CN102791281B

CN102791281B - 抗紫外光毒性的肽保护

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Publication number: CN102791281B
Application number: CN201080052918.0A
Authority: CN
Inventors: L·张; T·J·法拉
Original assignee: Helix Biomedix Inc
Current assignee: Helix Biomedix Inc
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2030-11-18
Also published as: EP2512498A2; KR20120116926A; ES2551697T3; RU2565535C2; WO2011063090A3; WO2011063090A2; CA2779863C; ZA201203397B; EP2512498A4; TWI494129B; RU2012125260A; US8597902B2; TW201138851A; SMT201500305B; CN102791281A; CA2779863A1; EP2512498B1; US20120225023A1; KR101764171B1; HK1170419A1

Abstract

公开了具有生物学及治疗活性的短肽。特别地，所公开肽的活性涉及减少或防护诱变物诱导的细胞/组织毒性(即化学预防)。例如，所公开的肽防护紫外(UV)光暴露所发生的皮肤毒性及/或突变发生。所公开的肽亦阻断某些细胞周期调节蛋白质(诸如Chk2)的活化。该肽的一个实例为Ser-Leu-Tyr-Gln-Ser(SEQ ID NO：10)。所公开的肽亦可用于减少或防护暴露诱变物后另外所发生的细胞毒性及突变累积的方法。一种该方法涉及将肽施用至皮肤以预防或减少UV光(例如太阳光)暴露所引起的突变损伤。

Description

抗紫外光毒性的肽保护

本申请要求2009年11月19日申请的美国专利临时申请第61/262,790号的优先权，该申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及一种具有生物学及治疗活性的肽。特别地，本发明涉及一种防护诱变物(mutagen)诱发的细胞/组织毒性的短肽。例如，本发明的肽可防护在暴露UV光之后发生的皮肤中毒性。本发明肽的一种功能为阻断磷酸化作用，及因此活化某些细胞周期调节蛋白质。本发明进一步涉及一种使用本发明肽降低在暴露诱变物(例如UV光)后的细胞/组织毒性程度的方法。

发明背景

当将角质细胞暴露至诸如紫外线(UV)照射的DNA损伤元素(诱变物)时，会使细胞周期检查点活化，从而阻碍细胞分裂。在诱变物诱发损伤之后，细胞周期会停滞在G2阶段，让DNA有时间修复。然而，若检查点过程被中断或抑制，则发生癌症(例如DNA突变)的频率会降低。此点已经在活体外及活体内通过在UV照射之前及之后将咖啡因施用至皮肤上而证实(LU等人，2008，CANCER RES.68：2523-2529；HEFFERNAN等人，2009，J.INVEST.DERMATOL.129：1805-1815)。此现象系根据咖啡因可抑制有丝分裂检查点途径，从而使DNA受损的细胞进行有丝分裂并经由细胞凋亡死亡，这是因为其DNA不能进行符合要求的复制过程。尽管有DNA突变/受损，但仍可进行细胞周期进程，及由此出现的凋亡细胞死亡可防止经诱变物诱发的突变在受影响的组织中固着。此过程从而减少否则可能发展成癌病变(诸如癌)的遗传上改变的细胞数量。

在皮肤护理治疗及美容皮肤护理应用中使用此试剂，已经提升咖啡因减少UV光对皮肤的癌变影响的能力。然而，由于缺乏特异性，在皮肤护理产品中使用咖啡因遭到质疑。除了其有益作用外，咖啡因可诱发皮肤中的非所欲作用(例如血管舒张、干燥等)。基于这些缺点，已寻求其它方法用于预防诱变物在皮肤及相关组织中的损伤作用。

使用短肽发展皮肤护理产品的用途已由于其以天然氨基酸为主的结构、特异性、无毒性及无副作用，而非常受欢迎。这些质量可使肽作为发展用于补充皮肤护理组合物的新颖化学预防试剂的适宜起始点。本文中阐述具有化学预防及化学治疗特性且可施用于保护皮肤不受太阳光的损伤作用的肽。

发明概述

本发明的实施方案涉及一种减少细胞周期检查点激酶的活性的方法。该方法可包括使检查点激酶暴露至长度为五至九个氨基酸残基且包括SEQ ID NO：13的肽。在此实施方案及其它实施方案中的细胞周期检查点激酶可呈活化状态。可应用于文中所述的此方法及其它方法中的肽的实例包括SEQ ID NO：2、3、5、6、8、或10或由其组成。

可用于文中所述方法的肽的其它实例为具有与SEQ ID NO：13序列直接邻接的组氨酸残基的那些。其它肽可在其羧基末端酰胺化。该酰胺化肽的特定实例为包括SEQ ID NO：2、3、5、6、8、或10或由其组成的那些。

本公开方法靶向的检查点激酶可包括检查点激酶-1(Chk1)或检查点激酶-2(Chk2)或由其组成。该检查点激酶可因细胞中的DNA受损而活化。该DNA受损可由诱变剂引起。诱变剂的实例为能够在皮肤中诱发DNA受损的那些(例如紫外线照射)。所公开的方法亦可包括使cdc25(细胞分裂周期25)磷酸酶暴露至文中所描述的肽；cdc25c为可在本发明中被靶向的cdc25c的实例。

本发明的另一实施方案涉及一种处理哺乳动物的皮肤的方法。该方法包括通过使检查点激酶暴露至所公开的肽，而减少皮肤中细胞周期检查点激酶(例如Chk2)的活性。本发明的另一实施方案涉及一种通过将所公开的肽施用至皮肤而处理哺乳动物皮肤的方法。

本发明的另一实施方案涉及一种长度为五至九个氨基酸残基及包括SEQ ID NO：13的肽。该肽的实例包括SEQ ID NO：2、3、5、6、8、或10或由其组成。本发明的肽的其它实例具有与SEQ ID NO：13序列直接邻接的组氨酸残基。其它的肽可在其羧基末端酰胺化。该酰胺化肽的特定实例为包括SEQ ID NO：2、3、5、6、8、或10或由其组成的那些。

本发明的另一实施方案涉及一种包括本发明的肽及药学上可接受载体的组合物。该组合物可呈喷雾剂、乳液(emulsion)、液体、洗液(lotion)、乳膏、糊剂(paste)、软膏、粉末或泡沫的形式。

附图简述

图1显示某些通常彼此比对的本发明肽(SEQ ID NOS：1-10)及SEQID NO：11(人酪氨酸酶)的氨基酸序列。在某些肽(SEQ ID NOS：1-7)中，下面划线的残基构成SEQ ID NO：11的保守性氨基酸取代物。

