CN102807526B - 组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a及其差向异构体的制备方法与应用 - Google Patents

组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a及其差向异构体的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种药物技术领域的组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a及其差向异构体ZYJ-D08ae，其制备方法及在抗肿瘤方面的医药用途。ZYJ-D08a及其差向异构体ZYJ-D08ae具有式(I)结构。？

Description

组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a及其差向异构体的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a及其差向异构体ZYJ-D08ae的制备方法和在抗肿瘤治疗方面的用途，属于药物技术领域。
背景技术
最早发现的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一类锌离子依赖性水解酶，该酶的主要功能是水解掉组蛋白核小体N末端赖氨酸残基ε-氨基上的乙酰基。去乙酰化的组蛋白正电荷密度增加，这导致其与负电性的DNA结合更加紧密，阻碍了各种转录因子与DNA的结合，最终抑制各种基因的转录（参见Christian,A.H.,etal.Curr.Opin.Chem.Biol.,1997,1,300;Kouzarides,T.,Curr.Opin.Genet.Dev.,1999,9,40;Wolffe,A.P.Sci.Washington,1996,272,371）。此外，HDACs引起的组蛋白去乙酰化还与其它基因组功能密切相关，如：染色质装配，DNA修复和重组等（参见Polo,S.E.,etal.CancerLett.,2005,220,1;Vidanes,G.M.,etal.Cell,2005,121,973）。
近年来，HDACs研究的深入进行极大扩充了HDACs的家族成员。目前，HDACs家族至少包括18个亚型成员（参见Gregoretti,I.V.,etal.J.Mol.Biol.,2004,338,17.;AnnemiekeJ.M.,etal.Biochem.J.,2003,370,737）。根据这些成员间的功能、定位和同源性差异，可将其分为4个亚族：HDACsI，HDACsII，HDACsIII和HDACsIV。其中HDACsI亚族（HDAC1，HDAC2，HDAC3和HDAC8），HDACsII亚族（HDAC4，HDAC5，HDAC6，HDAC7，HDAC9和HDAC10）以及HDACsIV家族（即HDAC11）属于锌离子依赖性金属蛋白酶，所有锌离子依赖性HDACs成员的催化活性位点同源性较高，这种同源性在各亚族内部成员间更明显；而HDACsIII亚族（包括Sir1-Sir7）则依赖NAD+发挥作用。随着HDACs家族成员的扩充，越来越多的非组蛋白被证实为HDACs的底物，如：转录因子，细胞骨架蛋白（microtubule），分子伴侣（HSP90）和核转运因子等（参见Glozak,M.A.,etal.Gene,2005,363,15）。
HDACs底物的多样性决定了其功能的复杂性，因此，HDACs的功能失调会引起许多疾病，包括癌症，神经变性疾病，病毒感染，炎症，白血病，疟疾和糖尿病等，其中癌症无疑是人类生命健康的头号杀手。研究表明，组蛋白H4的过度去乙酰化在癌症发生早期即会出现，成为癌症发生的一个显著标志（参见Fraga,M.F.,etal.NatureGenet.,2005,37,391）。此外，HDACsI亚族和HDACsII亚族，尤其是HDACsI亚族的过度表达在许多癌症病例中都有发现（参见Witt,O.,etal.CancerLetter.,2009,277,8）。
HDACs在癌症的发生发展过程中主要起以下几方面的作用：促进癌细胞增殖和侵袭迁移；促进癌组织新生血管生成；增强癌细胞对化疗药物的耐药性；抑制癌细胞分化和凋亡等（参见Witt,O.,etal.CancerLetter.,2009,277,8）。因此，以HDACs为靶点设计抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的热点之一。
