KR100390371B1

KR100390371B1 - Ｃ형 간염 바이러스 증식조절단백질에 특이적으로 결합하는 ｒｎａ 및 이를 이용한 ｈｃｖ 감염 진단용 키트

Info

Publication number: KR100390371B1
Application number: KR10-2000-0047473A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 황병훈; 여현주
Original assignee: 제노프라 주식회사
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2003-07-07
Also published as: KR20020014283A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 증식조절 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 및 이를 이용한 HCV 감염 진단용 키트에 관한 것이며, HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위와 특이적으로 결합하는 서열번호1 또는 서열번호2의 염기서열을 포함하는 RNA, 및 상기 RNA와 HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위의 특이적 결합을 검출하여 HCV 감염을 진단하는 HCV 감염 진단용 키트가 개시되어 있다. 본 발명의 HCV 감염 진단 키트에 의하면 기존의 항체를 이용한 HCV 감염 진단에 비하여 보다 저렴하고 정확하게 HCV 감염을 진단할 수 있다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 증식조절단백질에 특이적으로 결합하는 ＲＮＡ 및 이를 이용한 ＨＣＶ 감염 진단용 키트{RNA Specifically Binding to Regulatory Protein for Hepatitis C Virus Proliferation and Kit for Diagnosing HCV Infection Using Thereof}

(기술분야)

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV) 증식조절단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 및 이를 이용한 HCV 감염 진단용 키트에 관한 것이며, 보다 상세하게는 HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제(helicase) 활성부위에 특이적으로 결합하는 RNA, 및 본 RNA와 NS3 헤리카제 활성부위의 특이적 결합을 검출하여 HCV 감염을 진단하는 키트에 관한 것이다.

(배경기술)

C형 간염 바이러스(HCV)는 비A형 및 비B형 간염을 일으키는Flaviviridae속에 속하는 양성 단일가닥 RNA 바이러스로서, HCV에 감염된 환자의 절반이상이 만성간염으로 발전하고 이들은 대부분 간경화나 간암으로 이어져 치사율이 매우 높으며 전세계 인구의 1%이상이 HCV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, HCV는 생체 내에 매우 낮은 역가로 존재하기 때문에 그 진단이 매우 어렵고 아직도 세포배양 시스템이 개발되어 있지 않아 효과적인 치료법이나 백신이 없는 상태이다.

널리 알려진 바와 같이 HCV의 게놈은 단일가닥 RAN로서 3,010개의 아미노산으로 이루어진 단일의 복합단백질을 발현시킨다(Choo et al., 1989 Science, 244, 359-362). HCV에 의해 발현되는 상기 복합단백질은 숙주세포와 바이러스 프로테아제에 의해 프로세싱되며 그 서열은 NH₂-C-E1-E2-_p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B- COOH이다(Petra et al., 1997, Biological Chemistry, 378, 469-476). 여기에서 C, E1 및 E2는 구조단백질이고 NS2부터 NS5B까지는 비구조단백질로 알려져 있으며, 이중에서 NS3단백질(72KDa)의 N말단은 세린 프로테아제(serine protease) 활성이 있어서 NS4A의 도움에 의하여 복합단백질을 프로세싱하고 C말단은 NTPase와 RNA 헤리카제 활성이 있다.

지금까지 다양한 종류의 바이러스 헤리카제가 알려져 있는데 이들은 바이러스 게놈의 복제, 전사, 해독에 관여하여 바이러스 증식에 중요한 역할을 한다. 따라서, HCV 발현 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위(이하 'HCV 헤리카제'라고 약칭함)도 HCV 증식에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보인다 .

일반적으로 DNA나 RNA와 같은 핵산들은 세포의 구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체로서 알려져 왔다. 그러나 1982년에 RNA가 특정 구조를 형성함으로써 효소적 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 이러한 RNA들이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능을 가질 수 있다고 생각되었으며(Larry et al., 1995, Annual Review Biochemistry, 64, 763-797), 실제로 세포내에서의 많은 단일가닥 핵산은 염기결합 등을 통한 분자 내부에서의 상호결합을 통하여 복잡하지만 안정된 3차구조를 이룸으로써 스플라이스좀(splicesome)이나 리보좀(ribosome) 등의 특정 구조 및 기능을 이루는데 일조하고 있다. 따라서 현재까지 알려진 리보자임(ribozyme), snRNA, tRNA, 리보좀 RNA 등뿐만 아니라 아직 알려지지 않은 자연의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 등은 복잡하지만 안정된 구조를 형성하여 특정 활성을 나타낼 수 있을 것으로 보인다.

이와 같이 RNA는 단백질과 같은 특정 물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는바, 일정한 선별과 시퀀싱을 통하여 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥 RNA 올리고뉴클레오티드들의 조합된 서열의 라이브러리로부터 높은 결합력과 특이성으로 특정 표적분자와 결합할 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 발견되고 있다.

이러한 선별방법을 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponentialenrichment)라 하며(Craig et al., 1990, Science, 249, 505-510), SELEX를 통하여 자연상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 추출되고 있다.

SELEX는 ∼10¹⁵개의 다양한 염기배열을 갖는 RNA 라이브러리로부터 표적단백질과 잘 결합하는 RNA들을 골라내어 DNA로 역전사 시킨 뒤 중합효소연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)으로 증폭시킨 후 다시 RNA를 만드는 과정을 여러 번 반복하여 표적단백질과 가장 잘 결합하는 RNA를 골라내는 방법이다(Irvine et al., 1991, Journal of Molecular Biology, 222, 739-761). 즉, SELEX는 무작위 염기서열을 가진 RNA와 표적분자를 결합시킨 뒤 표적분자와 결합하는 RNA와 그렇지 않는 RNA와 분리하는 과정, 이후 표적분자와 결합하는 RNA만을 추출하는 과정, 및 추출된 RNA를 다시 증폭시킴으로써 표적분자 결합하는 RNA를 우세적으로 증폭시키는 일련의 과정으로 이루어진다.

지금까지의 HCV 감염 진단은 대상환자에서 HCV 단백질에 대한 항체 존재 여부를 ELISA 등의 방법으로 측정하여 수행하였다. 그러나 이러한 종래의 진단은 항체 생성시에 많은 비용과 시간이 소요되고, 돌연변이 종들이 많은 변이를 보이는 HCV 코트단백질을 진단에 이용함으로 진단 키트를 생산하는 회사의 제품마다 변이가 적지 않아서 HCV 감염여부에 대한 정확한 진단이 어려운 것으로 알려져 있다.