图2显示星形孢菌素(staurosporine)或某些本发明肽对检查点激酶2(Chk2)活性的抑制。对照组Chk2活性用第一个长条表示。图中所示肽(SEQ ID NOS：2-6及8-10)在羧基末端酰胺化(-CONH₂)。

图3显示人Chk2(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列。此序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(或GENBANK)中以登录号AAH04207所公开的相同。

图4显示人Chk1(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列。此序列与NCBI网站(或GENBANK)以登录号AAC51736所公开的相同。

图5显示人cdc25c(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列。此序列与NCBI网站(或GENBANK)以登录号AAR32098所公开的相同。

发明详述

本发明肽(例如表1及图1中列出的那些)可包括L-或D-氨基酸对映异构体，其包含具有一种对应异构形式或两种形式的组合的残基。所述肽可如以下非限制性实例中所述而进一步强化或修饰，只要未改变其一级氨基酸序列即可；如此，所述肽由某些氨基酸序列组成，但可包括某些修饰。所述肽的羧基末端可为酸性(-COOH)或经酰胺化(例如-CONH₂、-CONHR、或-CONR₂)。与其游离酸形式相比，羧基末端的酰胺化作用可使本发明肽较不易受蛋白酶降解的影响及可增加其溶解性，因而提供增强的治疗效力。所述肽亦可经脂质化，从而可增强皮肤渗透。连接各肽的氨基酸的一或多个分子键可为非肽键。该非肽键包括(但不限于)亚氨基、酯肼、氨基脲(semicarbazoide)及偶氮键。

表1

SEQ ID NO：	序列
		1	DYHTLYQTHL
2	YHSLYQSHL
		3	YHSIYQSHI
4	DFHSLFQSH
		5	YHSLYESK
6	FHSIYQSH
		7	FKSLYQS
8	HSLYQSH
		9	HSLYQS
10	SLYQS
		13	S-L/I-Y-Q/E-S
14	SIYQS
		15	SLYES
16	SIYES

可对本发明肽进行各种修饰，只要保持其一级氨基酸序列即可。某些修饰可用于增加肽的效力，然而其它修饰可有利于肽处理。通常可经过修饰的肽官能团包括羟基、氨基、胍盐、羧基及酰胺基团。通常，这些基团的非限制性反应包括以下反应：羟基经烷基卤化物的乙酰基化作用；羧基的酯化作用、酰胺化作用或氢化作用(即还原成醇)；氨基(例如肽的一级氨基或赖氨酸残基的氨基)的脱酰胺作用、酰化作用、烷基化作用、芳基化作用。例如，SEQ IDNO：1-10及/或13可在羧基末端(-CONH₂)酰胺化。

尽管如上所论述，但本发明肽可在一或多个氨基酸残基位置上具有某些氨基酸变化。例如，一个、两个或三个残基可经转变成保守性残基或残基群。氨基酸保守策略为本领域众所周知；例如，熟知的是赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸及谷氨酸可在不大幅影响原来的肽的结构及功能下分别替代组氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸及谷氨酰胺。任选地，本发明肽可比SEQ ID NO：1-10或13的任一者减少一个氨基酸；或减少两个氨基酸(邻接或非邻接)。本发明肽的变体形式应与SEQ ID NO：1-10或13的任一者有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。本发明肽的变体形式应具有SEQ ID NO：1-10或13的任一者所具有的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、或95％的活性或功能。

SEQ ID NO：1-10及13所具有的活性或功能的实例为化学预防癌症(例如癌瘤、肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌)；阻止暴露至诱变/致癌剂(例如UV照射)的组织(例如皮肤)发展出癌变前期细胞群体生长；在细胞(例如皮肤细胞、角质细胞、黑素细胞或成纤维细胞)暴露至诱变/致癌剂(例如UV照射)之后阻断细胞周期阻滞及DNA修复；阻断cdc25c通过DNA受损修复途径的活化，如：经由检查点激酶(例如检查点激酶-2[Chk2])的活化；阻断或减少与暴露至诱变物/致癌原(例如UV照射)相关或由其引起的毒性(诸如皮肤中)；阻断或减少诱变物/致癌原对健康皮肤特征(例如色调、弹性、含水性(hydration)、着色、紧实度、光滑度)的负面作用。化学预防(化学防护)可指使用诸如本发明肽的试剂来减少出现瘤形成(例如癌症、癌症前期病变、良性过度生长病变)的风险或延迟其发展或复发。因诱变试剂或任何其它试剂(例如化疗、刺激)引起的皮肤毒性可呈红斑、秃头症(掉发)、光敏感(对太阳光的敏感度增加)、回忆反应(例如过去曾经照射处理的位点上化疗的作用)、痤疮样(粉刺状)爆发、皮肤坏死、嗜中性外分泌汗腺炎、外分泌腺鳞状化生、色素沉着过度、指甲变化、粘膜炎、真皮硬化反应、血管损伤、干燥症、水肿(肿胀)、荨麻疹、皮肤老化(例如变薄、弹性降低、起皱纹、下垂、色素沉着增加[例如斑点、日光性着色斑、滴状色素减少症(guttate hypomelanosis)]、毛细血管扩张、血管瘤、紫癜、日光性黑头粉刺(solar comedones)、胶样粟粒疹、脂漏性角化病)、起疱、皮炎、增殖性/真菌样生长节结(vegetating/fungating nodules)(凸出的结实肿块)、渗出性噬斑、赘生物或具有脓疱的坏死性溃疡、伤疤、脂膜炎、溃疡、疼痛及/或烧伤的形式表现。“减少”、“抑制”、“阻断”或“防止”在文中是指与不施用本发明肽或包含该肽的组合物的通常存在的情况相比较，本发明肽可使该病症的发生率、严重度、量值、致病率或相关的症状减少至少约7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、或100％。

虽然本发明肽可在不添加其它序列的情况下产生，但可选择将本发明序列并入更长的序列中。例如，本发明肽可具有添加至其N-或C-末端或此二者上的额外的氨基酸残基。其实例可为标记抗原决定部位，诸如Flag，其通常用于追踪蛋白质；例如，本领域熟知的标记抗原决定部位包括例如myc、His、HA(血凝素)。因此，本发明涵盖由本发明肽组成的肽或包括本发明肽的肽。虽然本发明肽可于更大序列内(即包含于其中)提供，但本发明肽序列与其它序列的组合不应构成由动物细胞(例如人细胞)天然表达的任何蛋白质或肽序列。若文中用来阐述由序列“组成”的肽(诸如肽)的语言虽然限定于某些邻接氨基酸序列，但仍可包括(亦即缀合的)非氨基酸部分或其它肽/蛋白质(这些肽/蛋白质会经由非肽键与本发明肽缀合)。

