CN102803490A - 用于从固定组织样品回收核酸或蛋白质的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

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CN102803490A CN2011800124140A CN201180012414A CN102803490A CN 102803490 A CN102803490 A CN 102803490A CN 2011800124140 A CN2011800124140 A CN 2011800124140A CN 201180012414 A CN201180012414 A CN 201180012414A CN 102803490 A CN102803490 A CN 102803490A
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Abstract

本发明提供通过采用清除分子诸如含有肼和含有酰肼的化合物来改善核酸或者蛋白质从保存于液体细胞防腐保存液中的样品中回收的方法和物质。本发明也提供包含含有肼和含有酰肼的化合物的裂解溶液以及包含所述化合物的试剂盒。

Description

用于从固定组织样品回收核酸或蛋白质的方法、组合物和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年1月4日提交的美国临时专利申请61/292,078的优先权，将其全部内容引入本申请作为参考。
技术领域
本发明描述了用于改善已经固定在组织或者细胞样品中的核酸或者蛋白质的回收的方法和试剂盒。
背景技术
在组织学、病理学和细胞生物学领域，固定(fixation)为一种化学方法，通过该方法保存生物样品以防腐烂。固定终止任何正在进行的生化反应，且也可增加待处理样品的机械强度或者稳定性。固定的目的是尽可能以接近生物材料的天然状态来保存该生物材料的样品。固定样品用于检验或者分析。
浸没(immersion)为一种固定技术，其中将样品浸没于体积最少为待固定组织体积20倍的固定剂中。固定剂扩散经过组织以固定，因此必须考虑组织的大小和密度以及固定剂类型。使用较大样品表示固定剂需要较长时间来到达较深组织。
固定剂可分类为交联或者沉淀固定剂。交联固定剂通过在组织中的蛋白质之间产生共价化学键来起作用。这将可溶性蛋白质锚定于细胞骨架，且向组织提供额外的刚性。沉淀或者变性固定剂通过降低蛋白质分子的溶解度且经常通过破坏疏水性相互作用来起作用，所述疏水性作用给予许多蛋白质三级结构。
组织学上一种常用的固定剂为交联固定剂甲醛，其通常作为饱和水溶液以福尔马林为名出售。甲醛被认为主要与碱性氨基酸赖氨酸的残基相互作用。用于固定的另一种通用醛为戊二醛，其被认为以与甲醛类似的机理起作用。
甲醛通过以下方法来保存或者固定组织或者细胞：通过–CH2–连接即亚甲基桥交联蛋白质或者核酸中的伯氨基。由于甲醛是高反应性的，因此样品或者培养基中过量的甲醛将妨碍任何涉及具有氨基的功能蛋白质(诸如酶或者抗体)、核酸探针、树脂或者任何其它功能试剂的样品加工或者分析，这是通过过量的甲醛与这些氨基交联以及随后使试剂失活来进行的。此外，由于交联可通过加热来逆转，因此培养基中任何过量的甲醛将最终再次形成交联，这阻止了有效的交联逆转。
氧化固定剂可与各种蛋白质和其它生物分子的侧链反应，这使得形成稳定组织结构的交联。当制备样品以用于电子显微镜术时，通常使用四氧化锇作为第二固定剂。重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾也用于特定组织学制品。两种常用沉淀固定剂为乙醇和甲醇。也使用丙酮。
乙酸为一种变性剂，其有时与其它沉淀固定剂组合使用。已知醇本身在固定过程中引起组织的收缩，而单独的乙酸与组织溶胀相关；将以上两者组合可导致组织形态更好地保存。其它固定剂包括苦味酸和氯化汞。
固定生物样品的一个问题是样品中的核酸和蛋白质可能与一种或者多种固定剂进行不可逆地结合。即使核酸和蛋白质并未与一种或者多种固定剂进行不可逆地结合，但是从样品中除去过量固定剂对于核酸和蛋白质的可靠回收和分析来说可能是重要的。此外，固定剂可妨碍分离的蛋白质或者核酸在下游生化分析诸如PCR中的使用。
发明内容
本发明涉及从固定生物样品和物质中回收并分析靶标分子诸如核酸或者蛋白质的方法和可用于这种方法中的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明提供从保存于液体细胞防腐保存液(liquidcytology preservative solution)中的生物样品提取靶标分子的方法。
在一个实施方案中，所述方法包括：A)使生物样品与包含清除剂(scavenging agent)的清除溶液(scavenger solution)接触，所述清除剂包含至少一个下式的末端肼基：
以及
B)在足以使核酸或者蛋白质从生物样品释放的条件下处理所述生物样品；和C)从分离的溶液中回收靶标分子，其中所述靶标分子为核酸或者多肽。
在一个实施方案中，所述清除剂选自a)式I的化合物：
Figure BDA00002097893000031
和
b)式II的化合物：
Figure BDA00002097893000032
其中R1选自：C1-C12烷基；C1-C12烯基；C3-C6环烷基；C3-C6环烯基；C6-C10芳基；和C6-C10杂芳基；R2在每种情况下可相同或者不同，且选自：
Figure BDA00002097893000033
