CN108409698B - Rt/pr双靶点hiv抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了RT/PR双靶点HIV抑制剂及其制备方法和应用。该RT/PR双靶点HIV抑制剂由式1所示的化合物或其药学上可接受的盐制备。式1所示的化合物具有明显的抑制HIV逆转录酶和抑制HIV蛋白酶的活性；毒性研究显示其具有良好的成药性，表明该类化合物作为抗艾滋病药物具有良好的应用前景。

Description

RT/PR双靶点HIV抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药领域中RT/PR双靶点HIV抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)，又称艾滋病，是人类因感染免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)而导致免疫缺陷，并引发一系列机会性感染及肿瘤的综合征。AIDS是全世界面临的严峻问题，我国整体上属于HIV-1低流行国家，但局部地区呈高发流行。截至2015年10月底，全国报告存活的艾滋病病毒感染者和病人共计57.5万例，死亡17.7万人，因此研发新型的抗HIV药物是治疗艾滋病的根本途径。自1987年齐多夫定(zidovudine,AZT)作为首个被批准正式用于临床AIDS治疗药物以来，目前已有三十余种抗AIDS药物应用于临床，其中包括1种侵入抑制剂、15种逆转录酶(RT)抑制剂、10种蛋白酶(PR)抑制剂、1种整合酶抑制剂、1种融合抑制剂，以及5种复合剂等。长期应用单靶点药物容易引起交叉耐药及严重的毒副作用，目前临床上多采用鸡尾酒疗法(HAART)，在一定程度上能够缓解耐药性，然而这种疗法剂量大、毒副作用强、药物相互作用复杂、患者依从性差，因此国内外制药公司致力于研究复合制剂，然而依然存在交叉耐药及严重的毒副作用、药代性质复杂等问题。以上面临的严峻形势迫使人们不断探索寻找新颖的抗HIV药物。
多靶点药物设计(multitarget-directed ligands,MT-DLs)由于其均一的药动学性质、降低药物相互作用和提高治疗效果等优势，已成为当前药物设计的前沿领域，为许多疑难疾病的治疗带来了新的希望[展鹏，李潇，康东伟，刘新泳.抗艾滋病药物设计新策略：多靶点及多价态结合配体[J].中国药物化学杂志，2013,3(5)，406-415.]。
自1995年Saquinavir(SQV)被FDA批准上市以来，已有10个HIV-1蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors，PIs)被应用于临床。2006年上市的Darunavir(DRV)在抑制HIV-1PR的方式上与“传统”的药物不同，不仅可以与活性位点结合，同时也可以与单体肽链结合。因此，DRV在临床应用上有“传统”药物无法比拟的优势。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制HIV-1逆转录酶和/或蛋白酶的活性。
为解决以上技术问题，本发明提供了式1所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0001222668210000021
式1中，n为0或1；
R1表示对位取代的氨基、对位取代的甲氧基、对位取代的硝基、对位取代的单取代或双取代胺基、对位取代的羟甲基或3,4位取代的亚甲二氧基；
X为C、O、N或S；
Y为S或P；
M为羰基、羟基或亚胺基；
R为Ra、Rb或Rc；所述Ra为
Figure BDA0001222668210000022
所述Rb为
Figure BDA0001222668210000023
，所述Rc为
Figure BDA0001222668210000024
其中Z独立地选自O或N；L独立地选自N、C或O；R2表示氢、C1-C6烷基、卤素、C1-C6烯基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；R3表示氢、羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；R4表示氢、羟基、C1-C6烯基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基或取代的苯基；当Z为O时R5不为任何基团，当Z为N时R5为氢。
上述化合物或其药学上可接受的盐中，所述Ra中与式1中X相连的是Z、7位C(R4的邻位成环C)或3位C(R2和羰基之间的成环C原子)。
上述化合物或其药学上可接受的盐中，所述R1可为对位取代的氨基。
上述化合物或其药学上可接受的盐中，所述R4可为氢、羟基或异戊烯基。
上述化合物或其药学上可接受的盐中，所述R2可为氢或甲基。
上述化合物或其药学上可接受的盐中，所述R3可为氢、羟基或氨基。
上述化合物或其药学上可接受的盐中，式1所示的化合物具体可为化合物18、化合物1、化合物25、化合物12或化合物23；
所述化合物1是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Rb，Rb中L为N、R4为氢、R3为氢、R2为甲基、Z为O的化合物，其结构式如图2中化合物1；
所述化合物12是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中的Z与X相连，Ra中Z为N、R4为氢、R3为羟基位于7位C上、R2为氢的化合物，其结构式如图3中化合物12；
所述化合物18是式1中n＝0，X为O，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中7位C(R4的邻位成环C)与X相连，Ra中Z为O、R4为异戊烯基、R3为氢、R2为氢的化合物，其结构式如图4中化合物18；
所述化合物23是式1中n＝0，X为O，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Rc，Rc中Z为O、R4为氢、R3为氢、R2为氢的化合物，其结构式如图5中化合物23；
