CN102798686A - 氧化分解后的白朮挥发油的hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药材中抗癌有效成分指纹图谱的建立方法，具体是一种氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的建立方法，包括：供试品溶液的制备、混合对照品溶液的制备、指纹图谱的制作，通过对4个产地的氧化分解后的白朮挥发油HPLC指纹图谱对比，确定了其共有峰。采用本发明所提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，可有效地表征氧化分解后的白朮挥发油的质量，有利于控制氧化分解后的白朮挥发油的药用原料、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材中抗癌有效成分指纹图谱的建立方法，具体是一种氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的建立方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
白朮为临床常用中药之一，为菊科植物白朮(Atractylodes macrocephala Koid.)的干燥根茎，主产于浙江、安徽等地。白朮挥发油是白朮抗肿瘤活性部位，在白朮中约含1.4%，挥发油中约含40种不同化学物质，含量最高的成分是苍术酮，占挥发油总量的60%。
目前，多采用气相色谱法对白朮挥发油中的化学成分及其相对含量进行分析。但是，白朮挥发油与其他药材挥发油明显不同，白朮挥发油中苍朮酮的性质不稳定，易发生氧化分解，采用气相色谱对白朮挥发油进行分析测定过程中，测定程序的升温过程会对挥发油中不稳定成分及苍朮酮的稳定造成影响，氧化分解前、后的GS-MS色谱图明显不同。查阅文献可知，有采用HPLC法，对氧化分解前白朮挥发油中单一成分—苍朮酮的定量分析；在指纹图谱的研究中，有报道采用GS法探讨了不同提取方法得到的挥发油其色谱结果差异；采用直观推导式演进特征投影算法，比较不同产地白朮挥发油GS-MS数据，以白朮挥发油质控表征白术药材的质量控制；采用高效毛细管电泳法比较了不同产地白朮药材指纹图谱差异，建立白朮药材指纹图谱分析方法。
目前白朮挥发油药用研究主要是集中在氧化分解前的白朮挥发油，焦点是如何阻止其中含量多、性质不稳定成分—苍朮酮的氧化分解。但是上述对氧化分解前白朮挥发油的质量评价方式单一，不足以系统、全面的表明氧化分解后的白朮挥发油的整体质量，亟需探索可全面反映氧化分解后的白朮挥发油质量的标准控制手段。
发明内容
本发明旨在提供一种氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的建立方法，为氧化分解后的白朮挥发油的药用原料、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量控制提供依据。
本发明是通过以下技术方案实现的：氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，所述的氧化分解后的白朮挥发油为：由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）混合对照品溶液的制备：用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液；
（3）指纹图谱的制作：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长200nm～240nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解可通过多种方式，例如室外光照及室外非光照下放置，室内适宜温度加热或室内放置等。本发明所述的氧化分解的方式：由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。本发明所述的氧化分解方式使得白朮挥发油中的不稳定成分完全氧化分解，氧化分解后的白朮挥发油各成分相对稳定。
所述的指纹图谱建立方法中进行高效液相色谱分析时，最佳采样时间为40min。
所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg·mL-1的溶液，此溶液为对照品溶液；
（3）苍朮酮分解率的检测：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
进一步，本发明采用同一个氧化分解前的白朮挥发油供试品，以苍朮酮的最大吸收波长220nm为检测波长，比较各流动相获得的苍朮酮峰面积，确认流动相乙腈-水作为氧化分解前、后的白朮挥发油的HPLC色谱条件更加科学。
进一步，按照本发明所述的建立方法，使用选定的、不同的检测波长进行高效液相分析，对不同检测波长下的色谱数据进行汇总分析，确定了200nm～240nm之间的任意检测波长均可体现氧化分解后的白朮挥发油中各物质的相对含量。
进一步，本发明选取不同产地的白朮药材，提取挥发油，获得氧化分解后的白朮挥发油，按本发明所述的方法进行高效液相色谱分析，通过210、220、240nm三个选定的检测波长，采集、分析及比较色谱图，确定了其共有模式。
在以下的实验中，未详细描述的各种过程、方法、仪器、试剂是本领域公知的常规方法。
实验1：流动相的选择对比考察
1.1仪器与试剂：
高效液相色谱仪，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，三组流动相分别为：
Ⅰ组：流动相A为甲醇，B为水；
Ⅱ组：流动相A为乙腈，B为水；
Ⅲ组：流动相A为体积比为60:40的甲醇-乙腈，B为水。
