CN105399806A - 一种水稻雌雄育性相关的蛋白、其编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻雌雄育性相关的蛋白，其一级结构为如SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列；本发明还公开了一种水稻雌雄育性相关的基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示。本发明提供的蛋白及其编码的基因能够用于控制水稻雌雄育性或鉴定水稻雌雄育性。

Description

一种水稻雌雄育性相关的蛋白、其编码基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及一种水稻雌雄育性相关的蛋白、其编码基因及其应用。

背景技术

雄性不育在植物界中很普遍，据大量文献检索，已经在43科，162属，320个种和297个种间杂种中发现了雄性不育现象，并且这个数目还在不断增加。由于雄性不育是杂种优势利用的基础，几十年来对雄性不育机理的探索一直是一个非常活跃的研究领域，特别是近年来对雄性不育的分子生物学研究更是成果丰硕，不断有关于雄性不育分子机制的文章总结这方面的研究成果并提出了若干相应理论和假设，丰富了杂种优势利用的理论基础，提高了人们对雄性不育机理的认识。近年来应用现代细胞生物学技术对多种雄性不育农作物的花药败育过程做了研究，取得了一些新的结果。

相比雄性不育，植物雌性不育的研究起步较晚，认识程度也较浅。该类现象的相关报道始于上个世纪50年代。目前，人们已在水稻、玉米、小麦、兰花、百合、甘蓝型油菜等十几种植物中发现了雌性不育现象。正常植物雌性器官发育主要指子房的发育(包括胚珠发育和胚囊形成)，如果雌性器官胚珠或卵细胞发育受阻或直至败育，就表现出植物雌性不育现象。大部分研究工作还停留在形态解剖学和细胞遗传学水平，近年来比较多的开展了酶水平及膜水平调控机制的研究，也有部分工作结合雄性不育机制的研究对雌性不育进行了探讨，但大多数采用被子植物为研究材料。到目前为止，对配子体发生的研究还处于描述和细胞学、胚胎学水平上，对控制它们的发生、发育的分子基础了解还很少。

目前已报道了一些水稻雄性不育基因和少量雌性不育基因的染色体定位，其中少数基因已经被分离克隆。但是在水稻种同时控制水稻雌性和雄性不育的基因尚未有被分离克隆的报道，水稻雌雄育性协同控制的分子基础还不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻雌雄育性相关的蛋白、其编码基因、含有该编码基因的载体和细胞及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

应用图位克隆技术从水稻材料XF2中一个不育突变体中获得一种雌雄育性相关的基因，该基因的缺失导致水稻雄性雌性器官的发育障碍，命名为雌雄不育基因(XF2)。

在此基础上，本发明提供一种水稻雌雄育性相关基因，所述基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

同时，本发明提供一种水稻雌雄育性相关蛋白，其一级结构为如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或为如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有与其功能相同的衍生的蛋白；或为与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少有70％的同源性并具有与其功能相同的衍生的蛋白。

本文中，所述的“不育”的植物是指一种植物，其在适当的生长条件下生长至一定的阶段(如成熟阶段)时，比在相同条件下生长的同类植物的结实率显著降低(如降低40％；较佳地降低60％；更佳地降低80％；最佳地降低95％或更多)。

本发明还包括多肽，可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括XF2蛋白的片段、衍生物和类似物。本文中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的XF2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守型氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(3)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。

在本发明中，XF2蛋白指具有SEQIDNO.2序列的多肽。还包括与SEQIDNO.2序列的蛋白相同功能的、SEQIDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个或更少1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域内，用性能相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个统称也不会改变蛋白质的功能。还包括XF2蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与XF2蛋白编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用XF2蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有与SEQIDNO.2序列有至少50％，较佳地至少60％，70％，80％，更佳地至少85％，90％，95％相同性的多肽。本发明还提供了其他的多肽，如包含XF2蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了XF2蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有XF2蛋白的至少约20个连续的氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约100个连续的氨基酸，最佳地至少约150个连续氨基酸。

本发明还提供XF2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然的XF2蛋白的差异可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他的已知的分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中还包括XF2蛋白保守性变异蛋白(多肽)，与SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽，且保留与SEQIDNO.2序列的蛋白相同的功能。

本发明还提供了编码本发明XF2蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多聚核苷酸(基因)可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO.3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO.2的蛋白质，但与SEQIDNO.3所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