我们根据组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药效团模型，首先设计合成了一系列酪氨酸衍生物类组蛋白去乙酰化酶抑制剂（参见Bioorg.Med.Chem.,2010,18,1761-1772），并申请了相关专利（公开号为CN101723896A）对具有通式（II）结构的化合物进行保护。在此基础上，我们对式（II）中的R2基团进行进一步的结构多样性研究，又发现了一系列活性更好的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（参见J.Med.Chem.,2011,54,2823-2838），其中如式（III）所示的化合物ZYJ-D08显示了有一定开发前景的体内抗癌活性。为了进一步改善ZYJ-D08可能存在的对胃酸不稳定的问题，我们对其结构进行了进一步的改造，得到了具有式(IV)结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a和ZYJ-D08ae，这两个化合物均显示了较强的组蛋白去乙酰化酶抑制活性和体内外抗癌活性，有望成为一类新型的抗肿瘤药物。
(II)
(III)
(IV)
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供新的组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-D08a及其差向异构体ZYJ-D08ae的制备方法和其在抗肿瘤治疗方面的应用。
本发明公开两种新的化合物ZYJ-D08a及其差向异构体ZYJ-D08ae，结构如式(IV)，化学名分别为(S)-2-((2S,3S)-2-(3,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲基正戊酰基)-7-(2-(羟胺)-2-羰基乙氧基)-N-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-酰胺和(S)-2-((2R,3S)-2-(3,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲基正戊酰基)-7-(2-(羟胺)-2-羰基乙氧基)-N-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-酰胺。该两个化合物是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，实验证明它们对嫁接于裸鼠体内的人乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞HCT116具有显著生长抑制效果，有望成为一类新型的抗肿瘤药物。
(IV)
所述化合物的制备方法，反应步骤及反应式如下：
合成路线1：以光学纯的3，5-二碘-L-酪氨酸为原料，相继经Pictet-Spengler环合，保护仲胺基，氢化还原脱碘，多肽缩合连接对甲氧基苯胺基团，与溴乙酸甲酯亲核反应，脱掉叔丁氧羰基保护基得到关键中间体7；以光学纯的L-异亮氨酸（L-ile）为原料，经伯胺基保护得到中间体8；中间体7和8经过缩合，脱保护，N-酰基化，最后做成异羟肟酸得到ZYJ-D08a。反应式如下：
合成路线1：
合成路线2方法与路线1相似，不同之处在于用光学纯的D-别异亮氨酸（D-aile）取代L-异亮氨酸（L-ile）为原料，经过相同的反应得到ZYJ-D08a的差向异构体ZYJ-D08ae。反应式如下：
合成路线2：
上述合成路线1和2反应式中的试剂：(a)多聚甲醛，37%盐酸，乙二醇二甲醚，72-75℃，反应18小时；(b)碳酸二叔丁酯，1mol/L氢氧化钠溶液，四氢呋喃；(c)10%钯碳，氢气，甲醇；(d)对甲氧基苯胺，二环己基碳二亚胺，1-羟基苯并三氮唑，无水四氢呋喃；(e)溴乙酸甲酯，碳酸钾，无水N,N-二甲基甲酰胺；(f)三氟乙酸，二氯甲烷，无水碳酸钾；(g)O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯，三乙胺，四氢呋喃；(h)1)三氟乙酸，二氯甲烷，无水碳酸钾；2)3,3-二甲基丁酸，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯，三乙胺，四氢呋喃；(i)羟胺钾，无水甲醇。
附图说明
附图1裸鼠体内人乳腺癌MDA-MB-231生长曲线。
附图2裸鼠体内人结肠癌HCT116生长曲线。
具体实施方式
以ZYJ-D08a为例：
1)(S)-7-羟基-6，8-二碘-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸盐酸盐2