본 발명의 목적은, HCV에 의해 발현되는 증식조절단백질에 특이적으로 결합하는 RNA의 염기서열을 제공하고, 이렇게 제공된 RNA와 HCV에 의해 발현되는 증식조절단백질과의 특이적인 결합을 이용하여 HCV 감염을 진단할 수 있도록 하고자 하는 것이다.

도1은 SELEX를 거친 본 발명의 RNA 풀의 HCV 헤리카제에 대한 결합정도를 보여주는 도면,

도2는 본 발명에 따른 RNA 중 하나를 포함하는 RNA의 예상 2차구조 도면,

도3은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제에 대한 결합정도를 보여주는 도면,

도4는 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제에 대한 친화도를 보여주는 도면,

도5는 도4의 결과를 그래프화한 도면,

도6은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제의 RNA 바인딩 도메인에 미치는 영향을 보여주는 도면,

도7은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제의 ATPase 활성에 미치는 영향을 보여주는 도면,

도8은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제 RNA 언와인딩 활성억제를 보여주는 도면,

도9는 도8의 결과를 그래프화한 도면,

도10은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제와 결합하는 최소단위를 확인하는 도면,

도11은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제 NS3 사이의 상호작용을 보여주는 이스트 3-하이브리드 시스템 개략도,

도12는 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)와 세포내 HCV NS3의 결합결과를 보여주는 도면,

도13은 본 발명에 따른 RNA가 HCV NS3 발현 세포를 검출하는 것을 보여주는 도면,

도14와 도15는 본 발명에 따른 RNA의 HCV NS3 발현 세포의 결합특이성을 보여주는 도면.

본 발명에 따라 HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위와 특이적으로 결합하는 서열번호1과 서열번호2의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 포함하는 RNA가 제공된다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호1과 서열번호2의 염기서열 중 적어도 하나를 포함하는 RNA의 HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위에 대한 특이적 결합을 검출하는 것에 의해 C형 간염 간염을 진단할 수 있는 C형 간염 진단용 키트가 제공된다.

본 발명에 따른 RNA는 다양한 염기배열을 갖는 RNA 라이브러리로부터 HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 헤리카제 활성이 있는 NS3 단백질과 특이적으로 결합하는 RNA를 SELEX 방법에 의해 선별하여 그 염기서열을 결정한 것이다.

전술한 바와 같이, HCV는 헤리카제 도메인을 프로테아제 도메인과 함께 NS3 단백질 형태로 발현하는바, 본 발명에 따른 RNA가 표적으로 하는 단백질은 NS3 단백질 중 RNA 헤리카제 도메인이다.

본 발명에 따른 RNA는 매우 강력하고 높은 친화력으로 NS3 단백질의 헤리카제 도메인과 결합함으로 이를 이용하여 NS3 단백질을 발현하는 세포를 검출하여 HCV 감염을 진단할 수 있다. 즉, HCV 감염 진단 대상이 되는 피검자의 세포를 본발명의 RNA와 반응시켜 HCV 복제에 매우 중요한 기능을 하는 NS3과 본 발명의 RNA 간에 특이적인 결합을 유도해 낸 후에 이 특이적인 결합의 존재 여부를 검출함으로써 NS3 단백질의 존재 여부를 확인할 수 있고, 결국 세포내의 HCV의 존재를 검출하는 것이다.

이하, 첨부도면과 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

도1은 SELEX를 거친 본 발명의 RNA 풀의 HCV 헤리카제에 대한 결합정도를 보여주는 도면, 도2는 본 발명에 따른 RNA 중 하나를 포함하는 RNA의 예상 2차구조 도면, 도3은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제에 대한 결합정도를 보여주는 도면, 도4는 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제에 대한 친화도를 보여주는 도면, 도5는 도4의 결과를 그래프화한 도면, 도6은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제의 RNA 바인딩 도메인에 미치는 영향을 보여주는 도면, 도7은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제의 ATPase 활성에 미치는 영향을 보여주는 도면, 도8은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제 RNA 언와인딩 활성억제를 보여주는 도면, 도9는 도8의 결과를 그래프화한 도면, 도10은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제와 결합하는 최소단위를 확인하는 도면, 도11은 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)의 HCV 헤리카제 NS3 사이의 상호작용을 보여주는 이스트 3-하이브리드 시스템 개략도, 도12는 본 발명에 따른 RNA(CH2 RNA)와 세포내 HCV NS3의 결합결과를 보여주는 도면, 도13은 본 발명에 따른 RNA가HCV NS3 발현 세포를 검출하는 것을 보여주는 도면, 도14와 도15는 본 발명에 따른 RNA의 HCV NS3 발현 세포의 결합특이성을 보여주는 도면이다.

먼저, 본 발명에 따른 RNA의 서열을 결정하고 그 특징을 분석하는 방법과 HCV 감염 진단방법의 개요를 예시적으로 설명한다.

1. DNA 라이브러리의 제조

SELEX 과정을 수행하기 위한 RNA 라이브러리를 만들기 위하여 무작위 이중가닥 DNA가 필요한바, 이러한 주형은 널리 알려진 바와 같이 화학적으로 합성된 무작위 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드로부터 PCR을 통해서 제조한다. 본 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 5'과 3'쪽에 플라이머가 결합할 수 있는 염기서열이 있고 중앙의 40개 염기는 4개의 염기들(A, G, C, T)이 1:1:1:1의 비율로 들어갈 수 있도록 합성된다.

또한 PCR반응에 필요한 5'-플라이머 안에는 T₇RNA 중합효소 프로모터 서열(5'-TAATACGACTCACTATA G GGA-3'; G 는 전사개시부위)을 삽입하여 전사과정에서 T₇RNA 중합효소가 결합할 수 있게 하고 5'-플라이머와 3'-플라이머 각각에는 클로닝할 때 필요한 제한효소부위가 존재하도록 합성한다.

이렇게 합성된 5'-플라이머, 3'-플라이머 및 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 가지고 PCR를 수행하여 길이가 119mer인 5'-GGGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAGCGGAAGCGTGCTGGG-(N)₄₀-GTATTGGGTCTCCAGCTACCTAGGGGGG인 DNA 라이브러리를 제조한다. 여기에서 (N)₄₀은 A, G, C, T가 각 부위에 동등한 양으로 존재하는 40개의 염기를 의미한다.