和
Figure BDA00002097893000034
m为选自0和1的整数；且n为选自1和2的整数。在某些实施方案中，所述清除剂可通过本领域已知的方法来修饰以增加清除剂在水中的溶解度。例如，R1可任选取代有增加R1成分的亲水性的成分。
在另外的实施方案中，所述清除剂为式I的化合物，其中m为1且R1选自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基。
在另外的实施方案中，所述清除剂为式II的化合物，其中n为2，R1选自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基；且R2为
Figure BDA00002097893000035
在另外的实施方案中，所述清除剂选自氨基脲；氨基硫脲；卡巴肼；硫代卡巴肼；N-氨基胍及其盐，包括其盐酸盐；N,N-二氨基胍及其盐，包括其二盐酸盐；乙酰肼；己二酸二酰肼；琥珀酸二酰肼；甲酰肼；马来酸二酰肼；丙二酸二酰肼；苯磺酰肼；甲苯磺酰肼；和甲磺酰肼。
在另外的实施方案中，所述清除溶液包含约0.1M至约1.0M、约0.1M至约0.5M、约0.2M至约0.4M或者约0.3M的所述清除剂。
在另外的实施方案中，使用约0.3M己二酸二酰肼或者约0.3M琥珀酸二酰肼。
在另外的实施方案中，所述清除溶液直接加至液体细胞防腐保存液中。
在另外的实施方案中，所述清除溶液包含按体积计约2份裂解溶液和按体积计约1份生物样品，所述生物样品保存于液体细胞防腐保存液中。
在另外的实施方案中，所述清除溶液进一步包含蛋白消化酶(proteindisgistive enzyme)。
在另外的实施方案中，在靶标分子从生物样品释放之前，使所述生物样品与清除溶液接触。
在另外的实施方案中，通过在裂解溶液的存在下裂解生物样品来将所述靶标分子从生物样品释放。
在另外的实施方案中，所述清除溶液起到裂解溶液的作用。
在另外的实施方案中，在将裂解溶液加至生物样品之前、之后或者同时将清除溶液加至生物样品。
在另外的实施方案中，所述靶标分子为靶标核酸且所述靶标核酸通过以下方法从清除溶液回收，所述方法包括：(i)使用第二核酸将核酸探针与所述靶标核酸杂交以形成核酸杂交物；(ii)使所述核酸杂交物与固相结合；(iii)由所述清除溶液分离所述固相；和(iv)从所述固相洗脱所述靶标核酸。
在另外的实施方案中，所述核酸杂交物为DNA:RNA杂交物。
在另外的实施方案中，所述核酸杂交物通过以下方法与固相结合，所述方法包括：使核酸杂交物与能够结合所述核酸杂交物的抗体接触，其中所述抗体与固相结合或者适于与固相结合。
在另外的实施方案中，所述靶标核酸在约20°C至约70°C的洗脱温度从所述固相洗脱。
在另外的实施方案中，所述靶标核酸在约50°C至约60°C的洗脱温度从所述固相洗脱。
在另外的实施方案中，本发明提供裂解溶液，其包含：
(i)缓冲剂；
(ii)洗涤剂；
(iii)包含至少一个式
Figure BDA00002097893000041
的末端肼基的清除剂；和
(iv)任选的蛋白消化酶。
在另外的实施方案中，所述裂解溶液的清除剂选自：
a)式I的化合物：
Figure BDA00002097893000051
和
b)式II的化合物：
Figure BDA00002097893000052
其中：
R1选自：C1-C12烷基；C1-C12烯基；C3-C6环烷基；C3-C6环烯基；C6-C10芳基；和C6-C10杂芳基,其中R1为任选取代的由此增加清除剂在水中的溶解度；
R2在每种情况下可相同或者不同，且选自：
Figure BDA00002097893000053
Figure BDA00002097893000054
和
且
m为选自0和1的整数；且
n为选自1和2的整数。
在另外的实施方案中，所述清除剂选自氨基脲；氨基硫脲；卡巴肼；硫代卡巴肼；N-氨基胍及其盐，包括其盐酸盐；N,N-二氨基胍及其盐，包括其二盐酸盐；乙酰肼；己二酸二酰肼；琥珀酸二酰肼；甲酰肼；马来酸二酰肼；丙二酸二酰肼；苯磺酰肼；甲苯磺酰肼；和甲磺酰肼。
在另外的实施方案中，所述裂解溶液的清除剂选自己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼和氨基胍盐酸盐。
在另外的实施方案中，所述裂解溶液包含约0.2M至约1.5M的所述清除剂。
在另外的实施方案中，所述裂解溶液包含约0.2M至约0.5M己二酸二酰肼或者约0.2M至约0.5M琥珀酸二酰肼。
在另外的实施方案中，本发明提供用于从保存于液体细胞防腐保存液中的生物样品回收靶标核酸的试剂盒，所述试剂盒包含如上阐述的裂解溶液以及任选包含至少一种选自下述的额外组分：蛋白消化酶、固相、能够与靶标核酸杂交的核酸探针，以及抗体。
附图说明
图1阐述了肼用作羰基清除剂的基本机制，其使用氨基胍作为示例性肼化合物。
图2示例说明了在三种不同的肼(己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼和氨基胍)的存在或者不存在下从掺加于SurePath液体细胞收集培养基中的SiHa细胞中回收核酸。在每种情况下，右侧条表示将指定肼加至指定最终浓度时的结果，而左侧条表示加入等体积的水的结果。显示了重复试验的结果。
图3证实了改变琥珀酸二酰肼浓度的效果。
图4证实了改变己二酸二酰肼浓度对SurePath培养基中的样品的效果。对于每个条件，左侧条表示在不存在细胞的情况下的数据，而右侧条表示使用10,000个SiHa细胞获得的数据。“样品”表示仅存在SurePath培养基。“0.16M”和“0.30M”分别表示将包含己二酸二酰肼的裂解缓冲剂加至SurePath样品中以得到0.16M和0.30M的最终浓度。“水”表示使用水代替SurePath。