向250mL浓盐酸中加入3，5-二碘-L-酪氨酸(1，30.0g，69.3mmol)，乙二醇二甲醚(20mL)和多聚甲醛(7.8g，260.0mmol)，并逐渐升温至72℃。0.5小时后，再加入浓盐酸(50mL)，乙二醇二甲醚(10mL)和多聚甲醛(5.2g，173.3mmol)，油浴控温在72-75℃继续反应18小时。反应混悬液冰浴冷却并过滤，滤饼用乙二醇二甲醚洗涤，干燥后得19.41g白色粉末2。产率：58%，ESI-MSm/z：446.2[M+H+]，1H-NMR(DMSO-d 6)δ3.07(dd,J=16.8Hz,10.8Hz,1H),3.22(dd,J=16.8Hz,4.8Hz,1H),4.02(d,J=16.2Hz,1H),4.15(d,J=16.2Hz,1H),4.32(dd,J=4.8Hz,10.8Hz,1H),7.73(s,1H),9.68(s,1H),10.00(brs,2H),14.17(brs,1H)。
叔丁氧羰基-7-羟基-6，8-二碘-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸3
化合物2(4.81g,10.0mmol)溶于22mL1mol/L的氢氧化钠溶液中，并加入5mL碳酸二叔丁酯(2.40g,11.0mmol)的四氢呋喃溶液。反应过程中用1mol/L的氢氧化钠溶液控制反应液pH在9-11。室温反应6小时后，蒸除反应液中的四氢呋喃，再用石油醚将反应液萃取3次，并用1mol/L的柠檬酸溶液酸化至pH4-5，然后用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得4.99g浅黄色粉末3。产率：92%，1H-NMR(DMSO-d 6)δ1.34+1.40(s,9H,cis/trans),2.87-3.00(m,2H),4.13-4.41(m,2H),4.61-4.75(m,1H),7.57(s,1H),9.41(brs,1H),12.71(brs,1H)。
叔丁氧羰基-7-羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸4
化合物3(2.73g,5.0mmol)溶于30mL无水甲醇中，并向其中加入三乙胺(1.11g,11.0mmol)和10%钯碳(0.23g)。通入氢气反应5小时后，用硅藻土滤除催化剂，蒸除甲醇，加入1mol/L的柠檬酸溶液至pH4-5，然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得1.10g浅黄色粉末4。产率：75%，1H-NMR(DMSO-d 6)δ1.39+1.45(s,9H,cis/trans),2.92-3.04(m,2H),4.26-4.51(m,2H),4.57-4.82(m,1H),6.52(s,1H),6.57(d,J=8.4Hz,1H),6.97(d,J=8.4Hz,1H),9.28(s,1H),12.60(s,1H)。
叔丁氧羰基-7-羟基-3-(N-4-甲氧基苯基-酰胺基)-1，2，3，4-四氢异喹啉5
化合物4(2.93g,10.0mmol)和1-羟基苯并三氮唑(1.49g,11.0mmol)溶于40mL无水四氢呋喃中，冰浴条件下滴加二环己基碳二亚胺(2.27g,11.0mmol)的四氢呋喃溶液。30分钟后，加入对甲氧基苯胺(1.35g,11.0mmol)继续室温反应过夜。反应结束后，蒸除四氢呋喃，加入乙酸乙酯，放入冰箱中冷冻过夜使二环己基脲（DCU）充分析出，滤除二环己基脲（DCU），滤液依次用饱和碳酸钠溶液，1mol/L的盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂得到2.76g黄色粉末5a。产率：69%，ESI-MSm/z：399.2[M+H+]，1H-NMR(DMSO-d 6)δ1.30+1.45(s,9H,cis/trans),2.85-3.11(m,2H),3.70(s,3H),4.24-4.54(m,2H),4.60-4.78(m,1H),6.58-6.64(m,2H),6.85-6.88(m,2H),7.00-7.03(m,1H),7.39-7.47(m,2H),9.30(s,1H),9.82(s,1H)。
叔丁氧羰基-7-(2-(甲氧基)-2-羰基乙氧基)-3-(N-4-甲氧基苯基-酰胺基)-1，2，3，4-四氢异喹啉6
向化合物5(2.76g,6.93mmol)的40mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中加入碳酸钾粉末(1.91g,13.86mmol)和溴乙酸甲酯(2.12g,13.86mmol)，室温搅拌反应3小时后将反应液倾入300mL水中，有大量沉淀析出，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得产物粗品，该粗品用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯=3：1)得1.32g白色固体6。产率：40%，ESI-MSm/z：471.2[M+H+]，1H-NMR(DMSO-d 6)δ1.33+1.45(s,9H,cis/trans),2.91-3.14(m,2H),3.70(s,3H),3.71(s,3H),4.32-4.37(m,2H),4.54-4.65(m,1H),4.77(s,2H),6.72-6.88(m,4H),7.08-7.16(m,1H),7.39-7.46(m,2H),9.85(s,1H)。