2. RNA 라이브러리의 제조

상기 방법으로 제조한 다양한 염기서열을 갖는 DNA 라이브러리에 대해 전사과정을 통하여 약 1.8 × 10¹⁵개의 분자수를 갖는 RNA 라이브러리를 제조한다. X㎕ 이중가닥 DNA 주형, 1X 전사버퍼, 10mM DTT(Sigma사로부터 입수), 0.5 mM ATP, GTP, CTP, UTP(Boehringer Mannheim사로부터 입수), 80U RNase 인히비터(Kosco사로부터 입수), T₇RNA 중합효소, DEPC-H₂O를 100㎕ 넣어서 혼합한 후 37℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 5U DNase Ⅰ(Promega사로부터 입수)을 37℃에서 20분간 처리하여 남아있는 DNA주형을 분해시킨 후 페놀추출과 에탄올침전을 통하여 RNA를 정제한 후 TE버퍼(10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA)에 농축시킨다.

이렇게 만들어진 RNA중에서 원하는 크기의 완전한 RNA만을 얻기 위해서 RNA 용액 1/2볼륨의 변성 RNA 로딩색소(10ml 포름아미드, 10mM EDTA, 0.01% 브롬페놀블루, 0.01% 크실렌시아놀)를 혼합한 후 95℃에서 5분간 처리하여 RNA들을 변성시킨다. 변성 RNA를 요소가 들어있는 6% 폴리아크릴아미드겔에 로딩하여 0.5X TBE버퍼에 30분간 200V로 전기영동한 후 원하는 크기의 RNA 밴드가 담긴 겔을 절단하여 용출버퍼(0.6M 아세트산암모늄, 1mM EDTA, 0.2%SDS) 400㎕에 넣어서 37℃에서 3시간 동안 RNA를 용출시킨다. 용출된 RNA는 페놀추출과 에탄올침전을 통하여 정제 및 농축한 후 UV 스펙트로포토메터를 이용하여 정량한다.

3. 페놀추출 및 에탄올침전

용액과 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1)을 넣고 혼합한 뒤 상온에서 5분간 원심분리한다. 상층액을 1.5ml 튜브에 옮긴 후 2배 볼륨의 100% 에탄올과 1/10 볼륨의 3M 아세트산나트륨을 넣어서 혼합한 뒤 -70C에서 30분간 유지한다. 4℃에서 30분간 원심분리 후 에탄올을 제거하고, 70% 에탄올로 세척하고, 4℃에서 10분간 원심분리 후 다시 70% 에탄올을 제거하고, 핵산 침전물을 건조시켜 TE버퍼(또는 물)로 용해시킨다.

4. SELEX

(1). 선별

상기 RNA 라이브러리를 Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen사로부터 입수), 바인딩버퍼(30mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl 1.5mM MgCl₂, 2mM DTT, 1%BSA), 80U RNase 인히비터를 상온에서 20분간 섞어주면서 반응시킨 후 비드를 침전시켜서 비드와 비특이적으로 결합하는 RNA들을 제거한다. 비드와 결합하지 않는 RNA 상층액과 표적단백질을 상온에서 20분간 결합시킨 후 Ni-NTA 아가로스 비드를 첨가하여 상온에서 20분간 혼합하면서 반응시킨다. 표적단백질과 결합하는 RNA는 비드와 결합된 표적단백질을 침전시킴으로써 비결합 RNA와 분리시킨다. RNA-단백질-비드 복합체를 바인딩버퍼 400㎕로 3-5회 세척한 후에 페놀추출을 행하여 RNA를 용출시킨다. 용출된 RNA는 에탄올침전으로 농축시킨다.

(2). 역전사-PCR

표적단백질과 결합하는 RNA, 500nM 3'-플라이머, 1X RT버퍼를 65℃에서 5분간 변성시킨 후 상온에서 10분간 서서히 식혀서 플라이머와 RNA를 결합시킨다. 1mM dNTP(Boehringer Mannheim사로부터 입수), 25U AMV 역전사효소(Boehringer Mannheim사로부터 입수)를 첨가한 후 37℃에서 30분간 역전사 시키고 95℃에서 5분간 유지한 후에 4℃로 식혀서 효소를 변성시킨다. 합성된 cDNA에 250nM 5'-플라이머와 500nM dNTP 및 1X PCR버퍼를 첨가하고 PCR 장비를 사용하여 95℃까지 열을 가한 후 2.5U Taq DNA 중합효소(Boehringer Mannheim사로부터 입수)를 넣고 PCR반응을 20사이클 수행한다. 각 사이클마다 95℃에서 30초간 변성시키고, 55℃에서 30초간 플라이머와의 결합, 72℃에서 30초간 중합시킨다. 이렇게 얻은 이중가닥 DNA를 2.5% 아가로스겔로 확인한다.

(3). 전사

역전사 PCR로 얻은 DNA를 주형으로 하여 RNA 라이브러리를 만들 때와 같은 방법으로 전사시킨 후 다음 사이클의 SELEX를 수행한다.

5. 침전분석

(1). 바인딩분석

DNA 주형, 1X 전사버퍼, 10mM DTT, 500μM ATP, GTP, CTP, 9μM UTP, 방사성 동위원소 15μCi 32P-α-UTP 또는 32P-α-ATP, 20U RNase 인히비터, T₇RNA 중합효소를 섞은 후 37℃에서 3시간동안 전사시켜 방사선동위원소로 표지된 RNA를 합성시킨다. 1U DNase Ⅰ를 37℃에서 20분간 처리하여 남아 있는 DNA 주형을 분해시킨다. 전사된 RNA는 RNA 라이브러리를 만들 때와 같은 방법으로 6% 변성폴리아크릴아미드겔로 전기영동하여 RNA 크기 별로 분리시킨 후 방사선자동사진법(autoradiography)으로 원하는 크기의 RNA가 담긴 겔을 절단하여 RNA 라이브러리를 제조할 때와 같은 방법으로 RNA를 겔로부터 분리한 후 페놀추출과 에탄올침전으로 정제한다. 정제된 RNA는 섬광계수기(scintillation counter)로 방사성동위원소를 측정함으로써 RNA양을 정량한다. 정량된 RNA는 표적단백질과 상온에서 20분간 결합시킨 후에 Ni-NTA 아가로스비드를 첨가하고 상온에서 20분간 혼합한 후 침전시켜서 표적단백질과 결합하는 RNA와 비결합 RNA를 분리시킨다. 침전된 RNA-단백질-비드 복합체는 400㎕ 바인딩버퍼로 4회 세척하고 표적단백질과 결합한 RNA(이하, 'SE RNA' 이라 한다)는 페놀추출로 단백질과 비드로부터 분리시킨 뒤 6% 변성 폴리아크릴아미드겔로 전기영동한 후 80℃에서 1시간동안 건조시킨다. 전기영동한 RNA들은 방사선자동사진법으로 확인한다.

