CN102796185A - 水稻雌雄育性相关蛋白、其编码基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻雌雄育性相关蛋白、其编码基因及应用。所述水稻雌雄育性相关蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或为该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的衍生序列。本发明还提供了编码所述蛋白的基因。本发明提供的蛋白及其编码基因能够用于水稻雌雄器官育性控制或鉴定、调节水稻雌雄性育性水平。

Description

水稻雌雄育性相关蛋白、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程，特别是涉及一种水稻雌雄育性相关的蛋白、其编码基因及其应用。

背景技术

雄性不育在植物界中很普遍，据大量文献检索，已经在43科，162属，320个种和297个种间杂种中发现了雄性不育现象，并且这个数目还在不断增加。由于雄性不育是杂种优势利用的基础，几十年来对雄性不育机理的探索一直是一个非常活跃的研究领域，特别是近年来对雄性不育的分子生物学研究更是成果丰硕，不断有关于雄性不育分子机制的文章总结这方面的研究成果并提出了若干相应理论和假设，丰富了杂种优势利用的理论基础，提高了人们对雄性不育机理的认识。近年来应用现代细胞生物学技术对多种雄性不育农作物的花药败育过程做了研究，取得了一些新的结果。

相比雄性不育，植物雌性不育的研究起步较晚，认识程度也较浅。该类现象的相关报道始于上个世纪50年代。目前，人们已在水稻、玉米、小麦、兰花、百合、甘蓝型油菜等十几种植物中发现了雌性不育现象。正常植物雌性器官发育主要指子房的发育(包括胚珠发育和胚囊形成)，如果雌性器官胚珠或卵细胞发育受阻或直至败育，就表现出植物雌性不育现象。大部分研究工作还停留在形态解剖学和细胞遗传学水平，近年来比较多的开展了酶水平及膜水平调控机制的研究，也有部分工作结合雄性不育机制的研究对雌性不育进行了探讨，但大多数采用被子植物为研究材料。到目前为止，对配子体发生的研究还处于描述和细胞学、胚胎学水平上，对控制它们的发生、发育的分子基础了解还很少。

目前已报道了一些水稻雄性不育基因和少量雌性不育基因的染色体定位，其中少数基因已经被分离克隆。但是在水稻中同时控制水稻雌性和雄性不育的基因尚未有被分离克隆的报道，水稻雌雄育性协同控制的分子基础还不清楚。因此，植物雌雄育性控制基因的克隆和功能研究，对于明确植物雌雄育性控制的分子机理和不育特性在杂交稻生产中的应用具有重要的意义。经文献检索，至今未发现与本发明基因MFS1相关的功能分析的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻雌雄育性相关蛋白MFS1、其编码基因及在控制水稻雌雄器官育性或鉴定、提高水稻雌雄育性中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

应用图位克隆技术从水稻材料中花9号中一个不育突变体中获得一种雌雄育性相关的基因，该基因的缺失导致水稻雄性雌性器官的发育障碍，命名为雌雄不育基因（MFS1）。

在此基础上，本发明提供一种水稻雌雄育性相关蛋白，其一级结构为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

同时，本发明提供一种分离的水稻雌雄育性相关基因，所述基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本文中，所述的“不育”的植物是指一种植物，其在适当的生长条件下生长至一定的阶段（如成熟阶段）时，比在相同条件下生长的同类植物的结实率显著降低（如降低40%；较佳地降低60%；更佳地降低80%；最佳地降低95%或更多）。