所述化合物25是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中3位C(R2和羰基之间的成环C原子)与X相连，Ra中Z为O、R4为氢、R3为氨基位于7位C上、R2为甲基的化合物，其结构式如图6中化合物25。
下述P1、P2或P3的产品也属于本发明的保护范围：
P1、上述Ra或Rb；
P2、药用化合物，所述药用化合物为式1所示的化合物或其药学上可接受的盐；
P3、含有式1所示的化合物或其药学上可接受的盐的HIV抑制剂。
上述产品中，HIV抑制剂以HIV蛋白酶和/或HIV逆转录酶为靶点。
上述药用化合物中，所述药用化合物可用于抑制HIV感染动物，也可用于治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征。
下述M1)或M2)的方法也属于本发明的保护范围：
M1)抑制HIV感染动物的方法，包括给受体动物施用有效量的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐以抑制HIV感染动物；
M2)治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征的方法，包括给受体动物施用有效量的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐进行治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征。
下述A1至A10中的任一应用也属于本发明的保护范围：
A1、式1所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备以HIV蛋白酶和/或HIV逆转录酶为靶点的HIV抑制剂中的应用；
A2、式1所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备HIV抑制剂中的应用；
A3、式1所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用；
A4、式1所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备HIV蛋白酶抑制剂和/或HIV逆转录酶抑制剂中的应用；
A5、上述Ra或Rb在制备以HIV逆转录酶和/或HIV蛋白酶为靶点的HIV抑制剂中的应用；
A6、上述Ra或Rb在制备HIV抑制剂中的应用；
A7、上述Ra或Rb在制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用；
A8、上述Ra或Rb在制备HIV逆转录酶抑制剂和/或HIV蛋白酶抑制剂中的应用；
A9、式1所示的化合物或其药学上可接受的盐在抑制HIV蛋白酶和/或HIV逆转录酶中的应用；
A10、式1所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用。
上文中，所述动物可为哺乳动物，如人。
本发明式1所示的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学可接受的盐的形式使用。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应来制备。
上文中，所述抑制剂和所述药物，除含有式1所示的化合物或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。更具体地说，所述抑制剂和所述药物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。
本文中，所述HIV可为HIV-1，所述获得性免疫缺陷综合征可由HIV-1引起。
本发明证明了如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐具有明显的抑制HIV逆转录酶和抑制HIV蛋白酶的活性；毒性研究显示其具有良好的成药性，表明该类化合物作为抗艾滋病药物具有良好的应用前景。实验证明，实施例3的化合物18对HIV-1逆转录酶和HIV-1蛋白酶的抑制活性均优于阳性对照药物HIV-1逆转录酶抑制剂NVP和阳性对照药物HIV-1蛋白酶抑制剂DRV,化合物18对HIV-1逆转录酶的抑制活性是NVP对HIV-1逆转录酶的抑制活性的11倍，化合物18对HIV-1蛋白酶的抑制活性是DRV对HIV-1蛋白酶的抑制活性的2倍；实施例1的化合物1和实施例5的化合物25对HIV-1逆转录酶的抑制活性优于HIV-1逆转录酶抑制剂NVP，实施例1的化合物1和实施例5的化合物25对HIV-1逆转录酶的抑制活性分别是NVP对HIV-1逆转录酶的抑制活性的26.9倍和1.2倍，并且对HIV-1蛋白酶的抑制活性分别是NVP的10000倍以上和2702倍以上；实施例2的化合物12对HIV-1蛋白酶的抑制活性优于HIV-1蛋白酶抑制剂DRV，化合物12对HIV-1蛋白酶的抑制活性是DRV对HIV-1蛋白酶的抑制活性的1.5倍，并且对HIV-1逆转录酶的抑制活性是DRV的14.6倍以上(表1)。上述化合物1、化合物12、化合物18、化合物23和化合物25均具有较低的细胞毒性(表2)。
附图说明
图1为中间体4的合成路线。
图2为化合物1的成路线。
图3为化合物12的成路线。
图4为化合物18的成路线。
图5为化合物23的成路线。
图6为化合物25的成路线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用试剂和原料无特别说明都为国药集团化学试剂有限公司产品。下述实施例中的室温是指20℃-30℃。
实施例1、2-(8-甲基-3,4-二氢-1,5-二恶-6-氧代-蒽-4-氨基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(即化合物1)的合成
化合物1的合成路线见图2，具体操作如以下所述：