(2). 경쟁분석

표적단백질이 SELEX한 RNA와 특이적으로 결합하는지를 알아보기 위해 상기 바인딩분석에서 방사성동위원소로 표지된 라이브러리 RNA와 SE RNA를 표적단백질과 결합시킬 때 과량의 비표지 라이브러리 RNA, SE RNA, polyU RNA, tRNA 등을 첨가시켜서 표지 RNA들과 경쟁적으로 결합시킨다.

(3). 친화도분석

³²P로 표지된 라이브러리 RNA 및 SE RNA와 여러 농도의 표적단백질의 결합정도를 상기 바인딩분석방법으로 측정해서 도표화한 후 Kd값을 산출한다.

6. 클로닝 및 염기서열결정

(1). 클로닝

SELEX과정을 거쳐서 표적단백질과 결합한 여러 RNA들이 포함된 SE RNA 풀(pool)을 클로닝하여 각각의 RNA를 분리한다. pUC19 플라스미드와 SE RNA 풀을 모두 EcoRI(Boehringer Mannheim사로부터 입수), BamHI(Boehringer Mannheim 사로부터 입수)으로 자른 후 결합(ligation)시킨다. SE RNA가 삽입된 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션(eletroporation) 방법으로 형질전환시킨 후 암피실린(amphicillin: Sigma사로부터 입수)이 포함된 아가플레이트에서 37℃, 14시간 동안 성장시킨다. 형질전환되어 아가플레이트에 성장한 각각의 콜로니 중 수십 개를 선택하여 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)을 수행한다. 이렇게 얻은 DNA를 EcoRI과 BamHI으로 잘라서 삽입체(insert)가 들어간 클론들을 찾아낸다.

(2). 서열결정

(변성 이중가닥 주형의 준비)

플라스미드 주형 3.6㎍, 200mM NaOH, 0.2mM EDTA를 섞어서 37℃, 30분간 반응시켜서 주형을 변성시킨다. 변성된 주형은 에탄올침전을 행하여 물 8㎕로 농축시킨다.

(시퀀싱)

변성 주형, 1X T₇시쿼나제(sequenase) 반응버퍼, 120nM 플라이머(5'-AACAGCTATGACCATG-3')를 혼합한 후 65℃에서 2분간 변성시키고 30℃까지 식혀서 플라이머를 주형에 어닐링(annealing)시킨 후 얼음에 보관한다. 어닐링된 DNA 혼합물에 100mM DTT 1㎕, 희석된 라벨링 믹스 2㎕, α-³⁵S dATP 0.5㎕, 희석 T₇시쿼나제 중합효소 2㎕를 첨가한 후 상온에서 2-5분간³⁵S로 표지한다. 표지된 반응액의 3.5㎕를 각각의 종지튜브(G, A, T, C) 2.5㎕가 담긴 1.5ml 튜브에 넣고 37℃에서 5분간 반응시킨다. 정지용액 4㎕를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 3분간 끓인 후 6% 변성 폴리아크릴아미드겔로 전기영동해서 80℃에서 1시간 건조시킨다. 전기영동한 DNA 염기서열은 방사선자동사진법으로 확인한다.

7. 겔이동분석

(1).바인딩분석

³²P로 표지된 RNA 프로브를 전술한 5. 침전분석의 (1). 바인딩분석과 동일한 방법으로 제조하여 정제 및 정량한다. 정량된 RNA 프로브, 표적단백질, RNase 인히비터, 바인딩버퍼를 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시키고 로딩색소(50% 글리세롤, 0.01% 브롬페놀블루, 0.01% 크실렌시아놀)를 반응 용액의 1/2볼륨만큼 넣어 준다. 결합된 RNA-단백질 복합체는 4% 혹은 6% 비변성 폴리아크릴아미드겔에 로딩한 후 4℃에서 5시간동안 0.5X TBE버퍼 안에서 전기영동한다. 전기영동 후 겔을 80℃에서 1시간동안 건조시킨 수 방사선자동사진법으로 RNA-단백질 복합체를 확인한다.

(2). 경쟁분석

표적단백질과 결합하는 RNA들의 특이성을 알아보기 위해 표지되지 않는 경쟁자를 프로브의 수천배씩 넣어서 반응시킨다.

8. ATPase 분석

30mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 2mM DTT, 1%BSA, 40U RNase 인히비터, 1mM ATP, 1μCi³²P-α-ATP(3000Ci/mmole), 그리고 20nM HCV 헤리카제를 섞은 후 37℃에서 45분간 반응시킨다. 20mM EDTA를 넣어서 반응을 중지시키고 반응액 중 2㎕를 폴리에틸렌이민 셀룰로스 시트 상에 점을 찍어서 0.35M 인산칼륨(pH3.5)을 전개액으로 15분간 전개시킨다. HCV 헤리카제의 ATPase 활성에 대한 polyU, 라이브러리 RNA, SE RNA의 영향을 보기 위해 ATPase 반응에 각각 여러 농도의 RNA를 넣어 준다. 전개시킨 시트는 건조시켜서 방사선자동사진법으로 확인한다.

9. 헤리카제 분석

(1). 부분이중 RNA 기질제조

긴 가닥의 RNA는 pvuⅡ(Boehringer Mannheim사로부터 입수)로 절단한 psk(-)△ sacⅡ-HincⅡ(Jang S. K. lab.으로부터 입수)를 가지고 T₇RNA 중합효소를 이용하여 32P-α-UTP(3000Ci/mmole)로 표지한다. 짧은 가닥의 RNA는 BamHI으로 자른 psk(-)(Jang S. K. lab.으로부터 입수)를 T₃RNA 중합체(Kosco사로부터 입수)로 전사시킨다. 각각의 RNA는 DNase Ⅰ로 남아있는 DNA 주형을 제거하고 페놀추출 및 에탄올침전으로 정제한다. 정제된 RNA는 잡종형성버퍼(20mM Hepes-KOH, pH7.6, 0.5M NaCl, 1mM EDTA, 01% SDS)에 긴 RNA와 짧은 RNA를 1:3의 비율로 섞는다. 섞은 RNA들은 5분간 끓인 후 65℃에 30분간 식혀서 변성시키고 상온에서 12시간 유지하여부분이중 RNA로 결합시킨다. 만들어진 부분이중기질은 6% 비변성 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동 후 방사선자동사진법으로 밴드를 확인하여 기질이 있는 겔을 절단하여 라이브러리 RNA를 만들 때와 같이 RNA를 추출, 정제 및 정량한다.