本发明还包括多肽，可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括MFS1蛋白的片段、衍生物和类似物。本文中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的MFS1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（1）有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守型氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或（2）在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（3）成熟多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的多肽，或（4）附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白序列，或融合蛋白）。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“MFS 1蛋白”指具有SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括与SEQ ID NO.2序列的蛋白相同功能的、SEQ IDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个或更少1-8个或1-5个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域内，用性能相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个统称也不会改变蛋白质的功能。还包括MFS1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与MFS1蛋白编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用MFS1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有与SEQ ID NO.2序列有至少50%，较佳地至少60%，70%，80%，更佳地至少85%，90%，95%相同性的多肽。本发明还提供了其他的多肽，如包含MFS1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了MFS1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有MFS1蛋白的至少约20个连续的氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约100个连续的氨基酸，最佳地至少约150个连续氨基酸。

本发明还提供MFS1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然的MFS1蛋白的差异可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他的已知的分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中还包括MFS1蛋白保守性变异蛋白（多肽），与SEQ IDNO.2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽，且保留与SEQ ID NO.2序列的蛋白相同的功能。

本发明还提供了编码本发明MFS1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多聚核苷酸（基因）可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.2的蛋白质，但与SEQ ID NO.2所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

编码SEQ ID NO.2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列）以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，他可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，进一步较佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：（1）在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或（2）杂交时加有变性剂，如50%（V/V）甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或（3）仅在两条序列之间的相同性至少在70%以上，较佳地至少80%以上，更佳地90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好地是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核算片段可用于核算的扩增技术（如PCR）以确定和/或分离编码MFS1蛋白的多聚核苷酸。

本发明的MFS1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关的序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确的次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增值和的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可以利用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，先合成多个小片段，然后在进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可同过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸载体，以及用本发明的载体或MFS1蛋白编码序列经基因工程产生宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的DNA重组技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的MFS1蛋白。一般说来有以下步骤：

用本发明得的编码MFS1蛋白的多核苷酸或变异体，或用该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

在合适的培养基中培养宿主细胞；

从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在本发明中，MFS1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含MFS1蛋白编码DNA序列和合适的转录、翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中适当的启动子上，以指导mRNA的合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用二氢叶酸还原酶、新霉素抗性及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当的DNA序列以及适当启动子或者控制序列载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌属，农杆菌；真核细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的提供的蛋白或其编码基因的用途，用于：

控制水稻雌雄器官育性；

鉴定雌雄育性的分子标记;

提高水稻育性的方法。

本发明可通过调节所述植物中MFS1基因的表达或活性，调节植物的育性：促进还是抑制MFS1的表达活性主要取决于植物所需改良的性状而定。当需要增加植物的结实率时，可以通过提高所述植物中MFS1基因的表达或活性来实现；当需要降低植物的结实率，甚至使植物表现彻底不育时，可以通过降低所述植物中MFS1基因的表达或活性来实现。

增加MFS1基因的表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带MFS1编码基因的表达载体使植株过量表达MFS1；或可以通过强启动子驱动从而增强MFS1基因或其同源基因的表达；或者通过增强子（如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子）来增强该MFS1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻的Actin1、Actin2启动子、玉米的Ubi启动子等。

抑制MFS1基因表达的方法也是本领域周知的，例如，可通过反义或RNA干扰（RNAi）或基因敲出来实现。

作为本发明的一种优选方式，获得MFS1基因高表达的植株的方法如下：

（1）提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的MFS1蛋白的编码序列；

（2）将植物细胞、组织或器官与步骤（1）中的农杆菌接触，从而使所述MFS1蛋白编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

（3）选择出转入所述MFS1蛋白编码序列的植物细胞、组织或器官；

（4）将步骤（3）中的植物细胞、组织或器官再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件来实施此方法。

根据本发明的一个具体实施方式，提供了一种MFS1蛋白，其全长的开放阅读框（ORF）序列如SEQ ID NO.1所示，编码一个含有626个氨基酸的蛋白质（SEQ ID NO.2）。在野生型水稻和雌雄不育突变体的序列分析表明，在突变体MFS1基因位点完全缺失，从而引起水稻不育的表型。通过转基因的方法，将正常的野生型基因MFS1导入到突变体中可恢复正常可育表型。