1.2分析方法：色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A与B的体积比为70:30，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，70%A→100%A。
1.3供试品溶液的制备
白朮药材干燥根茎，粉碎，粉末颗粒100%过20目筛；采用超临界二氧化碳萃取法（SPE法），萃取得到白朮挥发油；用乙腈溶解白朮挥发油配制成1.5mg·mL-1的溶液。
1.4 HPLC结果
三组流动相的色谱结果见图1至图3。
色谱结果分析：
1)由图1看出，色谱基线漂移严重，成45度倾斜。实验过程记录表明，柱压很高，在200Pka以上。苍朮酮的峰面积1190。
2）由图2看出，色谱基线相对平稳。实验过程记录表明，柱压较低，由113Pka梯度前变成50Pka梯度后。苍朮酮的峰面积2236。
3）由图3看出，色谱基线漂移严重，成35度倾斜。实验过程记录表明，柱压由梯度前的142Pka变成梯度后121Pka。苍朮酮的峰面积1413。
4）Ⅲ组流动相的苍朮酮的峰面积1413与Ⅰ组的相比，苍术酮的峰面积增加18.74%；Ⅱ组流动相的苍术酮的峰面积2236与Ⅰ组的相比，苍术酮的峰面积增加87.90%。
据此认为，Ⅱ组（流动相A为乙腈，B为水）流动相较Ⅲ组和Ⅰ组流动相的灵敏度更高，柱压低，基线平稳。选择Ⅱ组（流动相A为乙腈，B为水）流动相作为挥发油色谱图采集更加科学。
实验2：不同检测波长的高效液相色谱法指纹图谱分析考察
2.1白朮挥发油的提取
白朮药材干燥根茎，粉碎，粉末颗粒100%过20目筛；采用超临界二氧化碳萃取法（SPE法），萃取得到白朮挥发油。
2.2氧化分解后的白朮挥发油的制备
2.2.1白朮挥发油的处理：由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。
2.2.2所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg·mL-1的溶液，此溶液为对照品溶液；
（3）苍朮酮分解率的检测：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
直到苍朮酮的分解率达到100%，得到氧化分解后的白朮挥发油。
2.3供试品溶液的制备
精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液。
2.4混合对照品溶液的制备：
用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.5指纹图谱分析
2.5.1供试品溶液的指纹图谱分析
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长为200nm～240nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
2.5.2混合对照品溶液的指纹图谱分析
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长210nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B。在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
2.6色谱图处理
色谱图积分条件设置：峰高≥2，峰面积≥10，保留时间5min之前的峰定为试剂峰。
2.7色谱结果
在上述色谱条件下，采集的检测波长分别为200nm、205 nm、210 nm、215 nm、220 nm、230 nm、240nm的供试品溶液色谱图以及检测波长为210 nm的混合对照品溶液色谱图见图11，图中：1-白朮内酯Ⅲ，2-β-桉叶醇，3-白朮内酯Ⅰ，4-苍朮酮，5-β-榄香烯；各检测波长采集的色谱图见图4至图11。对图4至图10中的色谱数据进行汇总，结果见表1。
表1 不同检测波长的色谱分析结果
1）随着检测波长由200nm不断递增，特征色谱峰的数量和总面积也在不断减少。220nm是一个分界点，以此开始，特征峰的总面积变化很大；保留时间在25min之后，没有特征峰出现。
2）在检测波长200nm—240nm之间，特征峰的色谱分离度均大于1.08；而在205nm之后，特征峰的色谱分离度均大于1.30。
3）不同检测波长下的特征峰总面积差别极大。最高的与最低的相比较，相差2.58倍。各特征图谱中特征峰峰面积的百分比之和大于95%。
4）各检测波长获得的色谱图与混合对照品色谱图进行比较，可以确定分解后挥发油中含有白术内酯Ⅲ、桉叶醇和白术内酯Ⅰ。由此，可以以这三个化学成分中的任意一个为参照峰，对分解后挥发油开展特征指纹图谱的研究工作。
据此认为，在我们的色谱条件下，采用检测波长在200nm--240nm之间中的任一波长，采集色谱图，所得到的指纹图谱均可体现氧化分解后的白朮挥发油中各物质的相对含量。
实验3：采样时间的确定实验
3.1供试品溶液的制备
同实验2中2.3的供试品溶液。
3.2色谱图采集
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长210nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl进样量，进行高效液相色谱分析，采样120min。
3.3实验结果
由图12所示，所述的指纹图谱建立方法中进行高效液相色谱分析时，最佳采样时间为40min。
实验4：氧化分解前、后的白朮挥发油的色谱对比
4.1供试品溶液的制备
氧化分解前的白朮挥发油供试品溶液的制备同实验1中的1.3；氧化分解后的白朮挥发油供试品溶液的制备同实验2中的2.3。
4.2对照品溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg·mL-1的溶液，此溶液为对照品溶液。
4.3分析方法