编码SEQIDNO.2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，他可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，进一步较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上，较佳地至少80％以上，更佳地90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好地是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核算片段可用于核算的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码XF2蛋白的多聚核苷酸。

本发明的XF2蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关的序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确的次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增值和的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可以利用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，先合成多个小片段，然后在进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可同过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸载体，以及用本发明的载体或XF2蛋白编码序列经基因工程产生宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的DNA重组技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的XF2蛋白。一般说来有以下步骤：

用本发明XF2蛋白的编码多核苷酸或变异体，或用该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

在合适的培养基中培养宿主细胞；

从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在本发明中，XF2蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含XF2蛋白编码DNA序列和合适的转录、翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中适当的启动子上，以指导mRNA的合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用二氢叶酸还原酶、新霉素抗性及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当的DNA序列以及适当启动子或者控制序列载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌属，农杆菌；真核细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的提供的蛋白或其编码基因的用途，用于：

控制水稻雌雄器官育性；

鉴定雌雄育性的分子标记；

提高水稻育性的方法。

本发明可通过调节所述植物中XF2基因的表达或活性，调节植物的育性：促进还是抑制XF2的表达活性主要取决于植物所需改良的性状而定。当需要增加植物的结实率时，可以通过提高所述植物中XF2基因的表达或活性来实现；当需要降低植物的结实率，甚至使植物表现彻底不育时，可以通过降低所述植物中XF2基因的表达或活性来实现。

增加XF2基因的表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带XF2编码基因的表达载体使植株过量表达XF2；或可以通过强启动子驱动从而增强XF2基因或其同源基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子)来增强该XF2基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻的Actin1、Actin2启动子、玉米的Ubi启动子等。

抑制XF2基因表达的方法也是本领域周知的，例如，可通过反义或RNA干扰(RNAi)或基因敲出来实现。

作为本发明的一种优选方式，获得XF2基因高表达的植株的方法如下：

提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的XF2蛋白的编码序列；

将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述XF2蛋白编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

选择出转入所述XF2蛋白编码序列的植物细胞、组织或器官；

将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件来实施此方法。

根据本发明的一个具体实施方式，提供了一种XF2蛋白，其全长的开放阅读框(ORF)序列如SEQIDNO.1所示，编码一个含有1706个氨基酸的蛋白质(SEQIDNO.2)。在野生型水稻和雌雄不育突变体的序列分析表明，在突变体XF2基因位点缺失两个碱基，从而引起水稻不育的表型。

本发明的具体实施方式中，构建了XF2基因互补表达载体PHB-PXF2-XF2、XF2基因过量表达载体PHB-XF2和XF2基因敲除载体，通过转基因的方法，将正常的野生型基因导入到突变体中可恢复正常可育表型；将敲除载体导入正常植株中，会降低水稻结实率。

本发明的有益效果是:植物雌雄育性控制基因的克隆和功能研究，对于明确植物雌雄育性控制的分子机理和不育特性在杂交稻生产中的应用具有重要的意义。经文献检索，至今未发现与本发明基因XF2相关的功能分析的报道。