本发明的肽可为5、6、7、8、或9个邻接氨基酸长度及包括SEQID NO：13(S-L/I-Y-Q/E-S)或由其组成。所述肽的非限制性实例为SEQID NO：2、3及5-10。所述肽的其它非限制性实例为包括SEQ IDNO：13的SEQ ID NO：2、3及5-8的片断。依据SEQ ID NO：13的序列式(formula)，本发明的其它肽可为5、6、7、8、或9个邻接氨基酸长度及包括SEQ ID NO：14(S-I-Y-Q-S)、SEQ ID NO：15(S-L-Y-E-S)、或SEQ ID NO：16(S-I-Y-E-S)或由其组成。本发明的其它肽可包括SEQID NO：13，其中组氨酸残基与SEQ ID NO：13序列直接邻接；该肽的实例为SEQ ID NO：2、3、5、6、8及9。包含SEQ ID NO：13的短肽在结构上彼此完全相关，鉴于亮氨酸与异亮氨酸之间(即SEQ IDNO：13的位置2)及谷氨酰胺与谷氨酸之间(即SEQ ID NO：13的位置4)的结构/化学相类似。除亮氨酸及异亮氨酸外的其它氨基酸可占在SEQID NO：13的位置2，诸如丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、或甲硫氨酸。除谷氨酰胺及谷氨酸外的其它氨基酸可占在SEQ ID NO：13的位置4，诸如天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、或赖氨酸。

或者，本发明的肽可为5、6、7、8、或9个邻接氨基酸长度及包括SEQ ID NO：10(S-L-Y-Q-S)或由其组成。所述肽的非限制性实例为SEQ ID NO：2及7-9。所述肽的其它非限制性实例为包括SEQ IDNO：10的SEQ ID NO：2、7及8的片断。本发明的其它肽可包括SEQ IDNO：10，其中组氨酸残基(H)与SEQ ID NO：10序列直接邻接；所述肽的实例为SEQ ID NO：2、8及9。

本发明肽的所有实施方案皆呈“分离的”状态。例如，“分离的”肽为已经完全或部份纯化的肽。在某些情况下，分离的肽为较大组合物、缓冲剂系统或试剂混合物的一部分。在其它情况下，分离的肽可经纯化至均质性。一种组合物所包括的肽可占其中亦包含的所有其它大分子物质的至少约50、80、90、或95％(基于摩尔计)。本发明肽可包括组分的异种组合。本发明肽的混合物可用于实施本发明。

本发明肽可与可溶或不可溶载体分子缀合，以依需要修饰其溶解特性及增加肽在靶组织中的局部浓度。可溶性载体分子的实例包括聚乙二醇(PEG)与聚乙烯吡咯烷酮的聚合物；不可溶聚合物的实例包括硅酸酯、聚苯乙烯及纤维素。肽亦可经微囊包封，以增强其在治疗应用期间及之后的稳定性；通常，使用聚酯及PEG微球体包封并稳定肽。

可根据待包封的肽组合物的亲水性或疏水性性质，使用不同方法制备用于肽包封的微球体。所述方法的方案实例可发现于Wang等人(J.CONTROL.RELEASE 17：23，1991)及美国专利第4,324,683号，两者均通过引用以其整体结合到本文中。可进行活体外肽释放研究，以测定肽并入微球体后的相对利用度。微球体(200MG)悬浮于2.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，PH 7.2)中及于环境培养箱振荡器(G-24，NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.，EDISON，N.J.)中在37℃及100RPM搅动。在特定取样时间(最初4天内每天及此后每隔一天)，缓冲溶液完全移除，并用新鲜PBS取代。使用Bradford方法或通常用于蛋白质分析的其它适宜定量分析法测量PBS的肽含量。

提供以下程序及参数仅用于指引目的且为本领域技术人员熟知。所有公开的肽可于Advanced ChemTech Apex 396Multiple PeptideSynthesizer上使用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相化学法合成。APEX396装备有40-孔反应块(reaction block)用于同时生产0.15mmol规模的多至40种肽。所述肽可使用标准氨基酸制成酰胺化或游离酸序列。树脂先用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗及预膨胀。Rink酰胺树脂的膨胀时间为一小时。使用于DMF中的25％哌啶移除Fmoc保护基历时25分钟，之后该哌啶自该树脂完全洗掉。为控制消旋过程，Fmoc氨基酸单体于1-羟基-苯并三唑(HOBt)或1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)于0.5M DMF中的等摩尔溶液中预活化。酰胺偶合法通过使用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)或2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)作为活化剂及2.5-5.0倍摩尔过量的氨基酸在碱性条件下使用位阻碱(二异丙基乙胺)进行。偶合时间为1至1.5小时，继而进行洗及再偶合以完成双重或三重偶合，然后脱保护及继续加长肽链。使用标准Kaiser测试监测偶合效率。一旦在树脂上完成肽合成，则如上述移除最终Fmoc基团，该序列保留呈游离碱形式。

使用95％三氟醋酸(TFA)及水且添加适宜的清除剂来裂解肽与树脂的对酸不稳定的连接基(linkage)。在裂解进行约30分钟至一小时之后，将所释放的肽立即自裂解块(cleavage block)移除，及转移至试管中，以用于在减压下移除TFA。所述肽随后即准备用于纯化，及经由高效液相层析(HPLC)使用反相C18柱及质谱法分析。使用LC/MS/MS系统(ABI API2000)确认一级序列及完成制备型纯化。

上述一般方案中，该肽可使用本领域技术人员所知晓的任何方法产生，诸如于MERRIFIELD(J AM CHEM SOC.85：2149，1963)；CARPINO等人(J ORG CHEM.51：3732，1986)；MERRIFIELD等人(ANAL CHEM.38：1905，1966)；或KENT等人[HIGH YIELDCHEMICAL SYNTHESIS OF BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDESON AN AUTOMATED PEPTIDE SYNTHESIZER OF NOVELDESIGN，IN：PEPTIDES 1984(RAGNARSSON，ED.)ALMQVIST和WIKSELL INT.，STOCKHOLM(SWEDEN)，第185-188页]中公开的那些，所有这些均通过引用以其整体结合到本文中。所述肽可通过能够将氨基酸依序添加至加长肽链的机器产生。然而，所述肽亦可使用标准溶液相方法制造，其较适合大规模生产。