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长210nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
4.4色谱结果
色谱结果见图13、图14。图15为氧化分解前、后的白朮挥发油色谱图比较图。图15中S1:氧化分解前的白朮挥发油，S2:氧化分解后的白朮挥发油。图13-14色谱结果主要数据分析汇总见表2：
表2 氧化分解前、后的白朮挥发油主要色谱结果比较
| 项目 | 特征峰数量 | 色谱峰峰面积占总峰面积百分比% | 分离度范围 | 归一化后总色谱峰面积 |
| 氧化分解前 | 13 | 0.45--36.99 | 1.71—19.76 | 2904 |
| 氧化分解后 | 11 | 1.89--40.54 | 1.34—29.11 | 1209 |
结合表2与图13-15，可以看出氧化分解前的白朮挥发油与氧化分解后的白朮挥发油的色谱图明显不同，表明其化学成分产生了较大的变化。气相色谱法中程序升温方式会对白朮挥发油的不稳定成分造成影响，给白朮挥发油的质控结果带来差异。因此，由于HPLC的整个分析过程均在30 ℃以下，消除了温度的影响因素，保证了氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱结果的准确度。
实验5：四个产地氧化分解后的白朮挥发油的特征图谱的比较
5.1高效液相色谱分析
收集外观形态差异较大的浙江、安徽、湖南、河北等四个产地的白朮药材，以此为研究对象，对4个产地的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC特征图谱进行应用研究。
5.2白朮挥发油的提取
4个产地的白朮药材干燥根茎，粉碎，粉末颗粒100%过20目筛；采用超临界二氧化碳萃取法（SPE法），萃取得到白朮挥发油；
5.3氧化分解后的白朮挥发油的制备
白朮挥发油的处理：由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。直到苍朮酮的分解率达到100%，得到氧化分解后的白朮挥发油。
5.4供试品溶液的制备
精密称取4个氧化分解后的白朮挥发油供试品，分别用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液。
5.5指纹图谱采集
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长分别为210nm、220nm和240nm，流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
5.6色谱图处理
采用相对保留时间确认特征峰，对所得指纹图谱进行分析，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰，且各共有峰峰柱效大于5000。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”对各色谱结果进行比较。
5.7指纹图谱相似度比较
将上述4个产地氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱色谱图数据分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004A）”进行色谱峰匹配。以产地浙江的氧化分解后的白朮挥发油的色谱图为对照，建立四个不同产地分解后挥发油指纹图谱共有模式图，计算各产地的指纹图谱之间及与共有模式之间整体相似度。
5.8指纹图谱相似度比较结果
210nm、220nm、240nm为检测波长，4个产地氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱及共有模式色谱结果见图16-18，图中S1：浙江；S2：安徽；S3：湖南；S4：河北；R：共有模式。4个产地氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱之间及与共有模式之间相似度比较结果见表3、4、5。
表3 210nm检测波长特征图谱与共有模式之间整体相似度比较结果
| 浙江 | 安徽 | 湖南 | 河北 | 共有模式 | |
| 浙江 | 1.000 | 0.982 | 0.961 | 0.898 | 0.984 |
| 安徽 | 0.982 | 1.000 | 0.944 | 0.889 | 0.991 |
| 湖南 | 0.961 | 0.944 | 1.000 | 0.878 | 0.969 |
| 河北 | 0.898 | 0.889 | 0.878 | 1.000 | 0.895 |
| 共有模式 | 0.984 | 0.991 | 0.969 | 0.956 | 1.000 |
表4 220nm检测波长特征图谱与共有模式之间整体相似度比较结果
| 浙江 | 安徽 | 湖南 | 河北 | 共有模式 | |
| 浙江 | 1.000 | 0.981 | 0.965 | 0.847 | 0.990 |
| 安徽 | 0.981 | 1.000 | 0.939 | 0.842 | 0.984 |
| 湖南 | 0.965 | 0.939 | 1.000 | 0.767 | 0.983 |
| 河北 | 0.847 | 0.842 | 0.767 | 1.000 | 0.822 |
| 共有模式 | 0.990 | 0.984 | 0.983 | 0.822 | 1.000 |
表5 240nm检测波长特征图谱与共有模式之间整体相似度比较结果
| 浙江 | 安徽 | 河北 | 湖南 | 共有模式 | |
| 浙江 | 1.000 | 0.980 | 0.637 | 0.993 | 0.979 |
| 安徽 | 0.980 | 1.000 | 0.700 | 0.980 | 0.987 |