(2). 헤리카제 분석

25mM Mops-KOH(pH6.5), 3mM MgCl₂, 2mM DTT, 0.01% BSA, 40U RNase 인히비터, 1nM 헤리카제 그리고 0.25nM³²P-α-표지된 부분이중 RNA 기질을 섞어 상온에서 15분간 사전반응 시킨 후 5mM ATP를 첨가하여 37℃에서 30분간 헤리카제 반응시킨다. HCV 헤리카제의 헤리카제기능에 대한 polyU, SE RNA, tRNA의 영향을 알아보기 위해 여러 농도의 RNA들을 헤리카제 반응에 첨가한다. 1X 종지버퍼(0.1M Tris-HCl, pH7.4, 20mM EDTA, 0.5% SDS, 0.1% NP-40, 0.01% 브롬페놀블루, 0.01% 크실렌시아놀, 50% 글리세롤)를 첨가하여 헤리카제 반응을 정지시킨다. 6% 비변성 폴리아크릴아미드겔 상에 4℃에서 4시간동안 전기영동한 후 80℃에서 1시간동안 말려서 방사선자동사진법으로 기질의 분리를 관찰한다.

10. 이스트 3-하이브리드 분석

(1). 하이브리드 RNA의 제조

5'-AAACCCGGGAGAGCGGAAGCGTGCTG-3',5'-AAACCCGGGGGGGATGTCCACTGAGCCATGAAC-3'의 두 플라이머와 HCV 헤리카제에 대해 SELEX한 RNA를 코딩하는 플라스미드(이하, 'CH2' 라 한다)로 PCR을 수행한 후 smaⅠ으로 잘라서 삽입체를 만들고, pⅢA/MS2-2(7)(Jang S. K. lab.으로부터 입수)(Dhruba et al., 1996, PNAS, 93,8496-8501)도 smaⅠ으로 잘라서 벡터를 만들어 두 DNA를 결합시킨다. 삽입체가 들어간 플라스미드를 E.coli(JM109)에 일렉트로포레이션 방법으로 형질전환시킨 후 암피실린이 포함된 아가플레이트에서 37℃, 14시간동안 성장시킨다. 형질전환되어 아가플레이트에 자란 각각의 콜로니 중 100개를 선택하여 미니-프레퍼레이션을 수행한다. 이렇게 얻은 DNA를 E.coRi로 잘라서 삽입체가 들어간 클론들을 찾아낸다. 이 클론들의 플라스미드를 다시 미니-프레퍼레이션하여 전술한 DNA 라이브러리의 제조의 5' 플라이머를 가지고 시퀀싱을 해서 센스 CH2 RNA가 들어간 것과 안티-센스 CH2 RNA가 들어간 것을 각각 얻는다.

(2). 이스트 3-하이브리드

이스트 균주 L40-코트(Jang S. K. lab.로부터 입수)를 YEPD 배지에 깔아서 30℃에서 3-4일 키워서 활성화시킨다. 형질전환시킬 DNA 세트를 각각 300ng정도씩 1.5ml 튜브에 넣고 DNA 운반자인 살몬 테스티스(salmon testes) DNA 1.8㎕를 같이 투입한다. 활성화시킨 이스트를 원스텝버퍼(200mM 아세트산리튬, pH7.5, 100mM DTT, 35% 폴리에틸렌글리콜) 1ml에 백금선을 이용하여 4회에 걸쳐 풀어서 1분간 볼텍스로 섞은 후 100㎕씩 따서 DNA가 들어있는 각각의 1.5ml 튜브에 넣어서 혼합한다. 10분간 섞은 후 44℃에서 1시간 동안 형질전환시킨다. 형질전환시킨 이스트는 SD(Leu-, Ura-)배지에 깔아서 30℃에서 3-4일간 성장시킨다. 형질전환되어 SD(Leu-, Ura-)배지에서 자란 이스트 콜로니를 멸균된 여과지로 옮긴 다음 액체 질소로 이스트를 파괴시킨다. 이 여과지에 Z버퍼(0.06M Na₂HPO₄·7H₂O, 0.04M NaH₂PO₄·H₂O,0.01M KCl, 0.001M MgSO₄·7H₂O, pH7.0), x-gal, β-메르캅토에탄올 혼합액 2.5ml을 넣은 후 30℃에서 배양하면서 콜로니의 색을 관찰한다.

11. HCV 감염 진단방법

이상의 과정을 통해 탐색하고 분석한 본 발명의 RNA를 비오틴(biotin)으로 라벨링한 후 표적단백질을 발현하고 있는 세포와 반응 후 비오틴과 강력히 결합하는 스트렙토아비딘(streptoavidin)과 반응시킨다. 이때 스트렙토아비딘에는 알칼리성 포스파타제(AP)가 표시되어 있음으로, 세포내 단백질- 본 발명의 RNA의 복합체(비오틴-스트렙토아비딘, AP 복합체)가 형성된 경우 AP 효소활성에 의해 발색반응이 일어나며, 이로써 본 발명의 RNA를 이용하여 표적단백질을 발현하는 세포만을 탐지한다.

(1). RNA의 라벨링

본 발명의 RNA를 함유하고 있는 플라스미드(CH2)를 제한효소로 이용하여 선형화시키고, T₇RNA 중합효소를 이용하여 전사시킨다. 다음에 주형 RNA 121 μM ( 1㎕), 5×반응버퍼 6㎕, 1mM 비오틴-dUTP 15㎕, 25mM CoCl₂6㎕, RNase 인히비터 1 ㎕ (40 U), TdT(말단 데옥시뉴클로오티드 전달효소) 1 ㎕ (20 U)을 넣어 혼합한 후 37℃에서 30 분 동안 반응시킨다. 이후 0.5M EDTA 1.2㎕를 첨가하여(글리세롤 1㎕를 캐리어로 첨가) 에탄올침전을 통해 농축시킨 후 RNA TE 버퍼 20㎕에 녹여 보관한다.