甲氧基)-2-羰基乙氧基)-3-(N-4-甲氧基苯基-酰胺基)-1，2，3，4-四氢异喹啉7
向化合物6(1.32g,2.8mmol)的10mL二氯甲烷溶液中加入4mL三氟乙酸，反应结束后向反应液中加入饱和碳酸钠溶液至pH7-8。混合物静止分层，有机层用蒸馏水洗三次，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得产物0.88g白色固体7。产率：85%，ESI-MSm/z：371.3[M+H]+，1H-NMR(DMSO-d 6)δ2.72-2.76(m,1H),2.88-2.91(m,1H),3.52-3.55(m,1H),3.69(s,3H),3.72(s,3H),3.87-3.95(m,2H),4.74(s,2H),6.64-6.65(m,1H),6.71-6.72(m,1H),6.88(d,J=8.4Hz,2H),7.04-7.06(m,1H),7.57(d,J=8.4Hz,2H),9.75(s,1H)。
，3S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基戊酸8
L-异亮氨酸(1.31g,10.0mmol)溶于11mL1mol/L的氢氧化钠溶液中，并加入3mL碳酸二叔丁酯(2.40g,11.0mmol)的四氢呋喃溶液。反应过程中用1mol/L的氢氧化钠溶液控制反应液pH在9-11。室温反应6小时后，蒸除反应液中的四氢呋喃，再用石油醚将反应液萃取3次，并用1mol/L的柠檬酸溶液酸化至pH4-5，然后用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得2.12g白色固体8。产率：92%，ESI-MSm/z：232.2[M+H+]，1H-NMR(DMSO-d 6)δ0.83-0.86(m,6H),0.95(s,9H),1.16-1.22(m,1H),1.38-1.44(m,1H),1.72-1.78(m,1H),4.15(dd,J=8.4Hz,J=6.6Hz,1H),7.83(d,J=8.4Hz,1H),12.46(s,1H)。
叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基戊酰基)-3-((4-甲氧基苯基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氧)乙酸甲酯9
向化合物8(2.12g，9.2mmol)的40mL无水四氢呋喃溶液中，加入三乙胺(1.02g,10mmol)，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(3.24g,10mmol)，室温搅拌10分钟后加入化合物7(3.4g，9.2mmol)，反应过夜。反应结束后，蒸除四氢呋喃，加入乙酸乙酯，分别用用饱和碳酸钠溶液，1mol/L的盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂得到3.65g白色粉末9。产率：68%，ESI-MSm/z：584.3[M+H+]，1H-NMR(DMSO-d 6)δ0.84-0.91(m,6H),0.97(s,9H),1.09-1.15(m,1H),1.33-1.37(m,1H),1.73-1.76(m,1H),2.95-3.26(m,2H),3.69(s,3H),3.72(s,3H),4.78(s,2H),4.83(d,J=15.6Hz,1H),4.90(d,J=15.6Hz,1H),4.64-4.67(m,1H),5.14-5.16(m,1H),6.73-6.89(m,4H),7.08-7.09(m,1H),7.50-7.52(m,2H),8.14(d,J=8.4Hz,1H),9.35(s,1H)。
二甲基-丁酰基)氨基)-3-甲基戊酰基)-3-((4-甲氧基苯基)氨甲酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氧)乙酸甲酯10
向化合物9(3.65g,6.23mmol)的30mL二氯甲烷溶液中加入12mL三氟乙酸，反应结束后向反应液中加入过量三乙胺至碱性待用。