1)(1S,2R)-1-苄基-2-羟基-3-(异丁胺)氨基甲酸叔丁酯(中间体2)的合成
将(S)-1-((S)-环氧乙烷-2-基)-2-苯乙氨基甲酸叔丁酯(1)(百灵威科技有限公司)(20.0g，75.94mmol)、乙腈80mL和异丁胺(19.02mL，189.46mmol)加入200mL茄形瓶中，混合物80℃搅拌5小时。反应完毕后反应液冷却至室温，减压浓缩除去溶剂。粗品用乙酸乙酯/正己烷(1:9)重结晶后得白色目标产物(21.2g，83％)，该白色目标产物即为中间体2，其结构式如图1所示。LC-MS(ESI,M+H+)m/z 337.2。
2)(1S,2R)-1-苄基-2-羟基-3-(N-异丁胺-4-甲氧基苯基磺酰胺)氨基甲酸叔丁酯(中间体3a)的合成
将中间体2(5.0g，14.86mmol)、四氢呋喃(THF)(40mL)加入250mL茄形瓶中，冰浴下缓慢加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(3.68mL，16.34mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.18g，1.49mmol)，随后加入4-甲氧基苯磺酰氯(3.38g，16.34mmol)和THF(10mL)的混合溶液。冰浴下搅拌0.5小时移至室温。TLC检测反应完毕后减压浓缩除去THF，乙酸乙酯萃取(30×3mL)，有机相浓缩。粗品经flash柱纯化乙酸乙酯-正己烷(1:5)得目标产物白色固体即中间体3a(6.14g，82％)，其结构式如图1所示。中间体3a的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 507.0。
中间体3b、3c、3e的合成与3a类似，它们的结构式如图1所示。中间体3b、3c、3e的合成与中间体3a的合成的区别仅在于将4-甲氧基苯磺酰氯分别替换为等摩尔的4-硝基苯磺酰氯、4-二乙酸酯亚甲基苯磺酰氯(百灵威科技有限公司)、3,4-亚甲二氧基苯磺酰氯(百灵威科技有限公司)。
3)N-((2R,3S)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁烷)-N-异丁基-4-甲氧基苯磺酰胺的制备(中间体4a)的合成
将中间体3a(5.0g，9.87mmol)加入100mL茄形瓶中，室温下加入CH2Cl2(10mL)和三氟乙酸(10mL)。加毕，室温反应3h。反应完毕后浓缩反应液，并加入200mL饱和碳酸氢钠溶液超声、搅拌，有固体析出，抽滤得粗品，柱层析CH2Cl2-MeOH(10:1)得目标产物白色固体即中间体4a(2.71g，68％)。中间体4a的LC-MS(ESI,M+H+)m/z407.3。
中间体4b、4c、4e的合成与4a类似，它们的结构式如图1所示。中间体4b、4c、4e的合成与中间体4a的合成的区别仅在于将中间体3a分别替换为等摩尔的中间体3b、3c和3e。
4)2-(8-甲基-3,4-二氢-1,5-二恶-6-氧代-蒽-4-氨基)-乙酸乙酯(中间体6)的合成
将图2中的8-甲基-3,4-二氢-1,5-二恶-4-氮杂-蒽-6-酮(5)(百灵威科技有限公司)(1.09g，5mmol)和无水碳酸钾(2.07g，15mmol)加入250mL茄形瓶中，加入无水溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)10mL，在氮气保护下室温剧烈搅拌一小时，然后缓慢滴加入0.6mL溴乙酸乙酯(5.25mmol)，加入完毕，继续室温搅拌反应过夜。TLC检测反应完毕，减压浓缩DMF，残留物加入10mL水，用乙酸乙酯(10×3mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经flash柱纯化(EtOAc/hexanes:1/15)得白色粉末固体即中间体6(0.81g，56.0％)，其结构式如图2所示。中间体6的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 304.7。
5)2-(8-甲基-3,4-二氢-1,5-二恶-6-氧代-蒽-4-氨基)-乙酸(中间体7)的合成
将NaOH(0.21g，5.19mmol)溶于5mL水中，加入到含有中间体6(0.5g，1.73mmol)的25mL茄形瓶中，室温搅拌反应30min，将茄形瓶置于冰浴中，在搅拌状态下用4M HCl调节pH至4.0，冰浴下搅拌30min，析出大量固体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得目标产物白色固体即中间体7(0.20g，42.0％)，其结构式如图2所示。中间体7的LC-MS(ESI,M－H－)m/z 274.3。
6)2-(8-甲基-3,4-二氢-1,5-二恶-6-氧代-蒽-4-氨基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-硝基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(中间体8)的合成
将中间体7(0.14g，0.5mmol)、中间体4b(0.21g，0.5mmol)加入10mL茄形瓶中，加入2mL无水DMF，置于冰浴中，缓慢加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(0.144g，0.75mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(0.074g，0.55mmol)，加毕转移至室温搅拌反应一小时，加入DMAP(0.012g，0.1mmol),继续搅拌反应2小时。反应完毕后减压浓缩DMF，残留物加入4mL水，用乙酸乙酯(4×3mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经flash柱纯化(EtOAc/hexanes:4/1)得白色粉末固体即中间体8(0.29g，86.0％)，其结构式如图2所示。中间体8的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 679.7。