(2) 세포내 HCV NS3 단백질의 검출

테트라사이클린(tetracycline: Tet)의 조절 하에 NS3을 발현하는 SAOS-2 세포를, Tet 존재조건(NS3을 발현하지 못하는 조건)과 Tet 부재조건(NS3의 발현이 이루어지는 조건)하에 48시간 동안 디쉬(dish)에서 배양한다. 이때 0.1% 젤라틴(100㎕)을 이용하여 커버슬립렌즈를 디쉬에 고정시키며, 이후 젤라틴은 진공으로 흡입해 제거하고 세포 메디아를 진공으로 제거한 후 PBS로 세척한다. 그리고 70% EtOH 2㎖에 렌즈를 투입하여 10분 이상 유지하여 세포를 고정시키고, 다시 1 ×PBS로 세척한다. 투과공정으로 1% 트리톤(triton)의 PBS 2㎖를 투입하여 10분 내지 15 정도 방치하고, 다시 0.1% 트리톤의 PBS로 세척한 후에 50㎍ tRNA를 이용하여 비특이적으로 본 발명의 RNA와 결합하는 단백질을 차단한다. 이때 차단용액의 조성으로는 tRNA 5㎕(50㎍), RNase 인히비터 1㎕ 및 바인딩버퍼 14㎕의 혼합액을 사용하고 렌즈 위에 적하하여 상온에서 30분 내지 1 시간 반응시키는 방법으로 실행하며, 이후 바인딩버퍼(W/O BSA)로 5분씩 3회 내지 5회 세척한다. 그리고 비오틴-표지된 본 발명의 RNA와 컨트롤 RNA 각각 1㎕(0.1 pmole), RNase 인히비터 1㎕ 및 바인딩버퍼 18㎕의 혼합액을 렌즈 위에 각각 적하하여 30분 내지 1시간 반응시키고, 바인딩버퍼(w/o BSA)로 5분씩 3회 내지 5회 세척한다. 스트렙토아비딘-AP(알칼리성 포스파타제)를 1:150의 비율로 RNase 인히비터 1㎕ 함유된 바인딩버퍼에 섞어서 20 ㎕씩 렌즈 위에 떨어뜨린 후 상온에서 30분 내지 1시간 정도 반응시키고, 바인딩버퍼(w/o BSA)로 열 번 이상 세척한다. 마지막으로 AP에 반응할 수 있는 50:1로 0.1M Tris버퍼(pH8.5), 0.05M MgCl_2,0.1M NaCl으로 희석한 기질 NBT/BCIP20㎕와 1시간정도 반응시킨 후 발색여부를 검사한다.

실시예1: HCV 헤리카제에 특이적 결합하는 RNA

(SELEX)

앞서 설명한 바와 같이 약 1.8 X 10¹⁵개의 무작위 RNA 라이브러리로부터 21회의 SELEX을 수행하였다. 본 SELEX에서 아래의 표1과 같이 RNA와 단백질의 비율을 조절함으로써 단백질에 더 잘 결합하는 RNA만을 증폭시켰다.

cycles	RNA(nM)	HCV헤리카제(nM)	RNA:헤리카제
1	1,500	150	10:1
2	500	150	3.3:1
3	500	150	3.3:1
4	500	150	3.3:1
5	710	150	4.7:1
6	500	150	3.3:1
7	885	150	5.9:1
8	760	75	10:1
9	1,455	15	97:1
10	450	15	30:1
11	450	1.49	302:1
12	600	1.5	400:1
13	400	1.5	267:1
14	500	0.3	1667:1
15	480	0.3	1600:1
16	640	0.3	2133:1
17	540	0.3	1800:1
18	640	0.06	10667:1
19	535	0.06	8917:1
20	585	0.06	9750:1
21	560	0.06	9333:1

(바인딩분석)

21회의 SELEX를 거친 본 발명의 RNA 풀과 SELEX 전의 RNA 라이브러리를³²P로 표지한 후 침전반응을 통해서 그 결합정도를 확인하였으며, 그 결과는 도1과 같다.도시된 바와 같이 침전반응 결과 SELEX를 거친 RNA 풀(SE RNA: 우측)이 RNA 라이브러리(좌측)보다 월등하게 HCV 헤리카제와 결합하였다.

(클로닝과 염기서열결정)

HCV 헤리카제와 특이적인 결합을 보이는 것을 SELEX한 본 발명의 RNA 풀을 클로닝하여 RNA의 염기서열을 결정하였다. 결정된 RNA의 염기서열은 서열번호1 및 서열번호2로 나타내었다. 서열번호1은 HCV 헤리카제와 최적의 특이적 결합을 나타내는 RNA의 염기서열이고, 서열번호2는 HCV 헤리카제와 결합할 수 있는 최소의 단위의 RNA의 염기서열이다. 서열번호1과 서열번호2에서 29번과 33번은 G 또는 A(R로 표시)이고, 서열번호2에서 56은 U 또는 C(Y로 표시)이다.

(클론된 RNA의 2차구조)

염기서열이 결정된 상기 본 발명의 RNA들에 대하여 "mfold" 컴퓨터프로그램을 통해 예측된 RNA 2차구조는 도2에 예시된 바와 같이 모두 동일하였으며, 이들 염기서열의 RNA를 'CH2 RNA'로 명명하여 이후의 실험을 행하였다.

(CH2 RNA의 바인딩분석과 경쟁분석)

하기의 표2에 표시된 바와 같은 내용으로 반응시켜³²P로 표지한 라이브러리 RNA와 CH2 RNA(프로브)의 침전반응을 통해 바인딩분석을 실시하였으며, 그 결과는 도3과 같다. 도시된 바와 같이 CH2 RNA가 HCV 헤리카제에 훨씬 잘 결합함을 알 수 있다(A측 레인 1-6). 또한³²P로 표지한 CH2 RNA와 HCV 헤리카제의 결합에 비표지 라이브러리 RNA와 CH2 RNA를 프로브의 5,000배정도 넣어서 경쟁적으로 결합시켰는바 라이브러리 RNA는 CH2 RNA와 헤리카제의 결합에 영향을 주지 못하는 반면(A측의 레인 7), CH2 RNA는³²P표지한 CH2 RNA와 헤리카제의 결합을 경쟁적으로 방해하였다(A측의 레인 8). 또한³²P표지한 CH2 RNA와 HCV 헤리카제의 결합에 polyU, tRNA이 경쟁적으로 결합하는지를 알아보기 위해 6,700배의 비표지 polyU, tRNA를 투입하였는바³²P표지 CH2 RNA와 헤리카제의 결합에 큰 영향을 주지 못함을 볼 수 있었다(B측의 레인 4, 5). 반면 비표지 CH2 RNA는 분량 의존적으로 헤리카제와 표지 CH2 RNA간의 결합을 방해하였다(B측의 레인 6, 7).