向3,3-二甲基丁酸(0.72g，6.23mmol)的10mL无水四氢呋喃溶液中，加入三乙胺(0.50g,4.93mmol)，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(1.58g,4.93mmol)，室温搅拌10分钟后，将此反应液倒入上述二氯甲烷溶液中。反应过夜后蒸除溶剂，加入乙酸乙酯，分别用用饱和碳酸钠溶液，1mol/L的盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂得到粗品，粗品用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯=1：1)得2.1g白色粉末10。产率：58%，ESI-MSm/z：582.3[M+H+]，1H-NMR(DMSO-d 6)δ0.83-0.91(m,6H),0.96(s,9H),1.09-1.15(m,1H),1.33-1.37(m,1H),1.73-1.76(m,1H),2.01-2.05(m,1H),2.16-2.20(m,1H),2.95-3.22(m,2H),3.69(s,3H),3.71(s,3H),4.77(s,2H),4.83(d,J=15.6Hz,1H),4.90(d,J=15.6Hz,1H),4.64-4.68(m,1H),5.14-5.17(m,1H),6.74-6.89(m,4H),7.08-7.10(m,1H),7.50-7.52(m,2H),8.14(d,J=8.4Hz,1H),9.34(s,1H)。
二甲基丁酰胺)-3-甲基戊酰基)-7-(2-(羟胺)-2-氧乙氧基)-N-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧基酰胺ZYJ-D08a
羟胺钾（NH2OK）溶液的制备：14mL氢氧化钾的饱和无水甲醇溶液滴加到24mL含有4.67g(67mmol)盐酸羟胺的无水甲醇溶液中，控制内温低于40℃，滴加完毕，冷却反应液，滤除白色氯化钾沉淀，所得滤液密闭保存备用。
化合物10(2.1g,3.61mmol)溶于30mL无水甲醇后，向其中加入6mL上述羟胺钾（NH2OK）溶液。0.5小时后，蒸除甲醇，2mol/L的盐酸溶液酸化至pH3-4，然后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层后用饱和食盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得粗品，粗品用乙醇重结晶得0.95g白色粉末ZYJ-D08a。产率：45%，mp:123-125°C；1H-NMR(DMSO-d 6)δ0.87(t,J=7.2Hz,3H),0.92(d,J=6.0Hz,3H),0.97(s,9H),1.09-1.15(m,1H),1.33-1.37(m,1H),1.73-1.76(m,1H),2.03(d,J=12.6Hz,1H),2.18(d,J=12.6Hz,1H),2.95-2.99(m,1H),3.21-3.26(m,1H),3.69(s,3H),4.42(s,2H),4.83(d,J=15.6Hz,1H),4.90(d,J=15.6Hz,1H),4.64-4.67(m,1H),5.14-5.16(m,1H),6.73-6.89(m,4H),7.08-7.09(m,1H),7.50-7.52(m,2H),8.14(d,J=8.4Hz,1H),8.98(s,1H),9.35(s,1H),10.83(s,1H)；HRMS(AP-ESI)m/zcalcdforC31H43N4O7[M+H]+583.3132,found583.3165。
的差向异构体ZYJ-D08ae的合成方法与ZYJ-D08a类似，不同之处在于用光学纯的D-别异亮氨酸（D-aile）取代L-异亮氨酸（L-ile）为原料进行反应。ZYJ-D08ae的mp:116-118°C；1H-NMR(DMSO-d 6)δ0.85(t,J=7.2Hz,3H),0.90(s,9H),0.93(d,J=6.6Hz,3H),1.15-1.20(m,1H),1.54-1.57(m,1H),1.74-1.90(m,1H),1.96(d,J=12.6Hz,1H),2.04(d,J=12.6Hz,1H),2.92-3.06(m,(m,2H),3.70(s,3H),4.43(s,2H),4.70(d,J=15.6Hz,1H),4.74-4.77(m,1H),4.92-4.94(m,1H),5.15(d,J=15.6Hz,1H),6.74-6.91(m,4H),7.11-7.14(m,1H),7.40-7.41(m,2H),8.01(d,J=8.4Hz,1H),8.96(s,1H),9.86(s,1H),10.82(s,1H)；HRMS(AP-ESI)m/zcalcdforC31H43N4O7[M+H]+583.3132,found583.3165。
本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene,ProtectingGroupsinOrganicSynthesis.