本发明的其它实施方案涉及使用上述肽的方法，诸如用于制剂中或作为治疗剂。这些方法可包括使用单肽或多肽组合(即混合物)。

在某些情况下，可将本发明组合物安置于存在于皮肤上、皮肤中或皮肤下的装置中。所述装置包括透皮贴剂、植入物及注入物(injection)，其释放物质的方式可经由被动或主动释放机制接触皮肤或毛囊。该物质可于适宜的溶媒中及在有效浓度下，(例如)依定期间隔(诸如一天一次或两次)局部地施加至表皮。一或两次注射至皮肤提供用于将本发明肽给予皮肤或任何其它组织的另一路径。

在本文所述方法中用于递送肽的组合物可呈喷雾剂、乳液、液体、洗液、乳膏、糊剂、软膏、粉末、泡沫或其它药学上可接受制剂的形式。此外，所述肽可使用较不复杂的制剂递送，诸如去离子/蒸馏水、PBS或标准医用生理盐水溶液。一般而言，药学上可接受制剂可包括适用于人皮肤或粘膜表面上的任何载体。所述药学上可接受载体包括乙醇、二甲亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉及等效载体及稀释剂。该制剂可任选具有美容需求，及/或包含其它试剂，诸如类视黄醇(retinoid)或能够作为本发明肽治疗作用的佐剂的其它肽。亦可添加抗生素至该制剂中，以抵挡感染，从而可出现最佳愈合过程。组合物中该肽的浓度可为约0.1μg/mL至约50μg/mL或约0.1μg/mL至约20MG/ML；然而，所用的最终浓度可根据靶组织的性质、本发明肽的生物活性及为了加强组合物吸收所采用的任何佐剂或技术，而可能超出这些范围变化。所述测定在本领域技术人员的范围内。例如，用于实施本发明的肽的浓度可为约0.1、1、2、5、10、15、20、25、50、75、100、200、500、或1000μg/mL。

可将本发明肽及相关的组合物给予人及动物，其包括所有哺乳动物(例如猪、牛、马、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、猫、狗、雪貂、灵长类)。亦可与典型及/或试验材料组合施用，诸如组织移植物、组织培养产品、氧气及敷料剂。一般而言，该组合物可经局部、经口、经皮、全身给予，或通过本领域技术人员已知的用于递送本发明肽至靶组织的其它方法给予。例如，组合物亦可依活体外或离体方式施用至在培养基中生长的细胞或患者移植物。

由于其尺寸小，因此希望该肽本身即具有能够通过皮肤的通透性；然而，某些技术可用于增强此运动。例如，可添加亲脂性(非极性)基团至该肽中，或可将该肽呈亲脂性赋形剂递送至皮肤中，以加强肽接近角质层，移位至较下面的表皮层。可认为以此方式的亲脂性修饰具有前药作用。渗透增强剂(诸如已知溶剂及表面活性剂)可用于赋形剂中，以促进肽吸收。预期可用于增强肽接近靶组织/伤口的特殊技术包括注射方案、离子导入法、电泳法及超音波。离子导入装置由浸入电解质溶液中的两个电极组成，且置于皮肤上。当对电极施加电流时，则会在角质层上产生电场以递送肽。电穿孔法包括施加高电压电脉冲，以提高通过脂双层的渗透性。此点与离子导入法的不同处在于施加电流的持续时间及强度(离子导入法使用相对恒定低压电场)。据信电穿孔法的高电压电脉冲可引起脂质薄层膜中可逆性形成亲水性孔，其可高度增强渗透性。超音波法施加大于16kHz的频率的音波至皮肤，从而引起声波所通过的组织的压缩及膨胀。所造成的压力变化引起可增强肽渗透性的许多过程(例如空洞形成、混合、温度增加)。

本发明可包括一或多种蛋白酶抑制剂。可选择蛋白酶抑制剂，以特异性靶向预期将降解所选生物活性肽的蛋白酶；该选择可基于该生物活性肽的长度及/或序列而决定。然而，蛋白酶抑制剂不需要依任何特定方式选择，例如，包含一或两种抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)可用于本发明中。就本发明的某些实施方案而言，该蛋白酶抑制剂并不能特定抑制病毒。以下类型的蛋白酶抑制剂可并入本发明中：丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、硫醇蛋白酶抑制剂及苏氨酸蛋白酶抑制剂。