7)终产物2-(8-甲基-3,4-二氢-1,5-二恶-6-氧代-蒽-4-氨基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(化合物1)的合成
将中间体8(0.10g，0.15mmol)溶于2mL甲醇中，加入甲酸铵(0.037g，0.60mmol),10％Pd/C(0.10g，湿度36.68％),加热回流反应一小时，趁热过滤反应液，甲醇洗涤，浓缩后采用制备薄层层析进行分离纯化(展开剂EtOAc/MeOH:4/1)，得到白色粉末固体(0.076g，78.0％)，即化合物1。化合物1是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Rb，Rb中L为N、R4为氢、R3为氢、R2为甲基、Z为O的化合物，其结构式如图2中化合物1所示。
化合物1的分析结果如下：LC-MS(ESI,M+H+)m/z 649.7。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝8.0Hz,2H),7.41(m,2H),7.28–7.26(m,3H),6.71(s,1H),6.62(d,J＝8.0Hz,2H),6.28(s,1H),6.25(s,1H),4.26(m,2H),4.20(d,J＝5.0Hz,2H),4.06–4.04(m,2H),3.78(d,J＝5.0Hz,2H),3.45(m,1H),3.20(m,1H),3.13(m,2H),2.94(dd,J＝9.5,4.5Hz,1H),2.67(dd,J＝15.0,4.5Hz,1H),2.42(s,3H),1.68–1.66(m,1H),0.92(d,J＝5.0Hz,3H),0.90(d,J＝5.0Hz,3H)。
实施例2、2-(7-羟基-2-氧代喹啉-1(2H)-基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(即化合物12)的合成
化合物12的合成路线见图3，具体操作如以下所述：
1)2-氧代-1,2-二氢喹啉-7-基-乙酸酯(中间体10)的合成
将中间体9(7-羟基-2-(1H)-喹啉酮)(1.61g,10mmol)(北京伊诺凯科技有限公司)溶于28ml醋酐中，降温至0℃，加入三氟甲磺酸铟In(OTf)3(0.28g,0.5mmol)，升至室温搅拌反应1小时。加入乙酸乙酯和10％碳酸钠水溶液，继续搅拌反应1小时，分离有机相，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，无水硫酸镁干燥，浓缩得到目标产物(即中间体10)1.83g，收率90.0％。中间体10的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 204.7。
2)2-(7-乙酰氧基-2-氧代喹啉-1(2H)-基)乙酸(中间体11)的合成
将中间体10(1.02g，5mmol)和无水碳酸钾(2.07g，15mmol)加入250mL茄形瓶中，加入无水溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)10mL，在氮气保护下室温剧烈搅拌一小时，然后缓慢滴加入0.6mL溴乙酸乙酯(5.25mmol)，加入完毕，继续室温搅拌反应过夜。过滤，用10mL水洗涤三次，合并滤液，加入0.60g氢氧化钠(15mmol)，室温搅拌反应30min，置于冰浴中，用4M HCl调节pH至4.0，冰浴下搅拌30min，析出大量固体，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得目标产物白色固体即中间体11(0.59g，45.0％)。中间体11的LC-MS(ESI,M－H－)m/z 260.3。
3)2-(7-羟基-2-氧代喹啉-1(2H)-基)乙酸(中间体12)的合成
将中间体11(0.5g，1.92mmol)溶于5mL浓盐酸中，加热至90℃反应4小时，冷却后将反应液倒入10mL冰水中，有沉淀析出，过滤，滤饼用水洗涤，石油醚重结晶，得到得目标产物白色粉末固体即中间体12(0.30g，71.4％)。中间体12的LC-MS(ESI,M－H－)m/z 218.3。
4)2-(7-羟基-2-氧代喹啉-1(2H)-基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-硝基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(中间体13)的合成
中间体13的合成参照实施例1的中间体8的合成，与中间体8的合成的区别仅在于将中间体7替换为等摩尔的中间体12，得到中间体13，收率77.0％，其结构式如图3所示。中间体13的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 623.7。
5)2-(7-羟基-2-氧代喹啉-1(2H)-基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(化合物12)的合成
化合物12的合成参照实施例1步骤7)的化合物1的合成，与化合物1的合成的区别仅在于将中间体8替换为等摩尔的中间体13，得到化合物12白色粉末固体，收率79.3％。化合物12是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中的Z与X相连，Ra中Z为N、R4为氢、R3为羟基位于7位C上、R2为氢的化合物，其结构式如图3中化合物12所示。
