PCR鉴定，PCR扩增体系同上，选择PCR鉴定结果为阳性的材料；再以此材料进一步做RT-PCR鉴定，大豆总RNA采用‘天为时代公司植物总RNA提取试剂盒’提取，PCR扩增体系同上，选择RT-PCR鉴定结果为阳性的材料；

4)对T2代转基因材料进行室内喂养斜纹夜蛾的抗性虫鉴定：于大豆开花期，采摘植株上完全展开叶，养虫容器为大号一次性有盖塑料杯，每杯接种1日龄斜纹夜蛾幼虫6头，重复三次，采集转基因植株和对照植株各材料的叶片喂养，28℃，光照14h/d，每天更换新鲜叶片两次；喂养至第十天时称每杯幼虫重；同时观察斜纹夜蛾生长状况，第十天时对照植株喂养的斜纹夜蛾长至5龄，而转基因植株喂养的斜纹夜蛾长至4龄，称重后每天记录幼虫化蛹情况，待每杯幼虫完全化蛹后第四天称蛹重；将幼虫重及蛹重两组数据进行方差分析，两个转基因材料波高、南农73-935喂养的幼虫重及蛹重与对照喂养的之间都存在显著差异，显著水平P＞0.05，该材料即为获得的通过抗性鉴定的转基因材料。