蛋白酶抑制剂为本领域众所周知。可并入本发明中的蛋白酶抑制剂的非限制性实例包括乙酰基-胃蛋白酶抑制剂、AEBSF(4-[2-氨基乙基]苯磺酰氟)盐酸盐、ALLM(N-乙酰基-Leu-Leu-Met)、ALLN(N-乙酰基-Leu-Leu-Nle-CHO)、抑氨肽酶素(amastatin)(链霉菌(Streptomyces sp.))、ε-氨基-正己酸、氨基肽酶N抑制剂、α₁-抗胰凝乳蛋白酶、抗痛素(盐酸盐或二盐酸盐)、α2-抗血浆素、抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶、p-APMSF盐酸盐、抑肽酶(aprotinin)(例如来自牛肺)、ATBI(11个残基肽)、苄脒盐酸盐、苯丁抑制素(bestatin)、苯丁抑制素甲基酯、钙蛋白酶抑制素(calpastatin)、钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)、羧肽酶抑制剂、胱天蛋白酶酶(caspase)抑制剂、组织蛋白酶(cathepsin)B抑制剂II、组织蛋白酶G抑制剂I、组织蛋白酶抑制剂II、组织蛋白酶抑制剂III、组织蛋白酶抑制剂I、组织蛋白酶K抑制剂I、组织蛋白酶K抑制剂II、组织蛋白酶K抑制剂III、组织蛋白酶L抑制剂I、组织蛋白酶L抑制剂II、组织蛋白酶L抑制剂IV、组织蛋白酶L抑制剂V、组织蛋白酶L抑制剂VI、组织蛋白酶S抑制剂、组织蛋白酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂、抑糜酶素(chymostatin)、胰凝乳蛋白酶抑制剂I、胱抑素(cystatin)、1，5-丹酰基(dansyl)-glu-gly-arg氯甲基酮二盐酸盐、3，4-二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸盐、二肽基肽酶II抑制剂、二肽基肽酶IV抑制剂I、二肽基肽酶IV抑制剂II、E-64蛋白酶抑制剂、ecotin、EDTA二钠盐二水合物、EDTA四钠盐、EGTA、弹性蛋白酶抑制剂I、弹性蛋白酶抑制剂II、弹性蛋白酶抑制剂III、弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal)、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸盐二甲磺酸盐(guanidinobenzoate dimethanesulfonate)、GLu-gly-arg-氯甲基酮、2-胍基乙基巯基琥珀酸、十六烷基磺酰氟、α-碘乙酰胺、激肽原、leuhistin、亮抑酶肽半硫酸盐、α₂-巨球蛋白、DL-2-巯基甲基-3-胍基乙基巯基丙酸、胃蛋白酶抑制剂A、苯基甲基磺酰氟、磷酸阿米酮二钠盐、PPack II三氟醋酸盐、PPack二盐酸盐、脯氨酰基肽链内切酶抑制剂II、Na-甲苯磺酰基-lys氯甲基酮盐酸盐、Na-甲苯磺酰基-phe氯甲基酮、三肽基肽酶II抑制剂、胰蛋白酶抑制剂(来自玉米或大豆)、D-val-phe-lys氯甲基酮二盐酸盐、1，3-二-(n-羧基苯甲酰基-1-亮氨酰基-1-亮氨酰基)氨基丙酮、邻菲咯啉、乌索酸(例如迷迭香(rosemary)提取物)、凝血酸(tranexamic acid)(4-[氨基甲基]环己烷-1-羧酸)(临床上在美国以Cyklokapron售出及在亚洲以Transamin售出)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Arg(Pmc)、苯甲酰基-Arg-硝基苯胺、苯甲酰基-Arg-萘基酰胺、及α-2-巨球蛋白。

用于本发明中的蛋白酶抑制剂可为肽或蛋白质，诸如酶。该抑制剂的非限制性实例为丝氨酸蛋白酶抑制剂，其包括α-1-抗胰蛋白酶、补体1-抑制剂、抗凝血酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1、及神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(neuroserpin)。

通常可并入皮肤护理制剂中的组分为本领域众所周知。除生物活性肽组分外，本发明可包含其它活性剂，诸如烟碱酰胺、植烷三醇、法尼醇(farnesol)、甜没药萜醇(bisabolol)及水杨酸。希望某些另外的活性剂可与生物活性肽组分出现增效作用，或增强该制剂的保存期限。

在该组合物欲与动物或人皮肤接触的情况下，应选择适用于施用至角质组织(即稳定、低毒性、低变应原性的)的其它组分。CTFACosmetic Ingredient Handbook，第二版(1992)(其通过引用以其整体结合到本文中)阐述适用于本发明组合物的常用于皮肤护理工业中的许多种非限制性的美容及药物成份。这些成份的实例包括：研磨剂、吸收剂、美观组分，诸如香料、颜料、上色/着色剂、香精油、皮肤感官剂(skin sensate)、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁香油酚、乳酸薄荷酯、北美金缕梅馏出物)、抗粉刺剂(例如间苯二酚、硫磺、水杨酸、苯甲酰基过氧化物、红霉素(erythromycin)、锌)、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲酸碘丙基酯)、抗氧化剂、结合剂、生物添加剂、缓冲剂、膨胀剂、螯合剂(chelating agent)、化学添加剂、变性剂、外用止痛剂、聚合物(例如二十碳烯与乙烯基吡咯烷酮的共聚物)、不透明剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、螯合剂(sequestrant)、皮肤漂白及增亮剂(例如氢醌、曲酸、抗坏血酸[维生素C]、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖胺)、皮肤调理剂(例如保湿剂，其包括混杂性及封闭性保湿剂)、皮肤舒缓及/或愈合剂(例如泛酰醇及衍生物[例如乙基泛酰醇]、芦荟、泛酸及其衍生物、尿囊素、没药醇、甘草酸二钾)、增稠剂、微粒材料、结构剂及维生素。许多这些制剂详细阐述于美国专利第6,492,326号中，其通过引用以其整体结合到本文中，尤其有关不同成份的描述。

本发明的组合物可包含微粒材料，诸如金属氧化物。这些微粒可经涂覆或未经涂覆、带电或不带电。用于制备本发明微粒材料的非限制性实例包括氯氧化铋、氧化铁、云母、经硫酸钡及TiO₂处理的云母、二氧化硅、尼龙、聚乙烯、滑石、苯乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯酸共聚物、绢云母、氧化铝、硅酮树脂、硫酸钡、碳酸钙、醋酸纤维素、二氧化钛、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物。无机微粒材料，诸如TiO₂、ZnO(氧化锌)或ZrO₂可自许多来源市购。微粒材料可依0.01重量％至2重量％，或0.05重量％至1.5重量％，或0.1重量％至1重量％(所有测量值皆为近似值)的水平存在于组合物中。

本发明组合物可包含选自保湿剂、湿润剂或皮肤调理剂的调理剂。可使用各种这些材料且其含量分别占该组合物的约0.01重量％至20重量％，或约0.1重量％至10重量％，或约0.5重量％至7重量％(所有测量值皆为近似值)。这些材料包括(但不限于)胍；尿素；乙醇酸及乙醇酸盐(例如铵及烷基季铵盐)；水杨酸；乳酸及乳酸盐(例如铵及烷基季铵盐)；呈其各种形式的芦荟(例如芦荟凝胶)；多羟基醇，诸如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、甘油、己三醇、丁三醇、丙二醇、丁二醇及己二醇；聚乙二醇；糖类(例如蜜二糖)及淀粉；糖及淀粉衍生物(例如烷氧基化葡萄糖、果糖、葡糖胺)；透明质酸；乳酰胺单乙醇胺；乙酰胺单乙醇胺；泛酰醇；尿囊素；矿脂；及其混合物。

本发明的组合物可包含结构剂，其可用于制备水包油乳液。在不受任何理论的限制下，据信该结构剂有助于对组合物提供流变特性，可促进该组合物的稳定性。例如，结构剂有助于形成液体结晶凝胶网络结构。该结构剂亦具有乳化剂或表面活性剂的功能。本发明可包含占该组合物重量约0.1重量％至20重量％，约0.1重量％至10重量％，或约0.5重量％至9重量％的一种或多种结构剂(所有测量值皆为近似值)。