附图说明

图1是本发明穗部XF2基因突变后的表型图，其中，A、B分别为野生型和突变体穗部；

图2是本发明小花XF2基因突变后的表型图，其中，A、B分别为野生型和突变体小花；

图3是本发明花粉碘染后的示意图，其中，A、B分别为野生型和突变体花粉碘染；

图4是本发明XF2基因突变后的雄配子体发育障碍图，其中，WT为野生型；MT为突变体；A和D为减数分裂前期；B和E为减数分裂期；C和F为液泡化时期；

图5是本发明XF2基因突变后的雌配子体发育障碍图；其中，WT为野生型；MT为突变体；

图6是本发明XF2基因精细定位图；

图7是本发明精细定位区间XF2基因突变位点；

图8是本发明精细定位区间XF2基因突变位点序列；

图9是本发明XF2基因主要控制水稻育性图；其中，A为突变体，B为突变体互补转基因植株；

图10是本发明整株水稻XF2基因主要控制水稻育性图，其中，A为日本晴整株，B为敲除XF2基因的转基因植株整株；

图11是本发明XF2基因主要控制水稻育性图，其中，A为日本晴主穗，B为敲除XF2基因的转基因植株主穗；

图12是本发明XF2基因主要控制水稻育性图，其中，A为日本晴花药，B为敲除XF2基因的转基因植株花药；

图13是本发明XF2基因主要控制水稻育性图，其中，A为日本晴花粉，B为敲除XF2基因的转基因植株花粉；

图14是本发明敲除靶位点序列。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1XF2基因突变的表型

在水稻材料XF2(保存于四川农业大学水稻研究所资源中心)中发现一个不育突变体，经正反杂交和细胞学观察发现突变体表现为雌雄器官均不育(图1-图3)，进一步利用石蜡切片，DAPI等技术发现，其不育的根本原因在于突变体花粉母细胞减数分裂不正常(图4)和胚囊结构的异常(图5)，由图3可知，突变体的花粉无活性(有活性的花粉因为有淀粉累积能被碘液染成紫色，无活性的不能)；由图5可知，可育植株的成熟胚囊形成正常囊腔，腔内可见极核、卵细胞、反足细胞、助细胞同在；不育植株的成熟胚囊不形成囊腔。

实施例2XF2基因突变的克隆

1、XF2基因突变的图位克隆

利用桂朝2号等做母本与包含突变基因的杂合体杂交，构建分离群体，将基因定位，并实现精细定位，精细定位区间标记加密和序列比较分析表明，在突变体中该区域内的一个基因有2个碱基的缺失(图6-图8)，由图6可知，通过图位克隆的方法将基因定位于两个标记INDEL17和R8之间，定位区间内共有如图7个基因；由图7可知，通过对区间内7个基因进行测序，发现LOC_Os02g42910这个基因的外显子上有两个碱基的缺失，表明此基因为候选目标基因，图8表示出了缺失位点的序列图。

野生型XF2基因的序列如SEQIDNO.1所示，CDS序列如SEQIDNO.3所示，编码蛋白序列如SEQIDNO.2所示。XF2基因的全长ORF长度为7613bp，CDS全长为5121bp，编码1706个氨基酸。

2、XF2基因全长cDNA克隆

以正常野生型水稻日本晴品种的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该XF2基因ORF序列的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQIDNO.4和SEQIDNO.5)，用高保真酶Fastpfufly进行扩增，获得约5.2K的XF2基因的全长cDNA扩增产物。将该扩增产物通过BamHI限制性酶切重组进载体pBluescriptsk+的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pBS-XF2。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQIDNO.4)：

5’-CGCGGATCCATATGAGGACCCGCTTCCTCGCCA-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQIDNO.5)：

5’-CGCGGATCCCTACGTACCTTCCTCTCGGAAT-3’

3、XF2基因启动子克隆

在本实施例中，以正常野生型水稻日本晴品种的DNA为模板，以所述XF2基因起始密码子前面约2K片段的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQIDNO:6和SEQIDNO:7)，用高保真酶Fastpfufly进行扩增，获得约2K的XF2基因的启动子扩增产物。将该扩增产物通过HindIII和BamHI限制性酶切重组进载体pBluescriptsk+(商购)的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证，序列如SEQIDNO.8所示。该重组的过渡质粒载体称为pBS-PXF2。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQIDNO.6)：

5’-CCCAAGCTTCTGAGACGAAACAACACGGT-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQIDNO.7)：

5’-CGCGGATCCGGCGAATGGCGCGGCGGAGA-3’

实施例3XF2基因水稻转基因试验

本实施例采用表达载体PHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275，可商购)作为水稻转基因的互补及过量表达载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygr)、除草剂抗性基因(Barr)、2×35S启动子、NOS基因终止信号序列以及用于连接目的片段的多克隆位点(MCS)。在限制性内切酶位点可插入XF2基因或其片段构建成转基因质粒。本实施例采用VK005-01(商购)作为水稻转基因的敲除载体，该载体编码Ubi启动子、mpCas9、Ru6-gDNA、2×35S启动子、潮霉素抗性基因(Hygr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)。

1、XF2基因互补表达载体构建

在本实施例中，首先用EcoRⅠ和BamhⅠ限制性酶切pBS-PXF2和PHB，回收pBS-PXF2酶切消化后的约2K的启动子片段，与回收的PHB经酶切消化后的约10K的载体骨架(去除掉2×35S启动子)连接，对重组子进行酶切和测序鉴定，成功构建PHB-PXF2。