| 河北 | 0.637 | 0.700 | 1.000 | 0.643 | 0.772 |
| 湖南 | 0.993 | 0.980 | 0.643 | 1.000 | 0.981 |
| 共有模式 | 0.979 | 0.987 | 0.772 | 0.981 | 1.000 |
由上述的表3，4，5中4个不同产地氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱及共有模式色谱图之间的相似度结果表明，浙江、安徽和湖南三个产地氧化分解后的白朮挥发油的HPLC特征图谱相互之间相似度较高，相似度在0.961--0.993之间；与共有模式之间比较的相似度在0.969--0.991之间。河北产地氧化分解后的白朮挥发油的HPLC特征图谱的与其他三个产地的比较，相似度在0.637--0.898之间；与共有模式之间比较的相似度在0.772--0.895之间。说明，浙江、安徽和湖南三个产地分解后挥发油中的主要化学成分的种类相近，河北的与之相比存在一定的差异。河北产地分解后挥发油的HPLC特征图谱不但与其他三个产地的不同，也与共有模式不同。
本发明的有益效果是：
（1）采用本发明所提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，可有效地表征氧化分解后的白朮挥发油的质量，有利于控制氧化分解后的白朮挥发油的药用原料、产品生产工艺流程中的各个步骤的质量；
（2）指纹图谱注重检测物质中，反映该物质中的各个化学成分的特征峰及其前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，避免了单一组分或几种组分判定质量的片面性，能够有效的体现氧化分解后的白朮挥发油成分的复杂性，质量控制更加综合全面、科学可靠；
（3）发明人对氧化分解前、后的白朮挥发油的抗肿瘤做了大量的研究和试验，证明氧化分解后的白朮挥发油同样具有抗肿瘤作用，由于氧化分解后的白朮挥发油的化学成分处于一种稳定状态，因此，本发明所述的HPLC指纹图谱的建立方法对抗肿瘤药用原料的新药研发具有重大的意义。
附图说明
图1为氧化分解前的白朮挥发油的采用Ⅰ组流动相的高效液相色谱图。
图2为氧化分解前的白朮挥发油的采用Ⅱ组流动相的高效液相色谱图。
图3为氧化分解前的白朮挥发油的采用Ⅲ组流动相的高效液相色谱图。
图4为检测波长为200nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图5为检测波长为205nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图6为检测波长为210nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图7为检测波长为215nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图8为检测波长为220nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图9为检测波长为230nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图10为检测波长为240nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图11为检测波长为210nm的混合对照品的高效液相色谱图。
图12为采样时间的确定实验HPLC图谱。
图13为检测波长为210nm的氧化分解前的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图14为检测波长为210nm的氧化分解后的白朮挥发油的高效液相色谱图。
图15为检测波长为210nm的氧化分解前与氧化分解后的白朮挥发油的HPLC对比。
图16为检测波长为210nm的4个产地氧化分解后的白朮挥发油的特征指纹图谱及共有模式色谱图。
图17为检测波长为220nm的4个产地氧化分解后的白朮挥发油的特征指纹图谱及共有模式色谱图。
图18为检测波长为240nm的4个产地氧化分解后的白朮挥发油的特征指纹图谱及共有模式色谱图。
具体实施方式
实施例1
氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，所述的氧化分解后的白朮挥发油为：由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）混合对照品溶液的制备：用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液；
（3）指纹图谱的制作：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长200nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
进一步，由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。
具体实施时，所述的指纹图谱建立方法中进行高效液相色谱分析时，采样时间为40min。
进一步，所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg·mL-1的溶液，此溶液为对照品溶液；
（3）苍朮酮分解率的检测：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
实施例2
氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，所述的氧化分解后的白朮挥发油为：由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）混合对照品溶液的制备：用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液；