可并入本发明中的结构剂选自硬脂酸、棕榈酸、硬脂醇、鲸蜡醇、山萮醇、平均具有约1至约5个环氧乙烷单元的硬脂醇的聚乙二醇醚、平均具有约1至约5个环氧乙烷单元的鲸蜡醇的聚乙二醇醚、及其混合物。可用于本发明中的其它结构剂选自硬脂醇、鲸蜡醇、山萮醇、平均具有约2个环氧乙烷单元的硬脂醇的聚乙二醇醚(steareth-2)、平均具有约2个环氧乙烷单元的鲸蜡醇的聚乙二醇醚、及其混合物。

本发明肽的其它特征、生产模式及用途阐述于(例如)美国专利第6,974,799号及第5,492,894号中。这些专利均通过引用以其整体结合到本文中。

方法

本发明亦涉及一种通过给予文中所述的肽来抑制或预防哺乳动物组织中赘生性生长的方法。虽然无任何特定作用机制，但所公开肽的抗赘生性活性系与抑制细胞周期检查点激酶(诸如检查点激酶-2(Chk2))活性的能力相关。抑制Chk蛋白质(其在细胞受到DNA损伤之后活化)可防止细胞进入细胞周期阻滞期，以免在此期间发生DNA修复。虽然DNA修复可将序列还原成其初始状态(即未突变)，但通常不足以造成大的遗传性刺激。此后，修复过程时常使可促成致癌过程(例如致癌基因的活化、肿瘤抑制物或看家基因的失活)的遗传变化固定(永恒不变)。基于通过抑制Chk蛋白质活性而阻断或减少细胞周期阻滞期，让细胞可继续进行有丝分裂阶段，其间由于分裂过程中某些DNA损伤事件(例如DNA双链断裂)的破裂作用，会导致细胞凋亡。DNA损伤亦可称为遗传毒性应激。因此，细胞凋亡可清除携带有害遗传变化的细胞；若细胞周期阻滞可进行完全活化，从而允许进行DNA“修复”，则所述细胞有潜力存活及充当赘生性发展的前驱物(precusor)。以此方式，由于DNA损伤剂的作用，本发明可用于减少组织中突变的积聚。

通过本发明肽阻止、抑制或治疗的赘生性生长可为良性的、癌前期的或癌的(即恶性)。基于此原因，可认为所公开肽具有化学预防、化学防护、抗癌、抗赘生、抗致癌物或化疗活性。就预防或抑制组织中赘生性生长或病变而言，可将一或多种肽给予原本没有表现明显(肉眼可见)瘤形成迹象的组织中。例如，所述肽可在诱变伤害出现之前(例如在伤害前1、2、3、4、8、12、16、20、24、48、72、96、或120小时内)(例如在日照之前局部施加至皮肤)，或在受到诱变伤害之后不久(例如在伤害后1、2、3、4、8、12、16、20、24、48、72、96、或120小时内)(例如在日照之后局部施加至皮肤)给予至建康组织。在皮肤护理方面，可将所述肽作为防晒剂或晒后制剂施用。所述肽亦可用于预防或抑制组织中突变增加，无论该组织是否完全健康或包含少量良性及/或癌前期病变。该用途可预防或抑制良性或癌症前期病变转变成癌症/恶性病变(即预防或抑制肿瘤发生)，及因此认为可治疗良性或癌前期病变。在另一方面，本发明可用于预防或抑制皮肤或其它组织的增生。

在出现时即被本发明预防或抑制，或治疗的良性及/或癌前期赘生性皮肤病变的实例为皮肤纤维瘤、表皮囊肿、血管瘤、葡萄酒色痣、淋巴管瘤、化脓性肉芽肿、蜘蛛痣(蛛状痣)、瘢痕瘤、角化棘皮瘤、脂肪瘤、痣、发育不良痣、脂漏性角化病、皮赘、皮脂腺增生、牛皮癣及光化性角化病(日旋光性角化病)。在出现时即被本发明预防及抑制或治疗的皮肤中的恶性皮肤病变/肿瘤(即皮肤癌)的实例为基底细胞癌(例如结节型基底细胞癌、囊性基底细胞癌、瘢痕性基底细胞癌、浸润性基底细胞癌、小结节型基底细胞癌、表皮基底细胞癌、有色基底细胞癌、侵蚀性溃疡[Jacobi ulcer]、Pinkus的纤维上皮瘤、息肉状基底细胞癌、孔状基底细胞癌、异常基底细胞癌)、鳞状细胞癌(例如腺样鳞状细胞癌[假腺管型鳞状细胞癌]、透明细胞鳞状细胞癌、纺锤细胞鳞状细胞癌、印指环状细胞鳞状细胞癌、基底细胞样鳞状细胞癌、疣状癌、角化棘皮瘤)、黑色素瘤(例如恶性小痣黑色素瘤、表皮浅散布型黑色素瘤(superficially spreading melanoma)、肢端黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节型黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促结缔组织增生性黑色素瘤(desmoplastic melanoma)、无色素性黑色素瘤、软组织性黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤)、隆突型皮肤纤维肉瘤、Merkel细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、角化棘皮瘤、纺锤细胞肿瘤、皮脂腺癌、微囊肿性附属器癌(microcystic adnexalcarcinoma)、非典型纤维黄色瘤、平滑肌肉瘤(leimyosarcoma)及血管肉瘤。

因此，本发明预防、抑制或治疗皮肤中赘生物的发展或进展，其中该受影响细胞(即产生赘生物的细胞类型)为上皮细胞、间充质细胞、角质细胞、成纤维细胞、黑素细胞、皮肤干细胞或皮肤祖细胞。本发明靶向的皮肤组织为表皮，其包括基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层；真皮，其包括乳突层及网状层；及皮下组织，其包括脂肪组织、结缔组织、神经组织及血管。本发明靶向前面提到的所有组织、层及细胞类型。

在出现时即被本发明预防或抑制，或治疗的良性及/或癌前期赘生性病变或生长概况(profile)的其它实例为增生、发育不良及组织变形。通过本发明所预防、抑制或治疗的癌症性赘生性病变的其它实例为肺癌、骨癌、胰腺癌、胃癌(gastric cancer)、头或颈癌、子宫癌、卵巢癌、妇科癌、直肠癌、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)淋巴瘤、食道癌、小肠癌、结肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、初级CNS淋巴瘤、脊椎轴肿瘤(spinal axistumor)、脑癌、垂体腺瘤、血管瘤、神经胶质瘤或胚细胞瘤。