化合物12的分析结果如下：LC-MS(ESI,M+H+)m/z 593.7。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.43(d,J＝8.5Hz,1H),7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.40(m,2H),7.29–7.27(m,4H),7.20(d,J＝8.0Hz,1H),6.62(d,J＝8.0Hz,2H),6.60(d,J＝8.5Hz,1H),6.40(d,J＝8.0Hz,1H),4.07–4.04(m,2H),3.83(m,2H),3.45(m,1H),3.20(m,1H),3.13(m,2H),2.93(dd,J＝9.5,5.0Hz,1H),2.67(dd,J＝15.0,5.0Hz,1H),1.67–1.65(m,1H),0.92(d,J＝5.0Hz,3H),0.90(d,J＝5.0Hz,3H)。
实施例3、8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-2-氧代-2H-色满-7-基-(2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-氨基甲酸酯(即化合物18)的合成
化合物18的合成路线见图4，具体操作如以下所述：
1)7-羟基-8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-2H-色满-2-酮(中间体15)的合成
将无水三氯化铝(1.32g，10.0mmol)悬浮于20mL无水二氯甲烷中，在0℃搅拌状态下缓慢滴加10mL甲硫醚，滴加完毕，反应液变澄清。将蛇床子素(图4中14,0.98g，4.0mmol)(北京伊诺凯科技有限公司)溶于10mL无水二氯甲烷中，滴加入反应液中，10min内滴加完毕，升至室温搅拌反应24小时。用30mL1M冷的稀盐酸淬灭反应，用乙酸乙酯(40×3mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经flash柱纯化得白色粉末固体即中间体15(0.54g，59.0％)，其结构式如图4中15。中间体15的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 231.7。
2)8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-2-氧代-2H-色满-7-基-(4-硝基苯基)-碳酸酯(中间体16)的合成
将中间体15(0.30g，1.30mmol)加入茄形瓶中，加入CH2Cl23mL、吡啶(0.20mL，2.60mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(0.39g，1.95mmol)，室温反应2小时，减压浓缩除去反应溶剂，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，Flash纯化得中间体16(0.32g，63.3％)，其结构式如图4中16。中间体16的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 396.5。
3)8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-2-氧代-2H-色满-7-基-(2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-硝基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-氨基甲酸酯(中间体17)的合成
将中间体16(0.13g，0.5mmol)、中间体4b(0.21g，0.5mmol)加入10mL茄形瓶中，加入2mL乙腈，溶解后Et3N(0.2mL，1.5mmol)，室温反应一小时，减压浓缩除去溶剂，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，Flash柱纯化得中间体17(0.26g，78.0％)，其结构式如图4中17。
4)8-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-2-氧代-2H-色满-7-基-(2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-氨基甲酸酯(即化合物18)的合成
化合物18的合成参照实施例1步骤7)的化合物1的合成，与化合物1的合成的区别仅在于将中间体8替换为等摩尔的中间体17，得到化合物18，收率82.0％。
化合物18是式1中n＝0，X为O，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中7位C(R4的邻位成环C)与X相连，Ra中Z为O、R4为异戊烯基、R3为氢、R2为氢的化合物，其结构式如图4中化合物18所示。
化合物18的分析结果如下：LC-MS(ESI,M+H+)m/z 648.7。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝9.0Hz,1H),7.60(d,J＝8.0Hz,2H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(m,2H),7.29–7.27(m,3H),7.12(d,J＝8.0Hz,1H),6.60(d,J＝8.0Hz,2H),6.24(d,J＝9.0Hz,1H),5.77(m,1H),4.07–4.04(m,2H),3.44(m,1H),3.20–3.18(m,3H),3.13(m,2H),2.93(dd,J＝9.5,5.0Hz,1H),2.67(dd,J＝15.0,5.0Hz,1H),1.80(s,3H),1.71(s,3H),1.67–1.65(m,1H),0.91(d,J＝5.0Hz,6H)。
实施例4、7-氧代-7H-呋喃[3,2-g]色满-4-基-(2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-氨基甲酸酯(即化合物23)的合成
化合物23的合成路线见图5，具体操作如以下所述：