图5证实了当细胞数目变化时己二酸二酰肼作为清除剂的有效性。
图6示例说明了裂解前将生物样品与肼预先孵育10分钟的作用。
图7比较了用己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼和氨基胍处理10分钟和过夜的结果。
图8证实了在蛋白酶K的存在或者不存在下使用肼的预先处理的作用。
图9证实了琥珀酸二酰肼和己二酸二酰肼在QiaAmp提取中的表现，其中洗脱步骤在室温(25°C)或者56°C进行。
具体实施方式
本发明一般地涉及清除剂化合物增加靶标分子从保存于液体细胞学培养基中的生物样品中的回收的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了从液体细胞防腐保存培养基(liquidcytological preservative medium)中的生物样品中回收核酸或者蛋白质的方法，包括：a)将清除剂加至培养基中；b)在清除剂足以清除样品中防腐保存剂的一定温度和时间内孵育；和c)回收核酸或者蛋白质。如本申请所使用，清除剂为能够与固定剂反应且由此从溶液中除去固定剂的任何化合物。在本发明披露的物质和方法的上下文中，这些化合物理想地显示出一种或者多种下述性质：(1)水中的高溶解性；(2)化学上为中性；(3)无毒；和(4)容易获得和廉价。在另外的实施方案中，这些化合物显示出上述性质中的每种。
液体细胞防腐保存培养基可包括交联和/或沉淀防腐保存剂。交联防腐保存剂包括但不限于醛、四氧化锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾。沉淀防腐保存剂包括但不限于醇和乙酸。
在一个实施方案中，所述液体细胞防腐保存培养基包括基于羰基的防腐保存剂，诸如甲醛。甲醛为通过亚甲基桥交联氨基来固定细胞的交叉反应性分子。尽管这对于细胞学目的有用，但是其可抑制从固定样品的有效分离核酸和/或蛋白质。
在一个实施方案中，所述液体细胞防腐保存培养基包括醛。通常用于液体细胞防腐保存培养基的示例性醛包括但不限于甲醛、乙二醛、戊二醛、甘油醛、丙烯醛或者其它脂族醛；或者性质未知的醛。一种所述液体细胞防腐保存培养基为
Figure BDA00002097893000071
其为临床环境下最常用的防腐保存剂培养基中的一种。SUREPATH培养基具有接近37%的甲醛含量且也含有甲醇、乙醇和异丙醇。这种高甲醛含量使得其为有效的固定剂，但这对从固定样品提取靶标分子(诸如核酸和蛋白质)且将其用于随后的分子分析而言也是一种挑战。该实施方案也包括已知含有甲醛释放剂的防腐保存剂培养基，包括但不限于Quaternium-15(六亚甲基四胺-3-氯烯丙基氯化物)、Tris Nitro(三-羟基甲基硝基甲烷)、Glydant(1,3-二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲，或者DMDM-乙内酰脲)、Germal-115(咪唑烷基脲)、Germall II(尿素醛(diazolidinylurea))、Bronopol(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、Bronidox(5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷)、Bromothalonil(甲基二溴戊二腈，1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷)、SuttocideA(羟基甲基甘氨酸盐)和多聚甲醛。该实施方案也包括含有来源未知的醛的培养基，其可通过使用醛-特异性试剂诸如Purpald(4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑)来检测。
在一个实施方案中，所述清除剂能够与羰基化合物诸如醛反应。示例性羰基清除剂包括但不限于肼。如本申请所使用，肼为包含末端肼官能团的任何化合物。如本申请所使用，“肼官能团”为下式的化学基团：
Figure BDA00002097893000081
其中波浪形化学键表示与化学结构的剩余部分的连接键。肼容易地与羰基(醛和酮)反应以形成腙化学键。这些化学键用含氮官能团代替羰基的氧，从而限制醛与其它因子结合的能力。示例性反应方案在图1中阐述。
肼可为单官能化的或者多官能化的。“单官能化的”肼为含有单一末端肼官能团的肼。“多官能化的肼”为含有多于一个末端肼官能团的肼。
在一个实施方案中，所述清除剂为式I的肼：
Figure BDA00002097893000082
其中：
R1为C1-C12烷基；C1-C12烯基；C3-C6环烷基；C3-C6环烯基；C6-C10芳基；和C6-C10杂芳基；且
m为选自0和1的整数。
在一个示例性实施方案中，所述清除剂为氨基胍，即m为0的式I肼。
在其它示例性实施方案中，所述清除剂为式I的肼，其中m为1且R1选自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基。
在另外的实施方案中，所述清除剂选自被称为酰肼的一类肼。类似地，酰肼能够与羰基(醛和酮)反应以形成腙化学键。如本申请所使用，酰肼为包含末端酰肼官能团的化合物：
Figure BDA00002097893000083
其中所述波浪形化学键表示与核心化学结构的连接键且R2选自：