本发明的具体实施方式中，构建了MFS1基因互补表达载体PHB-P_MFS1-MFS1、MFS1基因过量表达载体PHB-MFS1和MFS1基因干扰载体P OsAct2-R1-G-R2，通过转基因的方法，将正常的野生型基因MFS1导入到突变体中可恢复正常可育表型；将MFS1的干扰载体导入正常野生型植株中，会降低水稻结实率。

上述技术方案具有如下优点：

水稻雌雄育性控制基因（MFS1）为水稻等植物的雌雄育性控制改良提供新的技术途径。MFS1基因在去除转基因成分影响方面具有广泛的应用前景。该基因可以作为水稻雌雄育性指标的分子标记，在水稻杂种优势利用中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为MFS1基因突变后的表型图；其中A、B分别为野生型和突变体穗部；C、D分别为野生型和突变体小花；E、F分别为突变体和野生型授粉后结实情况；G、H分别为野生型和突变体花粉碘染；

图2为MFS1基因突变后的雄配子体发育障碍图；其中WT为野生型；MFS-Z9为突变体；A和E为减数分裂前期；B和F为减数分裂期；C和G为四分体时期；D和H为小孢子时期；I和M为小孢子后期；J和N为液泡化时期；K和O为有丝分裂时期；L和P为成熟花粉时期；

图3为MFS1基因突变后的雌配子体发育障碍图；其中WT为野生型；MFS-Z9为突变体；其中A、B、C、D、E分别表示同一胚囊不同切片深度可见极核、卵细胞、反足细胞、助细胞、极核和反足细胞同在；F、G、H、I和J显示不同切片深度均未见卵器分化，仅见未分化细胞团，偶有极核；

图4为MFS1精细定位区域缺失验证图；其中A为MFS1基因精细定位图；B为精细定位区间缺失验证电泳图其中检测标记与A图对应，泳道1-2、3-4和5-6分别对应缺失区域左边旁临标记D021、X1和D033；17-18、19-20和21-22分别对应缺失区域右边旁临标记DI012、DI013和DI014；7-8、9-10、11-12、13-14和15-16分别对应缺失区域标记X801、X803、X502、092和XP1。泳道1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21为突变体基因组DNA扩增情况，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22为野生型基因组DNA扩增情况；C为缺失基因表达验证；Orf1-1、Orf1-2和Orf1-3为缺失的第一基因的3个不同位点引物；Orf2-1、Orf2-2和Orf2-3为缺失的第二基因的3个不同位点引物；Orf3-1、Orf3-2和Orf3-3为缺失的第三基因的3个不同位点引物；WT为野生型；MFS-Z9为突变体；Actin-1为内参基因；

图5为MFS1基因主要控制水稻育性图；其中，1为突变体互补转基因植株，2为突变体。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，否则百分比和分数按重量计算。

实施例1MFS1基因突变的表型

在水稻材料中花9号中一个不育突变体（购自四川农业大学水稻研究所资源中心），经正反杂交和细胞学观察发现突变体表现为雌雄器官均不育（图1），进一步利用石蜡切片等技术发现，其不育的根本原因在于突变体花粉母细胞减数分裂不正常（图2）和胚囊结构的异常（图3）。

实施例2MFS1基因突变的图位克隆

1、MFS1基因突变的图位克隆

利用G630等做母本与包含突变基因的杂合体杂交，构建分离群体，将基因定位，并实现精细定位区间标记加密和序列比较分析表明，在突变体在该区域产生一个约20KB的片段缺失，导致了3个预测基因（orf1、orf2和orf3）表达产物缺失（图4），从而引起水稻不育的表型。通过基因预测和转基因的方法，将其中一个正常的野生型基因MFS1导入到突变体中可恢复正常可育表型（图5），其余2个基因的导入则育性不可恢复。

野生型MFS1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。MFS1基因的全长ORF长度为1881bp，编码626个氨基酸。