显然，上述路线为立体选择性合成，通过上述路线还可制备得到其光学活性的类肽化合物。例如将原料3，5-二碘-L-酪氨酸换为其光学异构体(D构型)。本领域技术人员可方便地获得各种其他异构体，并可通过常规分离手段纯化，如手性盐或手性层析柱等。
本发明的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药效学作用通过体外HDACs抑酶实验、体外抗肿瘤细胞增殖实验和裸鼠体内抗人乳腺癌和抗结肠癌增殖实验来评价。具体有以下步骤：
目标化合物体外抑制组蛋白去乙酰化酶活性试验
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）活性荧光分析方法主要分两步：第一步，含一个乙酰化侧链的赖氨酸HDACs荧光底物（Boc-Lys（acetyl）-AMC），用含组蛋白去乙酰化酶（人宫颈癌Hela细胞细胞和提取物，HDAC6和HDAC8）的样本孵育，使底物脱去乙酰基，激活底物。第二步，用胰酶水解Boc-Lys-AMC，产生4-氨基-7-甲基香豆素（AMC）这一荧光基团（即发色团），在发射波长/激发波长（390nm/460nm）测定荧光强度，从而根据抑制剂组及对照组的荧光强度计算抑制率，并求算IC50值。实验结果见表1。
表1.化合物的体外抑酶试验结果
a表中数值为三次试验的平均值
SAHA商品名为Zolinza，通用名为Vorinostat，为美国食品药品监督管理局（FDA）于2006年批准上市的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
上述测试结果表明，化合物ZYJ-D08a表现出对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性优于阳性对照药Vorinostat（SAHA），具有良好的开发前景，并可作为发现新型高效组蛋白去乙酰化酶抑制剂的先导化合物。
目标化合物体外抑制细胞增殖的活性试验
化合物ZYJ-D08和ZYJ-D08ae进行体外抑制癌细胞增殖的活性试验，结果见表2。
术语说明：
MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435，HBL-100为不同株系的人乳腺癌细胞株；HCT116为人结肠癌细胞株。
SAHA：商品名为Zolinza，通用名为Vorinostat，为美国食品药品监督管理局（FDA）于2006年批准上市的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
DMSO：二甲基亚砜。
IC50：半数抑制浓度。
1.[材料]MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435，HBL-100，HCT116细胞株，四甲基偶氮唑蓝MTT，10%胎牛血清，96孔板
2.[方法]
细胞培养MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435，HBL-100，HCT116五种肿瘤细胞株都采用常规培养。实验时均用对数生长期细胞。
细胞生长检测（MTT法）MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435，HBL-100，HCT116细胞悬液均调整至1×105/ml，分别接种于96孔板(50μl/孔)，5000个细胞/孔。铺板4h后，每孔中加入50ul含不同浓度化合物的培养基，使孔中化合物终浓度分别为：1000、200、40、8、1.6、0.32ug/ml，每个浓度设三个复孔，不加细胞的孔读数时作空白，加细胞不加化合物的孔作化合物空白孔，SAHA作化合物阳性对照。于37℃，5%二氧化碳中孵育48h，每孔加入10μl0.5%的MTT染色液，继续孵育4h后，2500rpm，离心30min，然后抛弃板孔中培养基，加入二甲基亚砜，200ul/孔。酶标仪上于570nm处测定每孔的吸光度OD值，细胞生长抑制率按下式计算：
表2细胞增殖实验结果
a表中数值为三次试验的平均值。
上表测试数据表明，化合物ZYJ-D08a和ZYJ-D08ae在体外抗肿瘤细胞增殖的试验中显示出与阳性对照SAHA相当甚至更优的活性，具有良好的开发前景。
目标化合物裸鼠体内抗人乳腺癌细胞MDA-MB-231和抗人结肠癌细胞HCT116增殖活性试验
本发明对目标化合物分别进行体内抗人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性试验（结果见附图1，表3）和抗人结肠癌细胞HCT116增殖活性试验（结果见附图2，表4）。
分别采用人乳腺癌MDA-MB-231和人结肠癌细胞HCT116裸鼠异种移植性肿瘤模型,对目标化合物进行不同剂量的口服（po）或腹腔注射（ip）给药观察，并与阳性药物SAHA的抑瘤作用进行比较。
实验分组及剂量设计：
受试药物：ZYJ-D08a和ZYJ-D08ae
阳性对照：SAHA
阴性对照组：等量药物溶剂
瘤株：人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，人结肠癌细胞HCT116
动物：BALB/c-nu小鼠，♀，4～5周龄