和
Figure BDA00002097893000085
在一个实施方案中，所述清除剂为式II的酰肼：
Figure BDA00002097893000086
其中：
R1为C1-C12烷基；C1-C12烯基；C3-C6环烷基；C3-C6环烯基；C6-C10芳基；和C6-C10杂芳基；其中R1可任选为任选取代的由此增加清除剂在水中的溶解度，
R2在每种情况下可相同或者不同，且选自：
Figure BDA00002097893000091
和
Figure BDA00002097893000092
且
m为选自1和2的整数。
在一个示例性的实施方案中，所述清除剂为式II的酰肼，其中R1选自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基。
在另外的示例性实施方案中，所述清除剂为式II的二官能化的酰肼，其中n为2且R1选自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基。
在另外的实施方案中，所述清除剂为选自碳酸和硫代碳酸衍生物的肼，包括但不限于：氨基脲(化学式：NH2C(=O)NHNH2)；氨基硫脲(化学式：NH2C(=S)NHNH2)；卡巴肼(化学式：NH2NHC(=O)NHNH2)；硫代卡巴肼(化学式：NH2NHC(=O)NHNH2)；N-氨基胍及其盐，包括其盐酸盐以及N,N-二氨基胍(化学式：NH2NHC(=NH)NHNH2)及其盐，包括其二盐酸盐。
在其它示例性实施方案中，所述清除剂为选自下述的肼：乙酰肼(化学式：CH3C(=O)NHNH2)、己二酸二酰肼(化学式：NH2NHC(=O)(CH2)4C(=O)NHNH2)、琥珀酸二酰肼(化学式：H2NNHCOCH2CH2CONHNH2)、甲酰肼(化学式：NH2NHC(=O)H)、马来酸二酰肼(化学式：H2NNHCOCHCHCONHNH2)和丙二酸二酰肼(化学式：H2NNHCOCH2CONHNH2)。
在其它示例性实施方案中，所述清除剂为选自磺酸衍生物的肼，包括但不限于苯磺酰肼(化学式：H2NNHS(=O)2C6H5)、甲苯磺酰肼(化学式：H2NNHS(=O)2C6H5CH3)和甲磺酰肼(化学式：H2NNHS(=O)2CH3)。
在某些实施方案中，所述清除剂可通过本领域已知的方法来进行修饰以增加清除剂在水中的溶解度。例如，式I或者式II中的R1可任选取代有增加R1成分的亲水性的成分。
在一个实施方案中，所述方法包括使生物样品与清除溶液接触。如本申请所使用，术语“清除溶液”是指包含清除剂的水溶液。在示例性实施方案中，可从液体细胞防腐保存培养基分离所述生物样品，然后与清除溶液接触。在所述情况下，所述生物样品可在清除溶液的单一等分部分中孵育或者可在清除溶液中连续洗涤。在另外的示例性实施方案中，所述清除溶液可直接加至液体细胞防腐保存培养基中。在另外的示例性实施方案中，加入的清除溶液的量可基于对固定剂在样品中的量的评估。清除剂的量可与固定剂在样品中的量相同，小于固定剂在样品中的量，或者比固定剂在样品中的量过量。在一个实施方案中，所述清除剂的量比固定剂在样品中的量轻微过量。在示例性实施方案中，所述清除溶液包含约0.1M至约1.0M、约0.1M至约0.5M、约0.2M至约0.4M或者约0.3M的所述清除剂。在另外的实施方案中，使用约0.3M己二酸二酰肼或者琥珀酸二酰肼。如本申请所使用，当用于描述浓度时，术语“约”明确地包括可向上或者向下舍入至指定浓度的所有浓度。
在另外的实施方案中，所述靶标分子可通过包括特别是裂解的方法来从生物样品中提取。如本申请所使用，术语“裂解”是指破坏细胞壁、细胞膜或者细胞器或者脂质膜限定的其它结构(包括但不限于内质网、高尔基体、溶酶体、线粒体、细胞核、空泡和泡囊)的完整性的作用。裂解的示例性方法包括机械裂解，诸如超声或者细胞溶解；以及化学裂解，包括洗涤剂诸如聚乙二醇十二烷基醚(作为Brij-58商业销售)、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(作为CHAPS商业销售)、Nonidet P-40(也被称为IgepalCA-630)、脱氧胆酸盐、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(作为SDS商业销售)和/或聚山梨酯(polysorbate)表面活性剂(作为TWEEN商业销售)的使用。
当通过裂解提取靶标分子时，生物样品应与裂解溶液接触。如本申请所使用，“裂解溶液”是指用于裂解细胞的任何溶液。示例性裂解溶液包括但不限于低渗裂解溶液和基于洗涤剂的裂解溶液，包括但不限于包括下述的裂解溶液：聚氧乙烯(20)十六烷基醚(作为Brij-58商业销售)、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(作为CHAPS商业销售)、Nonidet P-40(也被称为Igepal CA-630，叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇(tert-octylphenoxypoly(oxyethylene)ethanol))、脱氧胆酸盐、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(作为SDS商业销售)和/或聚山梨酯表面活性剂(作为TWEEN商业销售)。