2、MFS1基因全长cDNA克隆

以正常野生型水稻日本晴品种的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该MFS1基因ORF序列的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4），用高保真Taq酶Primerstar进行扩增，获得约1.8K的MFS1基因的全长cDNA扩增产物。将该扩增产物通过PstⅠ和SacⅠ限制性酶切重组进载体pBluescript sk+的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pBS-MFS1。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.3)：

5’-CTGCAGAACCAATGCATTGGATGACGGTGGAGGAGA-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.4)：

5’-CGGAGCTCCTAGACCAGCTCCCAGTCCCCA-3’

3、MFS1基因启动子克隆

在本实施例中，以正常野生型水稻日本晴品种的DNA为模板,以所述MFS1基因起始密码子前面约2.5K片段的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物（SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6），用高保真Taq酶KOD Plus进行扩增，获得约2.5K的MFS1基因的启动子扩增产物，序列如SEQ ID NO.11所示。将该扩增产物通过SpeⅠ和PstⅠ限制性酶切重组进载体pBluescript sk+（购自Stratagene公司）的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pBS-P_MFS1。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.5)：

5’-GGACTAGTCTTAATTCTCATGTAATGCGTGTGCCAC-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.6)：

5’-CTGCAGAACCAATGCATTGGCTTCCTCCAATCAATCA-3’

实施例3MFS1基因水稻转基因试验

本实施例采用表达载体PHB（Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商购）作为水稻转基因的载体。该载体编码一个细菌复制起点（ori）、卡那霉素抗性基因（Kan^r）、潮霉素抗性基因（Hyg^r）、除草剂抗性基因（Bar^r）、2×35S启动子、NOS基因终止信号序列以及用于连接目的片段的多克隆位点（MCS）。在限制性内切酶位点可插入MFS1基因或其片段构建成转基因质粒。

1、MFS1基因互补表达载体构建

在本实施例中，首先用PstⅠ和SacⅠ限制性酶切pBS-MFS1和PHB，将pBS-MFS1消化后的约1.8K的全长cDNA片段连入PHB的PstⅠ和SacⅠ位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。

用EcoRⅠ和BamhⅠ限制性酶切pBS-P_MFS1和PHB-35S-MFS1，回收pBS-P_MFS1酶切消化后的约2.5K的MFS1基因的启动子片段，与回收的PHB经酶切消化后的约13K的载体骨架（去除掉2×35S启动子）连接，对重组子进行酶切和测序鉴定，这样成功构建PHB-P_MFS1-MFS1，其中MFS1基因的表达由自身启动子驱动。

2、MFS1基因过量表达载体构建

用HindⅢ和SacⅠ限制性酶切pBS-MFS1和PHB，将pBS-MFS1消化后的约1.8K的全长cDNA片段连入PHB的HindⅢ和SacⅠ位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。这样成功构建PHB-MFS1，其中MFS1基因的表达由2×35S强启动子驱动。

3、MFS1基因干扰载体构建

在本实施例中，以正常野生型水稻日本晴品种的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该MFS1基因ORF序列的5’端约400bp的片段末端寡核苷酸作为PCR引物（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8），用高保真Taq酶KOD Plus进行扩增，获得约400bp的MFS1基因的正向干扰片段扩增产物。同时用PCR引物（SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10）扩增获得反向干扰片段。将该正向扩增产物通过SalI和HindIII限制性酶切重组进载体pSK-G(pSK，可商购，其SmaⅠ已经插入GUS内含子片段)的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pSK-R1-G。将该反向扩增产物通过EcoRI/BamHI限制性酶切重组进载体pSK-R1-G的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体干扰结构中间载体pSK-R1-G-R2。最后用SalI和SacI限制性酶切pSK-R1-G-R2和pOsAct2-1-nos（He等，2009，Plant BiotechnologyJournal 227-239），将pBS-R1-G-R2消化后的约1.5K的干扰结构片段连入pOsAct2-1-nos的SalI和SacI位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。这样成功构建干扰表达载体，其中该干扰结构的表达由Actin2强启动子驱动。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.7)：