化合物23的合成参照实施例3，与实施例3的区别在于：将实施例3的中间体15替换为等摩尔的香柑醇(中间体18)(北京伊诺凯科技有限公司)，得到中间体19；将实施例3的中间体16替换为等摩尔的中间体19，得到中间体20；将实施例3的中间体17替换为等摩尔的中间体20，得到化合物23。化合物23是式1中n＝0，X为O，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Rc，Rc中Z为O、R4为氢、R3为氢、R2为氢的化合物，其结构式如图5中化合物23所示。
化合物23的分析结果如下：LC-MS(ESI,M+H+)m/z 620.5。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝8.5Hz,1H),7.62(d,J＝8.0Hz,2H),7.54(d,J＝9.0Hz,1H),7.41(m,2H),7.28–7.26(m,3H),7.01(s,1H),6.66(d,J＝9.0Hz,1H),6.62(d,J＝8.0Hz,2H),5.97(d,J＝8.5Hz,1H),4.07–4.04(m,2H),3.83(m,2H),3.45(m,1H),3.20(m,1H),3.13(m,2H),2.93(dd,J＝9.5,5.0Hz,1H),2.67(dd,J＝15.0,5.0Hz,1H),1.67–1.65(m,1H),0.92(d,J＝5.0Hz,3H),0.90(d,J＝5.0Hz,3H)。
实施例5、2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(即化合物25)的合成
化合物25的合成路线见图6，具体操作如以下所述：
1)2-(7-(叔丁基羰基)氨基-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)乙酸(中间体22)的合成
将中间体21(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)(北京伊诺凯科技有限公司)(0.70g，3.0mmol)溶于6mL二氯甲烷中，剧烈搅拌下加入N,N-二异丙基乙胺(0.55mL，3.3mmol),30min后滴加入溶于1.5mL二氯甲烷的二碳酸二叔丁酯(0.76mL，3.3mmol)，滴加完毕，室温搅拌反应2小时，有白色固体析出，过滤，用二氯甲烷洗涤，干燥，得到目标产物白色粉末固体即中间体22(0.95g，94.7％)，其结构式如图6中22。中间体22的LC-MS(ESI,M+H+)m/z334.7。
2)叔丁基-(3-(2-(((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-硝基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-4-甲基-2-氧代-2H-色满-7-基)-氨基甲酸酯(中间体23)的合成
中间体23的合成参照实施例1步骤6)，与实施例1的中间体8的合成区别仅在于将实施例1的中间体7替换为等摩尔的中间体22，得到中间体23，收率69.3％，其结构如图6中23。中间体23的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 737.7。
3)2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-硝基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(中间体24)的合成
将中间体23(0.45g，0.61mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌反应2小时，加入15mL二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠溶液(15×3mL)萃取、洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化得白色粉末固体即中间体24(0.30g，78.0％)，其结构如图6中24。中间体24的LC-MS(ESI,M+H+)m/z 636.7。
4)2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-色满-3-基)-N-((2S,3R)-3-羟基-4-(N-异丁基-4-胺基苯基磺酰胺基)-1-苯基丁烷-2-基)-乙酰胺(化合物25)的合成
化合物25的合成参照实施例1步骤7)的化合物1的合成，与化合物1的合成的区别仅在于将中间体8替换为等摩尔的中间体24，得到化合物25，收率64.5％。化合物25是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中3位C(R2和羰基之间的成环C原子)与X相连，Ra中Z为O、R4为氢、R3为氨基位于7位C上、R2为甲基的化合物，其结构式如图6中化合物25所示。
化合物25的分析结果如下：LC-MS(ESI,M+H+)m/z 607.7。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(m,2H),7.29–7.26(m,3H),6.62(d,J＝8.0Hz,2H),6.57(d,J＝8.0Hz,1H),6.40(s,1H),4.07–4.04(m,2H),3.45(m,1H),3.18(m,1H),3.13(m,2H),2.93(dd,J＝9.5,5.0Hz,1H),2.85(s,2H),2.67(dd,J＝15.0,5.0Hz,1H),2.42(s,3H),1.67–1.65(m,1H),0.92(d,J＝5.0Hz,3H),0.90(d,J＝5.0Hz,3H)。
实施例6、化合物1、12、18、23、25对HIV-1逆转录酶、蛋白酶抑制活性及细胞毒性的测定