在另外的实施方案中，所述裂解溶液可任选包含缓冲剂。示例性缓冲剂包括但不限于三(羟基甲基)氨基甲烷(“TRIS”)及其衍生物，诸如N-三-(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(“TAPS”)、3-[N-三-(羟基甲基)-甲基-氨基]-2-羟基丙磺酸(“TAPSO”)；N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(“TES”)；N-[三(羟基甲基)甲基]-甘氨酸(“TRICINE”)；二(2-羟基乙基)亚氨基三-(羟基甲基)甲烷(“bis-TRIS”)；1,3-二[三(羟基-甲基)甲基氨基]丙烷(“bis-TRIS PROPANE”)；碳酸盐-碳酸氢盐；甘氨酸；磷酸盐；4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(“HEPES”)；N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(“Bicine”)；3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)；和其它优良缓冲剂。也可包括裂解溶液的众多其它成分。裂解溶液的精确类型和组成可由本领域技术人员根据样品类型、裂解方法、目标分析物和使用的分析方法来容易地确定。
在一个实施方案中，所述清除溶液也可起到裂解溶液的作用。可替换地，所述清除溶液和裂解溶液可作为单独的溶液先后或者同时加至生物样品。在一个实施方案中，将所述生物样品与清除溶液一起孵育，之后加入裂解溶液。在另外的实施方案中，除去所述清除溶液，之后加入裂解溶液。在另外的实施方案中，将所述裂解溶液加至所述生物样品中，之后加入清除溶液。在另外的实施方案中，可将所述生物样品在足以部分或者完全由生物样品中释放靶标分子的条件下与裂解溶液一起孵育，之后加入清除溶液。
在一个实施方案中，所述靶标分子为核酸。可使用任何方法从生物样品回收核酸。作为实例，回收靶标核酸的方法包括但不限于：色谱法，包括但不限于硅胶或者玻璃吸附、离子交换色谱法、亲和纯化、旋转柱色谱法和凝胶过滤；溶剂提取和沉淀；以及离心。核酸回收方法包括但不限于硫酸铵沉淀、差式增溶、蔗糖梯度离心和色谱法。作为实例而非限制的，所述核酸可通过使用磁性珠来分离，所述磁性珠被修饰以与核酸特异性结合。
在另外的实施方案中，包含具体序列(specific sequence)的核酸可通过使其与所述具体序列互补的核酸探针杂交来分离。在一个实施方案中，所述核酸探针与固相结合或者适于与固相结合。在另外的实施方案中，核酸探针与核酸分子杂交得到所述探针和核酸分子之间的DNA:RNA杂交物。然后所得的杂交物可通过与已知特异性结合DNA:RNA杂交物的抗体(“结合DNA:RNA的抗体”)来结合，其本身可与固相结合或者适于与固相结合。在任一情况下，探针与核酸的杂交得到与固相关联的核酸，然后可使用机械装置将其由裂解液分离。作为实例而非限制性的，所述方法描述于美国专利6,228,578和美国专利申请12/695,071，将其全部内容引入本申请，作为参考。示例性结合DNA:RNA的抗体包括但不限于披露于美国专利4,732,847和4,865,980中的抗体，将其全部内容引入本申请，作为参考。
作为实例而非限制性的，适当的固相包括但不限于：硅胶、硼硅酸盐、硅酸盐、无机玻璃，有机聚合物诸如聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯，琼脂糖，多糖诸如纤维素，金属氧化物诸如氧化铝、氧化镁、氧化钛和氧化锆，金属诸如金或者铂，琼脂糖、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、二乙烯基苯聚合物、苯乙烯二乙烯基苯聚合物、葡聚糖及其衍生物和/或硅胶、珠子、膜和树脂；玻璃或者硅石表面，诸如珠子、板和毛细管；可磁化或者磁性(例如顺磁性、超顺磁性、铁磁性或者亚铁磁性)粒子，包括但不限于聚苯乙烯、琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖和/或在其中结合磁性材料或者与磁性材料关联的硅石材料。在一些示例性实施方案中，所述核酸探针或者抗体可连接至加工容器诸如微型管、微板孔或者毛细管的表面，且使用这些表面可在微观规模上分离所述核酸。当提供生物素化的核酸探针或者抗体时，所述固相可用能够结合生物素部分的物质例如抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素和/或中性抗生物素蛋白来包衣。在另外的实施方案中，所述固相可用对于DNA:RNA杂交物具有特异性的抗体来包衣或者适于用所述抗体来包衣。
使用本申请披露的方法和组合物获得的核酸可用于随后的分子分析方法，包括但不限于凝胶电泳、PCR-相关技术包括逆转录酶PCR和实时PCR、序列测定、亚克隆操作、DNA印迹法、RNA印迹法、荧光原位杂交和各种突变分析包括杂交物捕获和多重分析。
在一个实施方案中，所述清除溶液包含从生物样品释放靶标核酸且分离所述靶标分子所必须的所有成分。作为实例而非限制性的，所述清除溶液可包含特别是洗涤剂、缓冲剂、对于靶标核酸具有特异性的核酸探针和固相，其中核酸与核酸探针的杂交将靶标核酸捕获于固相。作为实例而非限制的，这可通过将核酸探针修饰为包含能够结合固相的成分的配体来实现。例如，探针可修饰为含有生物素部分且固相可用能够结合生物素部分例如抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素和/或中性抗生物素蛋白或者其片段的物质来包衣。在其它实例中，靶标核酸与核酸探针的杂交可形成DNA:RNA杂交物，然后可通过对于DNA:RNA杂交物具有特异性的抗体将其捕获于固相，诸如通过描述于美国专利6,228,578和美国专利申请12/695,071中的方法，将其全部内容引入本申请，作为参考。