（3）指纹图谱的制作：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长240nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
实施例3
氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，所述的氧化分解后的白朮挥发油为：由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）混合对照品溶液的制备：用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液；
（3）指纹图谱的制作：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
实施例4
氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，所述的氧化分解后的白朮挥发油为：由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）混合对照品溶液的制备：用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液；
（3）指纹图谱的制作：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长210nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
Claims (5)
1.氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的氧化分解后的白朮挥发油为：由白朮药材中提取得到的白朮挥发油经氧化分解后，其中苍朮酮的分解率达100%的白朮挥发油，所述的建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）混合对照品溶液的制备：用乙腈溶解精密称取的苍朮酮、β-桉叶醇、白朮内酯Ⅰ、白朮内酯Ⅲ，制得混合溶液A；精密称取β-榄香烯，用体积比为1:1的乙腈-乙酸乙酯的溶液溶解，配制成浓度为100μg·mL-1的溶液B；混合溶液A中加入溶液B，再加入乙腈，配制成苍朮酮0.60mg·mL-1、β-桉叶醇0.40mg·mL-1、白朮内酯Ⅰ50μg·mL-1、白朮内酯Ⅲ40μg·mL-1、β-榄香烯20μg·mL-1的混合对照品溶液；
（3）指纹图谱的制作：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长200nm～240nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为乙腈，流动相为B为水，流动相A与B的体积比为60:40，采用线性梯度洗脱方式：0-30min，40%B→10%B；30-45min，10%B→10%B；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到氧化分解后的白朮挥发油的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，由白朮中提取得到的白朮挥发油的氧化分解是通过将白朮挥发油置于密闭、透光的玻璃容器中，并将玻璃容器置于室外非光照条件下进行氧化分解。
3.根据权利要求1或2所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的指纹图谱建立方法中进行高效液相色谱分析时，采样时间为40min。
4.根据权利要求1或2所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg·mL-1的溶液，此溶液为对照品溶液；
（3）苍朮酮分解率的检测：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
5.根据权利要求3所述的氧化分解后的白朮挥发油的HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的白朮挥发油中的苍朮酮的分解率的检测是采用高效液相色谱检测的，所述的检测方法为：
（1）供试品溶液的制备：精密称取氧化分解后的白朮挥发油供试品，用乙腈溶解配制成1.5mg·mL-1的溶液，此溶液为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取苍朮酮，用甲醇溶解配制成0.60mg·mL-1的溶液，此溶液为对照品溶液；
（3）苍朮酮分解率的检测：
色谱条件：Hypersil ODS2色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；检测波长220nm，流动相流速为1.0mL·min-1，柱温为室温；流动相A为体积比为35:30:35的甲醇-乙腈-水，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积比为20:80；
在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl进样量，进行高效液相色谱分析。
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| CN109580857A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-05 | 北京中研同仁堂医药研发有限公司 | 白术特征图谱构建方法和质量检测方法 |
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