本发明可作为皮肤的美容品或应用于皮肤的美容治疗。因此，本发明具有保持正常、健康皮肤特征的作用，诸如色调、弹性、含水性、着色、紧实及光滑。所有这些质量会随皮肤中受损细胞量的增加而下降，所述受损细胞源自皮肤中诱变物的作用及/或突变的累积。因此，本发明可预防、抑制或治疗皮肤老化的作用；其中一项实例为光老化，其中皮肤部分地随UV照射暴露的程度变化而老化。例如，本发明所指的光老化的作用为皱纹、色斑及/或色素沉着过度、皮肤粗糙或皮革状、下垂/松垂、变黄、干燥及各种赘生物。

在实施本发明中可靶向的组织为皮肤及皮肤的相关粘膜组织。皮肤的相关粘膜组织为组织结构类似皮肤的任何组织，其包含上皮细胞，且与皮肤直接连接。所述组织的实例为口腔、鼻咽、耳、肛门及泌尿生殖器表面，以及眼睛的眼睑结膜。在实施本发明中可靶向的其它组织为衍生自外胚层、中胚层及内胚层的那些，或包括上皮细胞、间充质细胞(例如成纤维细胞)、肌肉细胞、或神经细胞(例如神经元)。本发明靶向的其它器官、器官系统及组织为(例如)循环系统(例如心脏、血液、血管)、消化系统(例如唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、小肠及大肠、直肠)、内分泌系统(例如下丘脑、脑垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)、外皮系统(例如皮肤、毛发、指甲)、淋巴系统(例如淋巴结及淋巴管)、免疫系统(例如扁桃体、腺样物(adenoid)、胸腺、脾)、肌肉系统(例如心肌、平滑肌、骨骼肌)、神经系统(例如脑、脊髓、外周神经、神经)、生殖系统(例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睪丸、输精管、贮精囊、前列腺、阴茎)、呼吸系统(例如咽、喉、气管、支气管、肺、横膈膜)、骨骼系统(例如骨、软骨、韧带、腱)、及排泄系统(例如肾、输尿管、膀胱、尿道)。

如用于实施本发明，所公开的肽可用于通过减少因暴露于内生或异位(环境)来源的诱变物所产生的突变累积于组织中而限制瘤形成(例如增生)的发生。该诱变物暴露时间可为急性或慢性。一般而言，本发明可适合阻断由于暴露异位诱变物/致癌原而产生的突变累积。文中所论述的异位诱变物(亦即源自动物周围环境外部的那些)的实例为紫外线(UV)照射(即UV光)(UV-A、UV-B、UV-C)、电离照射(例如X-射线、γ射线、α粒子)、碱基类似物(例如5-溴尿嘧啶)、脱胺剂(例如亚硝酸[亚硝酸盐])、硝基胺、嵌入剂(例如溴化乙锭(ethidiumbromide)、原黄素(proflavine)、道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)[亚德里亚霉素(adriamycin)]、沙利度胺(thalidomide)、放线菌素(dactinomycin)、黄曲毒素(aflatoxin)、吖啶)、烷基化试剂(例如乙基亚硝基脲)、溴、热、叠氮化钠、补骨脂素、苯、苯并芘、砷、石棉、镉、铬、环氧乙烷、镍、氡、氯乙烯、铅及病毒。内生诱变物的实例为5-甲基胞嘧啶、反应性氧物质(例如一氧化氮、超氧化物)及转座子。本发明亦涉及阻断因施加某些刺激物而引起的组织中的突变积累。例如，刺激物可刺激慢性炎症的病症，其可导致多种组织中形成癌。

在实施本发明中，其它化学预防及/或抗癌剂可与所公开的肽一起给予。该给予可包括所公开肽及另一化学预防剂一起在同一组合物中，或涉及该肽及该剂在治疗/预防方案期间不同时间点施用的方案。使用所公开的肽及另一化学预防剂二者可产生增效化学预防活性。可与本发明联合使用的化学预防剂及/或抗癌剂的实例为植物化学物质、咖啡因、咖啡酸、染料木黄酮(genistein)、白藜芦醇(resveratrol)、二烯丙基硫化物、s-烯丙基半胱氨酸、蒜素、番茄红素、辣椒素、姜黄素、6-姜酚、鞣花酸、乌索酸、水飞蓟素(silymarin)、茴香醚(anethol)、儿茶素(catechin)、大黄素、莱菔硫烷(sulforaphane)、丁香酚、异丁香酚、β-胡萝卜素、oleandarin、多酚、吲哚(例如二吲哚基甲烷、吲哚-3-甲醇)、异硫氰酸酯(例如苯乙基异硫氰酸酯)、非类固醇抗炎剂(NSAIDS)(例如塞来考昔(celecoxib)、布洛芬(ibuprofen)、舒林酸(sulindac)、阿司匹林(aspirin))、PPAR-γ激动剂(例如匹格列酮(pioglitazone)、罗西格列酮(rosiglitazone))、瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)、类视黄醇(例如全反式视黄酸、9-顺式-或13-顺式-视黄酸、4-羟基视黄酰胺)、贝沙罗汀(bexarotene)、tararotene、硒、大豆异黄酮、他汀类(statins)(例如阿托伐他汀(atorvastatin))、含硫抗氧化剂及维生素D类似物(例如维生素D₂、维生素D₃)。