在一个实施方案中，所述靶标分子为多肽。如本申请所使用，术语“多肽”是指包含经肽键连接的至少两个氨基酸的任何分子，且明确地包括寡肽和蛋白质。多肽回收方法包括但不限于硫酸铵沉淀、差式增溶、蔗糖梯度离心和色谱法。色谱多肽分离方法包括但不限于尺寸排阻、离子交换、疏水相互作用、亲和性、免疫亲和性和金属结合色谱法。
使用本发明披露的方法和组合物获得的多肽可用于随后的分子分析方法包括但不限于序列测定、免疫沉淀、蛋白质印迹、酶联免疫吸附法测定、斑点印迹和酶测定。
本申请所述的方法也可用于分离整个病原体，包括但不限于细菌、真菌、酵母菌、原生动物、蛋白感染素(prions)和病毒。
本申请所述的方法和组合物可容易且快速地针对保存于交联或者沉淀固定剂中的样本进行优化。本申请所述的方法和组合物也适用于所有生物流体且提供简单的操作规程，其符合高流通量自动操作，包括例如
Figure BDA00002097893000131
Next GenTM样品处理器，其是一种用于提取和分析的自动化样品加工处理装置，其提供完全自动化，包括对样品脱盖和加盖以及零人体工程移动。由此，它们通过提供可变输入体积、无害材料液体废物、有限固体废物以及可储存于室温的试剂来提供超高流通量以及生态学友好的样品加工处理。
实施例
材料和方法
A.细胞和样品
使用包含人乳头状瘤病毒属16核酸的生物样品测试本发明的材料和方法。在一些实例中，使用SiHa细胞系，其衍生自人宫颈癌。SiHa细胞已知为含有整合的HPV 16基因组。在其它实例中，使用确定为感染有HPV 16的临床样品。作为HPV 16测定的阴性对照，使用Jurkat细胞或者确定为HPV阴性的临床样品。
除非另作说明，本实施例中使用的所有样品在指定的液体细胞防腐保存培养基中固定至少过夜。
B.一般操作规程：HandyLabsTM提取
在一些实例中，使用HandyLabsTM提取技术进行提取，其为基于阴离子交换色谱法的可商购得到的DNA提取技术，使用经阴离子交换材料处理的顺磁珠。下述一般操作规程用于本发明实施例。
将样品掺加于500μL
Figure BDA00002097893000141
液体细胞学培养基中并置于5mL管中。
将100μL清除剂的水溶液(或者超纯水)和蛋白酶K片剂(与试剂盒一起提供)加至管中。然后加入1.2mL裂解缓冲剂和60μL HL珠子(均与试剂盒一起提供)并将管在60°C孵育10分钟。然后加入磁石并保持2分钟以使珠子成团并除去上清液。然后将珠子重新混悬于400μL缓冲剂1(与试剂盒一起提供)中，将混合物振摇，使珠子成团，并除去上清液。然后，将珠子重新混悬于30μL缓冲剂2(与试剂盒一起提供)中并将核酸在65.8°C洗脱9分钟。珠子再次成团并将洗脱液转移至96孔板中。将12μL缓冲剂3(与试剂盒一起提供)和8μL Digene收集培养基(Qiagen Gaithersburg,Inc.,Qiagen,MD)加至各孔中。使用
Figure BDA00002097893000142
(特别描述于美国)或者
Figure BDA00002097893000143
测定(描述于美国6,228,578)检测HPV 16的存在。
C.一般操作规程：
Figure BDA00002097893000144
提取
在一些实例中，使用
Figure BDA00002097893000145
DNA提取试剂盒(Qiagen Inc.,Hilden,Germany)进行核酸提取，该试剂盒为基于柱形式(column format)的硅胶吸附的可商购得到的DNA提取技术。
将250μl
Figure BDA00002097893000146
样品和50μL清除剂水溶液(或者超纯水)加至2mL管中并简单地涡旋混合。将80μL缓冲剂ATL(与试剂盒一起提供)和20μL蛋白酶K溶液(与试剂盒一起提供)加至管中，将管脉冲涡旋10次，然后在70°C在振摇的水浴(900rpm)中孵育15分钟。加入360μL 100%乙醇，将管脉冲涡旋15次，并将混合物在室温孵育5分钟。然后将裂解液转移至置于多头抽真空装置上的
Figure BDA00002097893000148
柱中。然后通过施用真空使裂解液经过所述柱。然后将柱洗涤两次，第一次用750μL缓冲剂AW2(与试剂盒一起提供)洗涤，然后用100%乙醇洗涤。然后将柱由该装置移去，置于2mL管中，并在14000rpm离心3分钟。然后将柱置于洗脱管中并在56°C干燥3分钟。然后将70μL缓冲剂AVE加至膜中，在室温孵育5分钟，并在14000rpm离心1分钟。将洗脱液转移至96孔板中并使用
Figure BDA00002097893000149
(特别描述于美国专利申请2010/0105060A1)或者
Figure BDA00002097893000151
测定(描述于美国6,228,578)检测HPV16的存在。
实施例1
在该实施例中，使用掺加有10,000个SiHa细胞(HPV16+)的SUREPATH临床阴性物进行肼化合物的初始可行性。使用仅包含临床阴性物的样品作为针对每种条件的阴性对照。每个样品用己二酸处理，裂解，并使用如上阐述的HandyLabs操作规程针对核酸分离进行加工处理。除非另作说明，每个样品含有蛋白酶K。