实验过程：动物购买后，实验室平衡饲养1周，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人结肠癌细胞HCT116进行常规培养，1640培养液含10%FBS，5%CO2，37℃培养。裸鼠5~6周大时接种细胞，5×106个/只，皮下接种。接种10天后，瘤子长到接近100mm3时将裸鼠进行随机分组（每组6只）并开始给药。药物用PBS：DMSO（60：40）溶解，SAHA组，受试药物组分别按下表所示剂量和给药方式给药，DMSO对照组，给予等体积溶剂，连续口服给药一段时间。实验结束时断颈椎处死小鼠，剥离肿瘤，称瘤重，比较、计算肿瘤抑制率。t检验法比较各组动物肿瘤重量、肿瘤体积、RTV等指标的统计学差别。
阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重
肿瘤抑制率TGI（%）=————————————————
阴性对照组平均瘤重
相对肿瘤体积（relativetumourvolume，RTV）=Vt/Vo
Vt：试验结束时肿瘤体积；Vo：试验开始时肿瘤体积
抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%），
治疗组（T）RTV
T/C（%）＝——————————————————
阴性对照组（C）RTV
表3体内抗人乳腺癌MDA-MB-231实验结果
Compd 肿瘤抑制率TGI 相对肿瘤增殖率T/C
SAHA (90 mg/kg, ip) 43% 58%
SAHA (90 mg/kg, po) 43% 57%
ZYJ-D08a (90 mg/kg, ip) 51% 40%
ZYJ-D08ae (60 mg/kg, ip) 45% 62%
ZYJ-D08a (90 mg/kg, po) 66% 30%
a与阴性对照组相比，所有药物治疗组效果经t检验具有统计学意义（P<0.05）
表4体内抗人结肠癌HCT116实验结果
Compd 肿瘤抑制率TGI 相对肿瘤增殖率T/C
SAHA (90 mg/kg, po) 65% 49%
ZYJ-D08a (60 mg/kg, po) 32% 85%
ZYJ-D08a (90 mg/kg, po) 59% 53%
ZYJ-D08ae (90 mg/kg, po) 33% 64%
a与阴性对照组相比，所有药物治疗组效果经t检验具有统计学意义（P<0.05）
上述测试结果表明，ZYJ-D08a和其差向异构体ZYJ-D08ae作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有较强的体内外抗肿瘤活性，具有一定的开发应用前景。

Claims (3)

1.化合物ZYJ-D08a，化学名为(S)-2-((2S，3S)-2-(3，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲基正戊酰基)-7-(2-(羟胺)-2-羰基乙氧基)-N-(4-甲氧基苯基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-酰胺，及其差向异构体ZYJ-D08ae，化学名为(S)-2-((2R，3S)-2-(3，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲基正戊酰基)-7-(2-(羟胺)-2-羰基乙氧基)-N-(4-甲氧基苯基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-酰胺。
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
合成路线1：以光学纯的3，5-二碘-L-酪氨酸为原料，相继经Pictet-Spengler环合，保护仲胺基，氢化还原脱碘，多肽缩合连接对甲氧基苯胺基团，与溴乙酸甲酯亲核反应，脱掉叔丁氧羰基保护基得到关键中间体7：以光学纯的L-异亮氨酸(L-ile)为原料，经伯胺基保护得到中间体8：中间体7和8经过缩合，脱保护，N-酰基化，最后做成异羟肟酸得到ZYJ-D08a，
反应式如下：
合成路线1：
合成路线2：以光学纯的3，5-二碘-L-酪氨酸为原料，相继经Pictet-Spengler环合，保护仲胺基，氢化还原脱碘，多肽缩合连接对甲氧基苯胺基团，与溴乙酸甲酯亲核反应，脱掉叔丁氧羰基保护基得到关键中间体7：以光学纯的L-异亮氨酸(L-ile)为原料，经伯胺基保护得到中间体11：中间体7和11经过缩合，脱保护，N-酰基化，最后做成异羟肟酸得到ZYJ-D08ae，
反应式如下：
合成路线2：
上述两种合成路线反应式中的试剂：(a)多聚甲醛，37％盐酸，乙二醇二甲醚，72-75℃，反应18小时；(b)碳酸二叔丁酯，1mol/L氧氧化钠溶液，四氢呋喃；(c)10％钯碳，氢气，甲醇；(d)对甲氧基苯胺，二环己基碳二亚胺，1-羟基苯并三氮唑，无水四氢呋喃；(e)溴乙酸甲酯，碳酸钾，无水N，N-二甲基甲酰胺；(f)三氟乙酸，二氯甲烷，无水碳酸钾；(g)O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯，三乙胺，四氢呋喃；(h)1)三氟乙酸，二氯甲烷，无水碳酸钾；2)3，3-二甲基丁酸，O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯，三乙胺，四氢呋喃；(i)羟胺钾，无水甲醇。
3.权利要求1所述的化合物在制备预防或治疗与组蛋白去乙酰化酶活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物中的应用；所述的与组蛋白去乙酰化酶活性异常表达的相关哺乳动物疾病选自：癌症，神经变性疾病，病毒感染，炎症，疟疾和糖尿病。
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