用BamHI限制性酶切pBS-XF2和PHB-PXF2，将pBS-XF2消化后的约5.2K的全长cDNA片段连入PHB的BamHI位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定，成功构建PHB-PXF2-XF2，其中XF2基因的表达由自身启动子驱动。

2、XF2基因过量表达载体构建

用BamHI限制性酶切pBS-XF2和PHB，将pBS-XF2后的约5.2K的全长cDNA片段连入PHB的BamHI位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。这样成功构建PHB-XF2，其中XF2基因的表达由2×35S强启动子驱动。

3、XF2基因敲除载体构建

利用CRISPR/Cas9技术首先设计XF2基因的靶位点，CGCGGTTATCCCCGCAGGCC，然后构建VK005-01-XF2敲除载体，对重组载体进行鉴定，其中靶位点的表达由Ubi启动子驱动。

4、XF2基因转化水稻试验

将上述PHB-PXF2-XF2、PHB-XF2和敲除载体通过冻融法导入农杆菌EHA105(四川农业大学水稻所生物技术实验室保存)。农杆菌EHA105平板(4℃保存)挑取单菌落于YEP液体培养基(Km和Rif各50mg/L)中，28℃振荡培养12～18h，然后取1～5mL菌液接到100mLYEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μmol/L)中，振荡培养4h后测OD值稀至相应浓度(OD＝0.5)。将新鲜菌液于8000rpm、4℃、5min收集菌体，并重悬于三分之一提及的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。共培养愈伤组织经无菌水和含Cef500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28℃暗培养5～7d。将预培养的愈伤组织转接于含Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3～4周，再将抗性愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1～2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基上，28℃光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28℃光照培养3～4周，开放培养炼苗7d左右，最后移栽到大田。

其中，PHB-PXF2-XF2转化雌雄不育突变体(前面有交代，源于XF2突变体)，PHB-XF2和敲除载体转化正常野生型材料Nipp、Kasalath和TP309,PHB-XF2也部分转化雌雄不育突变体。雌雄不育突变体愈伤组织获得采用雌雄不育突变体幼穗培养，其余正常材料均为成熟胚来源组织培养诱导。

获得的再生植株移栽成活后用除草剂或潮霉素筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T1代调查育性表型，验证XF2基因功能。

实施例4XF2基因功能分析

如实施例3所述的方法获得水稻XF2互补表达的突变体转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如图9，转XF2互补表达基因的植株的育性得到了恢复，变成正常可育，表明XF2基因的表达是水稻维持正常育性所必须的。

如实施例3所述的方法获得水稻XF2过量表达的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如表1，转XF2过量表达基因的植株的结实率较未过量表达的植株有一定的提高。表明XF2基因的高表达有利于提高水稻结实率。

如实施例3所述的方法获得水稻XF2基因被敲除的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如图10-图14，XF2基因被成功敲除的植株的结实率降低。表明XF2基因的下调表达会降低水稻结实率。

表1敲除和过表达植株结实率

材料	结实率(％)
		过表达植株	92.4
对照植株	80.6
		敲除植株	0

从上述分析可以看出，XF2是水稻维持正常育性所必须的基因，缺失该基因会导致植株不育，上调该基因表达有利于植株结实率提高，下调该基因表达则降低植株的结实率。

Claims (8)

1.一种水稻雌雄育性相关的蛋白，其特征在于，其一级结构为如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

2.—种水稻雌雄育性相关的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为：编码权利要求1所述蛋白的多聚核苷酸；或与编码权利要求1所述蛋白的多聚核苷酸序列互补的多聚核苷酸。

3.如权利要求2所述的水稻雌雄育性相关的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

4.含有权利要求2或3所述的基因的表达载体或重组载体。

5.含有权利要求4所述的载体或其基因组中整合有权利要求2或3所述的基因的宿主细胞。

6.权利要求2或3所述的基因在控制水稻雌雄育性或鉴定水稻雌雄育性中的应用。

7.一种调节水稻雌雄育性的方法，其特征在于，提高或降低水稻中权利要求1所述蛋白的活性；或提高或降低权利要求2或3所述基因的表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用权利要求2或3所述基因构建表达载体；

(2)将表达载体导入宿主菌中，筛选表达所述基因的工程菌；

(3)将工程菌导入目标植物中，筛选转基因植株。