如在表1中所阐述，"CV″是指变异系数，"S/N"是指信噪比，"RLU/CO"是指相对光单位/截断比，且"PK"是指蛋白酶K。使用包含整个HPV 16基因组的1pg质粒作为针对测定的阳性对照。使用不含液体细胞防腐保存培养基的掺加于Jurkat细胞的SiHa细胞建立回收百分数的基线。“%回收A”表示相比于基线，使用不含蛋白酶K的0.3M己二酸二酰肼获得的数据。“%回收B”表示相比于基线，使用含蛋白酶K的0.3M己二酸二酰肼获得的数据。“%回收C”表示相比于基线，使用含蛋白酶K的0.16M己二酸二酰肼获得的数据。“%回收D”表示相比于基线，使用不含蛋白酶K的0.3M己二酸二酰肼获得的数据。
表1
Figure BDA00002097893000161
实施例2
当使用氨基胍盐酸盐作为SUREPATH培养基中的清除剂且预先孵育10分钟时，获得DNA的95%至100%的回收。
表2
Figure BDA00002097893000171
当加入氨基胍盐酸盐时，可将溶液充分混合。SUREPATH样品在与氨基胍盐酸盐混合之前可处于室温。约300μL至400μL氨基胍盐酸盐(0.5M)可加至在本申请所述测定中使用的约500μL SUREPATH培养基中。如果减少工作体积是有益的，则可使用较高浓度的氨基胍盐酸盐。由于氨基胍盐酸盐为高溶解性的，所以可制备浓(例如4M)溶液。在一个实施方案中，可使用包含1M、2M、3M或者4M氨基胍盐酸盐的储备清除溶液。
如在表2中所阐述，"CV"是指变异系数，"NC"是指阴性校正，"PK"是指蛋白酶K，"DCM"是指DIGENE收集培养基，"DCM-1PG"是指具有1pg阳性校准剂的DIGENE收集培养基，"SP"是指SUREPATH培养基，"NP-SP"是指阴性池SUREPATH培养基，且"Sp-SP"是指掺加的SUREPATH培养基。
实施例3
氨基胍、己二酸二酰肼和琥珀酸二酰肼在HandyLabs操作规程中进行彼此比较。20,000个SiHa细胞掺加于SurePath培养基或者Digene收集培养基中并根据如上阐述的HandyLabs操作规程进行加工处理。针对每个条件进行重复试验。针对在SurePath培养基中的每种肼的结果示于图2中。如所观察到的，在每种情况下，清除剂的加入改善了核酸的回收。当与Digene收集培养基中的样品进行比较时，在不存在清除剂的情况下回收百分数在40%和60%之间变化，而清除剂的加入将回收百分数改善为85%和100%之间。
实施例4
各种浓度的琥珀酸二酰肼和己二酸二酰肼也在HandyLabs操作规程中进行测试。
在一个试验中，将20,000个SiHa细胞掺加于SurePath培养基中并根据如上阐述的HandyLabs操作规程使用0.16M、0.3M或者0.5M琥珀酸二酰肼或者等体积的水进行加工处理。结果示于图3中。
在另外的试验中，将20,000个SiHa细胞掺加于SurePath培养基中并根据如上阐述的HandyLabs操作规程使用0.16M、0.3M或者0.5M己二酸二酰肼或者等体积的水进行加工处理。结果示于图4中。
实施例5
也测试了改变细胞数目(且由此改变靶标核酸的复制数目)的效果。产生每500μL SurePath中20,000、10,000、5,000、2,500和0个SiHa细胞的储备液并根据如上阐述的HandyLabs操作规程使用0.3M己二酸二酰肼或者等体积的水进行加工处理。结果示于图5中。
实施例6
也测试了使用清除剂的预处理能否改善回收。将20,000个SiHa细胞掺加于SurePath培养基或者Digene收集培养基中并根据如上阐述的HandyLabs操作规程进行加工处理，不同的是：将一些样品与0.3M己二酸二酰肼或者0.5M氨基胍(或者等体积的水)一起孵育10分钟，之后加入蛋白酶K和裂解缓冲剂。将其重复进行，使用0.3M己二酸二酰肼、0.3M琥珀酸二酰肼或者0.5M氨基胍预先孵育10分钟或者过夜。结果示于图6和图7中。
此外，测试了在预处理中加入蛋白酶K是否有效。使用0.3M琥珀酸二酰肼作为清除剂将样品如上测试，不同的是：将一个样品用包含蛋白酶K的清除溶液进行预处理10分钟。结果示于图8中。
实施例7
已经观察到相比于HandyLabs操作规程，QiaAmp操作规程与SurePath培养基的相容性较弱。因此研究了提高核酸由阴离子交换柱洗脱的温度能否改善回收。将20,000个SiHa细胞掺加于500μL SurePath培养基中并根据如上阐述的HandyLabs操作规程或者QiaAmp操作规程进行加工处理，使用0.3M琥珀酸二酰肼或者0.3M己二酸二酰肼作为清除剂。对于QiaAmp操作规程，洗脱在室温或者56°C进行。结果示于图9中。

Claims (30)

1.从保存于液体细胞防腐保存液中的生物样品提取靶标分子的方法，该方法包括：
A)使所述生物样品与包含清除剂的清除溶液接触，所述清除剂包含至少一个末端肼基；
B)在足以使核酸或者蛋白质从生物样品释放的条件下处理所述生物样品；以及
C)分离所述靶标分子。
2.权利要求1的方法，其中所述清除剂选自：
a)式I的化合物：
Figure FDA00002097892900011
和
b)式II的化合物：
Figure FDA00002097892900012
其中：
R1为C1-C12烷基；C1-C12烯基；C3-C6环烷基；C3-C6环烯基；C6-C10芳基；和C6-C10杂芳基，其中R1为任选取代的由此增加所述清除剂在水中的溶解度；
R2在每种情况下可相同或者不同，且选自：
Figure FDA00002097892900013
和
Figure FDA00002097892900014
且
m为选自0和1的整数；且
n为选自1和2的整数，
其中所述清除剂为任选修饰的由此增加在水中的溶解度。