5’-ACGCGTCGACTGGTGCATGTGACTATCTT-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.8)：

5’-CCCAAGCTTTCTCCCTGGTGA TGTTCT-3’

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.9)：

5’-CGCGGATCCTGGTGCATGTGACTATCTT-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.10)：

5’-CCGGAATTCTCTCCCTGGTGATGTTCT-3’

4、MFS1基因转化水稻试验

将上述PHB-P_MFS1-MFS1、PHB-MFS1和P OsAct2-R1-G-R2通过冻融法导入农杆菌EHA105（购自Biovector公司）。农杆菌EHA105平板（4℃保存）挑取单菌落于YEP液体培养基（Km和Rif各50mg/L）中，28℃振荡培养12～18h，然后取1～5mL菌液接到100mL YEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μmol/L)中，振荡培养4h后测OD值稀至相应浓度（OD＝0.5）。将新鲜菌液于8000rpm、4℃、5min收集菌体，并重悬于三分之一提及的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。共培养愈伤组织经无菌水和含Cef 500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28℃暗培养5～7d。将预培养的愈伤组织转接于含Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3～4周，再将抗性愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1～2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基上，28℃光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28℃光照培养3～4周，开放培养炼苗7d左右，最后移栽到大田。

其中，PHB-P_MFS1-MFS1转化雌雄不育突变体-中花9号突变体（购自四川农业大学水稻研究所资源中心），PHB-MFS1和P OsAct2-R1-G-R2转化正常野生型材料Kasalath和TP309,PHB-MFS1也部分转化雌雄不育突变体。雌雄不育突变体愈伤组织获得采用幼穗培养，其余正常材料均为成熟胚来源组织培养诱导。

获得的再生植株移栽成活后用除草剂或潮霉素筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T1代调查育性表型，验证MFS1基因功能。

实施例4MFS1基因功能分析

如实施例3所述的方法获得水稻MFS1互补表达的突变体转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如图5，转MFS1互补表达基因的植株的育性得到了恢复，变成正常可育，表明MFS1基因的表达是水稻维持正常育性所必须的。

如实施例3所述的方法获得水稻MFS1过量表达的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如表1，转MFS1过量表达基因的FS植株的结实率较MFS1互补表达的FS植株有一定的提高。表明MFS1基因的高表达有利于提高水稻结实率。

如实施例3所述的方法获得水稻MFS1表达受干扰的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如表1，MFS1基因表达下调的植株的结实率降低。表明MFS1基因的下调表达会降低水稻结实率。

表1干扰和过表达植株结实率

材料	结实率（%）
		RNAi-1	54.3
RNAi-2	58.2
		OVE-1	91.8
OVE-1	89.4
		CK	83.2

从上述分析可以看出，MFS1是水稻维持正常育性所必须的基因，缺失该基因会导致植株不育，上调该基因表达有利于植株结实率提高，下调该基因表达则降低植株的结实率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水稻雌雄育性相关蛋白，其特征在于，具有如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列；或为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述的载体或权利要求2或3所述基因的宿主细胞。

6.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因在控制水稻雌雄器官育性或鉴定、提高水稻雌雄育性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过在水稻中过表达权利要求2所述的基因，提高水稻雌雄育性。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过在水稻中下调权利要求2所述的基因，降低水稻雌雄育性。

9.一种调节水稻雌雄育性的方法，其特征在于，提高或降低水稻中权利要求1所述蛋白的活性；或提高或降低权利要求2所述基因的表达。

10.根据权利要求9所述的方法，包括以下步骤：

（1）用权利要求2所述基因构建表达载体；

（2）将表达载体导入宿主菌中，筛选表达所述基因的工程菌；

（3）将工程菌导入目标植物中，筛选转基因植株。

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