分别以HIV-1逆转录酶抑制剂NVP(Nevirapine)、HIV-1蛋白酶抑制剂DRV(Darunavir)为阳性对照，测定了上述化合物1、12、18、23、25对HIV-1逆转录酶(RT)、蛋白酶(PR)抑制活性及细胞毒性。结果表明实施例3的化合物18对HIV-1逆转录酶和HIV-1蛋白酶的抑制活性均优于HIV-1逆转录酶抑制剂NVP和HIV-1蛋白酶抑制剂DRV,化合物18对HIV-1逆转录酶的抑制活性是NVP对HIV-1逆转录酶的抑制活性的11倍，化合物18对HIV-1蛋白酶的抑制活性是DRV对HIV-1蛋白酶的抑制活性的2倍；实施例1的化合物1和实施例5的化合物25对HIV-1逆转录酶的抑制活性优于HIV-1逆转录酶抑制剂NVP，实施例1的化合物1和实施例5的化合物25对HIV-1逆转录酶的抑制活性分别是NVP对HIV-1逆转录酶的抑制活性的26.9倍和1.2倍，并且对HIV-1蛋白酶的抑制活性分别是NVP的10000倍以上和2702倍以上；实施例2的化合物12对HIV-1蛋白酶的抑制活性优于HIV-1蛋白酶抑制剂DRV，化合物12对HIV-1蛋白酶的抑制活性是DRV对HIV-1蛋白酶的抑制活性的1.5倍，并且对HIV-1逆转录酶的抑制活性是DRV的14.6倍以上(表1)。上述化合物1、化合物12、化合物18、化合物23和化合物25均具有较低的细胞毒性(表2)。
表1.化合物1、12、18、23、25对HIV-1逆转录酶、蛋白酶的抑制活性
Figure BDA0001222668210000131
将实施例1的化合物1、实施例2的化合物12、实施例3的化合物18、实施例4的化合物23和实施例5的化合物25均用DMSO溶解，并用双蒸水进行梯度稀释得到不同浓度的溶液，作为样品，按照下述方法测定上述化合物对HIV-1逆转录酶抑制活性、对HIV-1蛋白酶抑制活性和细胞毒性。
其中，HIV-1逆转录酶抑制活性的测试方法如下：
引物为5＇-CAG CAG TAC AAA TGG CAG TAT TC-3＇，在T19位置用Cyanine 5(Cy5)标记，以3＇-TGT CGT CAT GTT TAC CGT CAT AAG TAG GTG TTA CTA GTC CGA TTT CCC CTAGTC CGA CCC ATG-5＇为模板，在T2位置用carboxytetramethylrhodamine(TMR)标记，TMR激发波长为540nm，发射波长为580nm，以FRET为供体。按照文献(Sharma K,Przybilla F,Restle T,et al.Reverse Transcriptase in Action:FRET-Based Assay forMonitoring Flipping and Polymerase Activity in Real Time[J].Anal Chem,2015,87,7690-7697)的方法用96孔板对样品进行HIV-1RT抑制活性的测定，100nM HIV-1RT(美国ARP(American Research Product)公司)与100nM双标引物/模板复合物混合，聚合反应动力学由加入100μM dNTPs启动。加入HIV-1RT和双标引物/模板，孵育5min后测定580nm波长的吸光度，计算出各个浓度下样品的抑制率，用Graphpad软件计算得到IC50值，以NVP(Nevirapine)(美国ARP(American Research Product)公司)为阳性对照。
HIV-1蛋白酶抑制活性的测试方法：
底物为(Arg-Glu(EDANS)-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Lys(DABCYL)-Arg)(AnaSpec)，底物切点两侧分别标记Edans和Dabcyl发色团。Edans的荧光发色光谱与Dabcyl的吸收光谱重叠，在足够近的距离内通过荧光共振能量转移产生荧光淬灭，使完整的底物几乎没有荧光。当荧光底物经HIV蛋白酶切后，Edans发色团远离了Dabcyl基团，荧光淬灭条件小时，这时Edans就在340nm的激发光下于490nm处产生荧光，加入待测化合物后，化合物对酶抑制活性强时则底物产物减少，荧光强度降低，反之荧光强度增加[董飚，章天，陶佩珍.高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型的建立[J].中国艾滋病性病,2006(05):402-405.]。
按照文献(董飚，章天，陶佩珍.高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型的建立[J].中国艾滋病性病,2006(05):402-405)的方法用96孔板对样品进行HIV-1PR抑制活性的测定，每孔加入底物(5μM)和缓冲液185μL，加入5μL样品溶液，测定空白吸收，加入10μL HIV-1PR，孵育5min后测定490nm波长的吸光度，计算出各个浓度下样品的抑制率，用Graphpad软件计算得到IC50值，以DRV(Darunavir)(购自美国ARP(American Research Product)公司)为阳性对照。
其中，HIV-1PR按照(王云华等.HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立.中国病毒学第21卷2期.2006年3月)中的方法在大肠杆菌中表达并纯化，HIV-1PR使用PD-10柱脱盐。
表2.化合物1、12、18、23、25的细胞毒性
Figure BDA0001222668210000141
细胞毒性的测试方法：
化合物细胞毒性采用试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)测定。用96孔板对样品进行细胞毒性测试，每孔加入293T细胞2万个，孵育24h后加入1μL样品，继续孵育24h，加入10μL CCK-8，2h后与450nm下测定吸光度，计算出各个浓度存活细胞的百分率，用Graphpad软件计算得到CC50值，以DMSO为空白对照，以NVP(Nevirapine)、DRV(Darunavir)为阳性对照。
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> RT/PR双靶点HIV抑制剂及其制备方法和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cagcagtaca aatggcagta ttc 23