	1	2	3	4	5	6	7	8		1	2	3	4	5	6	7
Library RNA(350pM)	+	+	+	-	-	-	-	-	CH2RNA(95pM)	+	+	+	+	+	+	+
CH2 RNA(350pM)	-	-	-	+	+	+	+	+	HCV helicase(80nM)	-	-	+	+	+	+	+
Ni-NTA bead	-	+	+	-	+	+	+	+	Ni-NTA bead	-	+	+	+	+	+	+
HCV helicase(160nM)	-	-	+	-	-	+	+	+	Cold polyU(655nM)	-	-	-	+	-	-	-
HCV helicase(160nM)	-	-	+	-	-	+	+	+	Cold tRNA(655nM)	-	-	-	-	+	-	-
Cold library RNA(1.7μM)	-	-	-	-	-	-	+	-	Cold CH2 RNA(655nM)	-	-	-	-	-	+	-
Cold CH2 RNA(1.7μM)	-	-	-	-	-	-	-	+	Cold CH2 RNA(65.5nM)	-	-	-	-	-	-	+

(HCV 헤리카제에 대한 CH2 RNA의 친화도)

³²P로 표지한 라이브러리 RNA와 CH2 RNA의 결합 정도를 알기 위해 150pM, 440pM, 1.3nM, 4nM, 11.9nM, 35.6nM, 106.7nM, 320nM, 960nM의 헤리카제를 가지고 침전반응을 수행하였다(도4). 라이브러리 RNA는 높은 농도의 헤리카제와 결합하는반면(도4의 A), CH2 RNA는 낮은 농도의 헤리카제와도 높은 결합을 나타내었다(도4의 B). 이 결과를 도5와 같이 도표화하여 Kd를 산출하였는바, CH2 RNA의 Kd는 990pM정도로 라이브러리 RNA보다도 1,000배 이상 잘 결합함을 알 수 있다.

(CH2 RNA가 HCV 헤리카제의 RNA 바인딩 도메인에 미치는 영향)

HCV 헤리카제의 구조는 RNA 바인딩 도메인, NTPase 도메인, 헤리카제 도메인으로 구성되는 바, CH2 RNA가 HCV 헤리카제의 RNA 바인딩에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 하기의 표3과 같은 내용으로 비특이적인 261mer의 기질 RNA(상기 헤리카제 분석의 긴 기질)를³²P로 표지하고 HCV 헤리카제와 결합시켜서 겔이동분석을 수행하였다. 이때 비표지 CH2 RNA, polyU, 라이브러리 RNA를 각각 80배를 넣어서 경쟁적으로 결합시켰으며, 그 결과는 도6에 도시하였다. CH2 RNA와 polyU는 경쟁적으로 HCV 헤리카제와 결합하는 반면(레인 4, 5), 라이브러리 RNA는 그렇지 못하였다(레인 6). PolyU는 HCV 헤리카제와 결합하여 헤리카제의 NTPase 활성을 높이는 RNA로 알려져 있다(Tai et al., 1996, Journal of Virology, 70, 8477-8484).

	1	2	3	4	5	6
520pM hot substrate RNA	+	+	+	+	+	+
3nM cold substrate RNA	+	+	+	+	+	+
20nM HCV helicase	-	+	+	+	+	+
4.2nM CH2 RNA(X8)	-	-	+	-	-	-
42nM CH2 RNA(X80)	-	-	-	+	-	-
42nM polyU RNA(X80)	-	-	-	-	+	-
42nM library RNA(X80)	-	-	-	-	-	+

(CH2 RNA가 HCV 헤리카제의 ATPase 활성에 미치는 영향)

PolyU, 라이브러리 RNA, CH2 RNA가 HCV 헤리카제의 ATPase 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 ATPase 분석을 수행하였으며 그 결과는 도7과 같다. PolyU는 알려진 바대로 HCV 헤리카제의 ATPase 활성을 분량 의존적으로 증가시켰으나(레인 3-9), 라이브러리 RNA와 CH2 RNA는 큰 영향을 주지 못하였다(레인 10-19).

(CH2 RNA의 HCV 헤리카제 RNA 언와인딩 활성억제)

CH2 RNA, PolyU, tRNA가 HCV 헤리카제의 RNA 언와인딩 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 헤리카제 분석을 수행하였으며 그 결과는 도8과 같다. CH2 RNA는 HCV 헤리카제의 RNA 언와인딩을 특이적으로 방해하는 반면(레인 5-9), polyU와 tRNA는 그렇지 못하였다(레인 10-19). 이것을 도표화하여 도9에 도시하였는바, CH2 RNA가 헤리카제와 잘 결합한다고 알려진 polyU보다도 약 10배정도 HCV 헤리카제의 헤리카제 활성을 억제하는 것을 알 수 있다.

(HCV 헤리카제와 결합하는 CH2 RNA의 최소단위)

HCV 헤리카제와 결합하는 CH2 RNA의 최소단위를 알아보기 위해 CH2 RNA의 컴퓨터로 예상한 2차구조(도2 참조) 중 여러 부위를 포함하는 RNA들을 PCR을 통해서 제조하여 각각에 대하여 침전반응을 실험하였다(도10 참조). 도시된 바와 같이, 각각의 RNA를 침전반응을 통해 알아본 결과 HCV 헤리카제와 결합할 수 있는 최소의 단위는 CH2 RNA의 1-45번까지의 염기를 갖고 있는 RNA이었다. 하지만 1-66번까지의 RNA와 1-45번까지의 RNA의 결합 정도는 1-66번까지의 RNA가 훨씬 컸다. 이것으로 보아 19-42번까지의 스템-루프 구조가 HCV 헤리카제와의 결합에 중요하고 45-66번의 스템-루프구조는 그 안정성에 관여하는 것으로 추정된다.

(CH2 RNA와 HCV NS3의 세포내에서의 결합)

세포내에서 CH2 RNA와 HCV NS3(세린 프로테아제 + 헤리카제)과의 결합을 알아보기 위해 이스트 3-하이브리드 시스템(도11 참조)을 이용하였다. 본 시스템은 β-갈락토시다제를 발현하는 리포터 유전자의 조절부위에 결합하는 단백질(LexA)과 MS 코트단백질이 붙어있는 하이브리드 단백질을 발현하는 DNA와 MS2 RNA-RNAX를 발현하는 DNA, RNAX의 표적단백질과 리포터 유전자를 활성화시키는 활성 도메인이 결합된 하이브리드 단백질을 발현하는 DNA를 이스트에 형질전환시켜서 RNAX와 표적단백질이 결합을 하면 β-갈락토시다제 발현이 활성화되어 x-gal을 처리하였을 때 파란색을 띠게 된다. 본 실시예에서는 LexA-MS2 코트 하이브리드 단백질을 항상 발현하는 이스트 균주 L-40 코트를 사용하였고 여기에 표4와 같은 DNA 세트를 형질전환시켰다. IRE(Iron Response Element)와 IRP(Iron Regulatory Protein)는 특이적으로 잘 결합하는 것으로 알려져 있어 포지티브(정) 제어(positive control)로 사용하였다. 그 결과는 도12에 도시하였으며, 도시된 바와 같이 형질전환시킨 이스트 콜로니를 파괴해서 x-gal을 처리하였을 때 CH2 RNA-NS3이 들어간 세트는 포지티브 제어인 IRE-IRP보다는 푸른색을 덜 띠었지만 네거티브(부) 제어(negative control)인 NO RNA-NS3, 안티 센스 CH2 RNA-NS3 세트보다는 우세하게 푸른색을 띠었다.