3.权利要求2的方法，其中所述清除剂为式I的化合物，其中R1为C1-C12烷基且m为1。
4.权利要求3的方法，其中R1为C1-C6烷基。
5.权利要求3或4的方法，其中R1为C2-C4烷基。
6.权利要求2的方法，其中所述清除剂为式II的化合物，其中R1为C1-C12烷基；R2为
Figure FDA00002097892900021
且n为2。
7.权利要求6的方法，其中R1为C1-C6烷基。
8.权利要求6或7的方法，其中R1为C2-C4烷基。
9.权利要求1的方法，其中所述清除剂选自氨基脲；氨基硫脲；卡巴肼；硫代卡巴肼；N-氨基胍及其盐；N,N-二氨基胍及其盐；乙酰肼；己二酸二酰肼；琥珀酸二酰肼；甲酰肼；马来酸二酰肼；丙二酸二酰肼；苯磺酰肼；甲苯磺酰肼；和甲磺酰肼。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述清除溶液包含约0.1M至约1.0M的所述清除剂。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述清除溶液包含约0.1M至约0.5M的所述清除剂。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述清除溶液包含约0.2M至约0.4M的所述清除剂。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述清除溶液包含约0.3M己二酸二酰肼或者约0.3M琥珀酸二酰肼。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述清除溶液直接加至所述液体细胞防腐保存液。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述清除溶液进一步包含蛋白消化酶。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中在所述靶标分子从生物样品释放之前，使所述生物样品与所述清除溶液接触。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中通过在裂解溶液的存在下裂解所述生物样品将所述靶标分子从生物样品释放。
18.权利要求17的方法，其中所述清除溶液为裂解溶液。
19.权利要求17的方法，其中在将裂解溶液加至生物样品之前、之后或者同时将所述清除溶液加至生物样品。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述靶标分子为靶标核酸且：
C)所述靶标核酸通过以下方法来分离，所述方法包括：
(i)使用第二核酸将核酸探针与所述靶标核酸杂交以形成核酸杂交物；
(ii)使所述核酸杂交物与固相结合；
(iii)分离所述固相；和
(iv)从所述固相洗脱所述靶标核酸。
21.权利要求20的方法，其中所述核酸杂交物为DNA:RNA杂交物且其中通过以下方法使所述DNA:RNA杂交物与固相结合，所述方法包括：使所述核酸杂交物与能够结合所述核酸杂交物的抗体接触，其中所述抗体与所述固相结合或者适于与所述固相结合。
22.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述靶标分子为靶标核酸且：
C)所述靶标核酸通过以下方法来分离，所述方法包括：
(i)使所述靶标核酸与阴离子交换基质结合；和
(ii)从所述阴离子交换基质洗脱所述靶标核酸。
23.权利要求22的方法，其中所述靶标核酸在约20°C至约70°C的洗脱温度从所述阴离子交换基质洗脱。
24.权利要求22或23的方法，其中所述靶标核酸在约50°C至约60°C的洗脱温度从所述阴离子交换基质洗脱。
25.裂解溶液，包含：
(i)缓冲剂；
(ii)洗涤剂；
(iii)包含至少一个末端肼基的清除剂；且
(iv)任选的蛋白消化酶。
26.权利要求25的裂解溶液，其中所述清除剂选自：
a)式I的化合物：
Figure FDA00002097892900041
和
b)式II的化合物：
Figure FDA00002097892900042
其中：
R1选自：C1-C12烷基；C1-C12烯基；C3-C6环烷基；C3-C6环烯基；C6-C10芳基；和C6-C10杂芳基，其中R1为任选取代的由此增加清除剂在水中的溶解度；
R2在每种情况下可相同或者不同，且选自：
Figure FDA00002097892900043
和
Figure FDA00002097892900044
且
m为选自0和1的整数；且
n为选自1和2的整数，
其中所述清除剂为任选修饰的由此增加在水中的溶解度。
27.权利要求25或26的裂解溶液，其中所述清除剂选自氨基脲；氨基硫脲；卡巴肼；硫代卡巴肼；N-氨基胍及其盐；N，N-二氨基胍及其盐；乙酰肼；己二酸二酰肼；琥珀酸二酰肼；甲酰肼；马来酸二酰肼；丙二酸二酰肼；苯磺酰肼；甲苯磺酰肼；和甲磺酰肼。
28.权利要求25至27中任一项的裂解溶液，包含约0.1M至约1.0M的所述清除剂。
29.权利要求25至28中任一项的裂解溶液，包含约0.1M至约0.5M己二酸二酰肼或者约0.1M至约0.5M琥珀酸二酰肼。
30.试剂盒，其用于从保存于液体细胞防腐保存液中的生物样品回收靶标核酸，所述试剂盒包含权利要求25至29中任一项的裂解溶液且任选包含至少一种选自下述的额外组分：蛋白消化酶、固相、能够与所述靶标核酸杂交的核酸探针，以及抗体。
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