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
tgtcgtcatg tttaccgtca taagtaggtg ttactagtcc gatttcccct agtccgaccc 60
atg 63

Claims (11)

1.式1所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002449830830000011
式1中，n为0；
R1表示对位取代的氨基、对位取代的甲氧基、对位取代的硝基、对位取代的单取代或双取代胺基、对位取代的羟甲基或3,4位取代的亚甲二氧基；
X为C或O；
Y为S；
M为羰基；
R为Ra、Rb或Rc；所述Ra为
Figure FDA0002449830830000012
所述Rb
Figure FDA0002449830830000013
所述Rc为
Figure FDA0002449830830000014
其中Z独立地选自O或N；L独立地选自N；R2表示氢、C1-C6烷基、卤素、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；R3表示氢、羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；R4表示氢、羟基、C2-C6烯基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；当Z为O时R5不为任何基团，当Z为N时R5为氢。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述Ra中与式1中X相连的是7位C或3位C。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R1为对位取代的氨基。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R4为氢、羟基或异戊烯基。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R2为氢或甲基。
6.根据权利要求1-5中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R3为氢、羟基或氨基。
7.根据权利要求1-5中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：式1所示的化合物为化合物18、化合物1、化合物25或化合物23；
所述化合物1是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Rb，Rb中L为N、R4为氢、R3为氢、R2为甲基、Z为O的化合物；
所述化合物18是式1中n＝0，X为O，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中7位C与X相连，Ra中Z为O、R4为异戊烯基、R3为氢、R2为氢的化合物；
所述化合物23是式1中n＝0，X为O，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Rc，Rc中Z为O、R4为氢、R3为氢、R2为氢的化合物；
所述化合物25是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中3位C与X相连，Ra中Z为O、R4为氢、R3为氨基位于7位C上、R2为甲基的化合物。
8.式1所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002449830830000021
式1中，n为0；
R1表示对位取代的氨基、对位取代的甲氧基、对位取代的硝基、对位取代的单取代或双取代胺基、对位取代的羟甲基或3,4位取代的亚甲二氧基；
X为C或O；
Y为S；
M为羰基；
R为Ra；所述Ra为
Figure FDA0002449830830000022
其中Z独立地选自N；R2表示氢、C1-C6烷基、卤素、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；R3表示氢、羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；R4表示氢、羟基、C2-C6烯基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或烷氧烯基；所述Ra中的R5不为任何基团，所述Ra中与式1中X相连的是Z。
9.根据权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物12是式1中n＝0，X为C，Y为S，M是羰基，R1是对位取代的氨基，R为Ra，Ra中的Z与X相连，Ra中Z为N、R4为氢、R3为羟基位于7位C上、R2为氢的化合物。
10.含有权利要求1-9中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐的HIV抑制剂。
11.A1至A4中的任一应用：
A1、权利要求1-9中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备以HIV蛋白酶和/或HIV逆转录酶为靶点的HIV抑制剂中的应用；
A2、权利要求1-9中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备HIV抑制剂中的应用；
A3、权利要求1-9中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或/和预防获得性免疫缺陷综合征药物中的应用；
A4、权利要求1-9中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备HIV蛋白酶抑制剂和/或HIV逆转录酶抑制剂中的应用。
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