	하이브리드 RNA	하이브리드 단백질
1	MS2	AD-NS3
2	CH2-MS2	AD-NS3
3	2CH-MS2	AD-NS3
4	IRE-MS2	AD-IRP

실시예2: 본 발명의 RNA에 의한 HCV NS3 단백질 발현세포 검출

(실시예2-1)

본 발명의 RNA가 HCV NS3을 발현하는 세포를 검색할 수 있는지를 실험하였다. 즉, SAOS-2 세포를 테트라사이클린 존재조건(B, D; NS3을 발현 못함) 또는 테트라사이클린 부재조건(A, C, E; NS3을 발현함)에서, 본 발명의 RNA가 없는 것(A), 비오틴-표지한 컨트롤 RNA(myasthenic antibody의 RNA: Lee et al., 1997, Nature Biotechnology, 15, 41-45)를 투입한 것(B, C), 및 본 발명의 RNA을 투입한 것(D, E)에 대하여 각각 48 시간 배양하고 고정시켜 발색 반응시켰고, 그 결과는 도13에 나타내었다. 도13에서 보는 바와 같이, NS3이 발현되지 못한 경우(B ,D), 본 발명의 RNA가 없는 경우(A)와 컨트롤 RNA와 반응한 경우(C)에는 세포가 NS3을 발현하는 것과 상관없이 어떠한 발색반응도 보이지 않았으며, 이것으로 본 발명의 RNA가 비특이적으로 고정된 세포와는 결합하지 않음을 알 수 있다. 반면에 NS3이 발현된 상태에서 본 발명의 RNA가 있는 경우(E)에는 상호 간의 특이적 결합으로 인하여 명백한 발색반응을 유발함을 볼 수 있다. 이와 같은 결과로 볼 때 본 발명에 따른 RNA로 HCV NS3 단백질 발현 세포를 감지할 수 있음을 알 수 있다.

(실시예2-2)

SAOS-2 세포를 테트라사이클린의 존재조건(B)과 부재조건(A, C-H) 하에서 비오틴 표지된 본 발명의 RNA와 함께 배양 및 고정하였다. 이때 경쟁자로서 과량의 비오틴 비표지된 본 발명의 RNA(C: 30배, E: 300배, G: 3,000배) 및 컨트롤 RNA(D:30배, 300배, 3,000배)를 함께 배양하였으며, 그 결과는 도14와 같다. 도시된 바와 같이, 과량의 컨트롤 RNA를 경쟁자로 함께 반응시켜도 본 발명의 RNA와 세포간의 결합에는 아무 영향을 끼치지 못하는 반면(D, F, H), 비표지의 본 발명의 RNA를 경쟁자로 함께 반응시킨 때에는 분량 의존적으로(양을 증가시킴에 따라) 비오틴-표지한 본 발명의 RNA와 세포간의 결합이 방해됨을 알 수 있다(C, E, G). 이와 같은 결과로 볼 때 본 발명의 RNA에 의해 NS3을 발현하는 세포를 탐지할 수 있었던 이유는 NS3 단백질을 발현하는 세포와 본 발명의 RNA 간의 특이결합에 의한 것임을 알 수 있다.

(실시예2-3)

SAOS-2 세포를 테트라사이클린의 존재조건(B)과 부재조건(A, C, D) 하에서 본 발명의 RNA를 고정시킨 세포와 반응시키기 전에 우선 본 발명의 RNA를 NS3 단백질(C), 임의의 다른 단백질(myasthenic antibody의 단백질: Lee et al., 1997, Nature Biotechnology, 15, 41-45)(D) 및 단백질 없는 RNA(A)와 사전 반응시킨 후 고정된 세포와 반응시켰으며, 그 발색반응 결과는 도15와 같다. 도15에 나타난 바와 같이 다른 단백질과 사전 반응시킨 RNA의 경우(D)와 단백질 없는 RNA(A)는 본 발명의 RNA에 의한 세포와의 결합에 아무런 영향을 끼치지 못하였으나, NS3 단백질(C)과 사전 반응시킨 본 발명의 RNA 경우는 세포와 결합되지 못함을 보이고 있다. 이것은 본 발명의 RNA가 특이적으로 NS3 단백질을 발현하는 세포와 결합하는 것이 바로 NS3 단백질과 특이하게 결합하여 생긴 현상임을 나타내는 것이다.

이상의 실시예2의 결과로부터 본 발명의 RNA가 세포 내 NS3 헤리카제 단백질을 탐지함으로써 HCV 감염을 진단할 수 있는 키트(시약)으로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 RNA를 이용하여 이 RNA와 결합하는 NS3 헤리카제 단백질을 발현하는 세포만을 특이적으로 검출할 수 있는 것이므로, 본 발명의 RNA를 이용한 HCV 감염 진단은 기존의 고전적인 방법인 항체를 이용한 탐지방법에 비하여, 본 발명의 RNA는 실험관에서 쉽게 만들 수 있다는 점과 본 발명의 RNA는 매우 높은 결합력과 친화도를 갖고 HCV의 NS3 헤리카제 단백질과 결합한다는 점으로 인하여 HCV 감염 진단에 많은 이점이 예상된다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 RNA와 이를 이용한 HCV 감염 진단용 키트는, HCV에서 돌연변이가 최소화되어 있는 증식조절단백질인 HCV 발현 헤리카제 활성의 NS3 단백질과 본 발명의 RNA와의 특이적인 결합을 검출하는 방법에 의하여 HCV 감염을 진단하는 것이므로, 기존의 항체를 이용한 방식의 HCV 감염 진단법이 돌연변이 종들에서 많은 변이를 보이는 HCV 코트단백질을 이용함으로써 항체 생성에 많은 비용과 시간을 소요하였고 돌연변이에 따른 변이로 인하여 정확한 진단이 어려웠던 점에 비하여, 보다 저렴하고 정확성 있는 HCV 감염 진단방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위와 특이적으로 결합하는 서열번호1과 서열번호2의 염기서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA.
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HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위와 특이적으로 결합하는 서열번호1과 서열번호2의 염기서열 중 적어도 하나를 포함하는 RNA를 함유하고, HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위와의 상기 RNA의 특이적 결합을 검출하여 HCV 감염을 진단하는 것에 사용되는 것을 특징으로 하는, HCV 감염 진단용 키트.