在癌症细胞中使用某些化疗剂或其它试剂(例如γ-辐射)而造成DNA损伤的一个目标为诱导癌症细胞经历细胞凋亡，从而引起肿瘤衰退。然而，响应于DNA损伤而对细胞周期阻滞的诱导可减少此所希望的结果。因此，本发明的另一方面为组合使用DNA损伤试剂与所公开的肽，以治疗癌症(例如皮肤癌)或任何其它类型的赘生物。此方法的根据为如下所论述的所公开肽敏化DNA损伤细胞而导致细胞凋亡的能力(亦即，刺激细胞经历细胞凋亡，而非使癌细胞存活的细胞周期阻滞)。可用于实施本发明的DNA损伤试剂为(例如)烷基化试剂、顺铂(cisplatin)、磷铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mechlorethamine)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、亚硝基脲、链脲霉素(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、罗莫司丁(lomustine)、烷基磺酸酯、白消安(busulfan)、苯达莫司汀(bendamustine)、三嗪类、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、替莫唑胺(temozolomide)、氮丙啶(ethylenimine)、塞替派(thiotepa)、六甲嘧胺(altretamine)、六甲基三聚氰胺、抗代谢物、6-巯基嘌呤、达卡巴嗪(dacarbazine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、培美曲塞(pemetrexed)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine)、地西他滨(decitabine)、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(例如)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、放线菌素-D(actinomycin-D)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)-c、新制癌菌素(neocarzinostatin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、拓扑异构酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、拓扑异构酶II抑制剂、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、植物生物碱、紫杉烷、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、埃坡霉素(epothilone)、伊沙匹隆(ixabepilone)、长春花生物碱、长春碱、长春新碱、长春瑞滨(vinorelbine)、雌莫司汀(estramustine)、照射、γ射线、X-射线及UV照射。可将其中一或多种试剂与所公开的肽组合施用至病变，或者，可使用一种方案，其中该肽及DNA损伤试剂在治疗方案的不同时间点施加。

本发明的一方面为抑制检查点激酶(Chk)活性。例如，本发明涉及抑制哺乳动物细胞(诸如皮肤细胞)中已被DNA损伤活化的Chk2。该DNA损伤及/或Chk活性可(例如)在细胞中经由暴露至UV照射或存在于环境中的任何其它诱变物诱导。经UV光诱导的DNA损伤一般包括环丁烷嘧啶二聚物及6-4嘧啶-嘧啶酮产物。在不受任何特定理论或机制的限制下，Chk受到所公开肽阻断或减量调节/下调(downregulate/down-modulate)其对cdc25(细胞分裂周期25)磷酸酶(诸如cdc25c)抑制激酶活性的能力所抑制。在正常的细胞条件(很少或无DNA损伤)下，cdc25c引发信号级联，从而导致有丝分裂，但在DNA损伤条件下，经活化的Chk抑制cdc25c。因此，阻断Chk活性增加cdc25c能够发出有丝分裂信号的机率，甚至在通常(即当Chk未受抑制时)会减量调节cdc25c的DNA损伤条件下。假定DNA-损伤与正常有丝分裂过程不相容，则可进入有丝分裂的DNA-受损细胞随后经由细胞凋亡而清除。因此，本发明的一方面涉及经由细胞凋亡诱导清除DNA-受损细胞。本发明的另一方面涉及抑制通常因响应DNA-损伤而产生的细胞周期阻滞。

本发明靶向的Chk酶实例为Chk1及Chk2，其二者皆为本领域熟知。在真核物种间这些丝氨酸/苏氨酸激酶在结构及功能上保守，其在人中的形式使人cdc25c磷酸酶在丝氨酸-216(或等效丝氨酸残基，其取决于Chk-靶向序列在cdc25c变体[例如剪接变体]内的所处位置)上磷酸化。使用本发明肽抑制Chk1-及/或Chk2-介导的cdc25c(例如在丝氨酸-216位置或等效丝氨酸残基上)的磷酸化作用的方法为本发明的一部分。本发明可靶向Chk蛋白质，因为其天然存在于活体细胞中。

经活化的Chk酶(诸如其因响应DNA损伤而出现)可通过上游因子(例如ATM[经毛细血管扩张共济失调-突变的蛋白质]、ATR[ATM-RAD3-相关的蛋白质])，在DNA-损伤-感知路径中磷酸化或经由自磷酸化作用而活化。与Chk的活化形式相比，Chk的未活化形式具有很少或没有激酶活性。例如，活化的Chk酶可使cdc25c磷酸化。可活化此酶的Chk2磷酸化作用位点实例为苏氨酸-26、丝氨酸-50、苏氨酸-68、苏氨酸-383及/或苏氨酸-387残基位置(或其Chk2变体[例如剪接变体]内的等效位置)。可活化此酶的Chk1磷酸化作用位点实例为丝氨酸-286、丝氨酸-301、丝氨酸-317及/或丝氨酸-345残基位置(或其Chk1变体[例如剪接变体]内的等效位置)。

经人中CHEK2基因编码的Chk2具有如图3中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。人CHK2在本领域中亦称为“CHK2检查点同源物(S.pombe)”、CDS1、及RAD53。SEQ ID NO：17仅供参考的目的，因为人Chk2及其它哺乳动物Chk2蛋白质序列为已知的。例如，美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(或GENBANK)公开登录号为AAH04207、BAB17231、NP 009125、NP 001005735、NP 665861、O96017、AAS58460、AAD48504、AAC83693、EAW59757、EAW59756、EAW59754、CAX11959、CAX11958、CAX11957、CAX14028、CAX14027、CAX14026、CAH73823、CAH73875、AAV41895及BAF83443的人Chk2氨基酸序列，所有这些序列通过引用以其整体结合到本文中。就实施本发明的目的而言，Chk2包括与SEQ ID NO：17至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列或由其组成。

由人中CHEK1基因编码的Chk1具有如图4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。人类Chk1在本领域中亦称为“CHK1检查点同源物(S.POMBE)”。SEQ ID NO：18仅供参考目的，因为人Chk1及其它哺乳动物Chk1蛋白质序列为已知的。例如，NCBI网站(或GENBANK)公开登录号为AAC51736、AAW02681、AAH04202、BAF85238、BAA84577、CAB70558、O14757、AAM58752、AAM78553、CAD10662、AAH17575、AAE84492、CAZ65679、AAB88852、ABM83833、ABM87141、AAE67465、AAE67917、AAX36253、BAI45672、NP 001107594及NP 001265的人类CHK1氨基酸序列，所有这些序列通过引用以其整体结合到本文中。就实施本发明的目的而言，CHK1包括与SEQ ID NO：18至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列或由其组成。

cdc25c(细胞分裂周期25C)，其为一种酪氨酸磷酸酶，由人中cdc25c基因编码且具有如图5中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。人cdc25c在本领域中亦称为“M-期诱导物磷酸酶3”及“细胞分裂周期25同源物C(S.pombe)”。SEQ ID NO：19仅供参考的目的，因为人cdc25c及其它哺乳动物cdc25c蛋白质序列为已知的。例如，NCBI网站(或GENBANK)公开登录号为AAR32098、P30307、NP 001781、AAX36531、EAW62145、EAW62149、AAX29802、AAX29802、ABP29523、EAW62148、BAG63273、AAA75741、AAE74714、AAH19089及AAA35666的人cdc25c氨基酸序列，所有这些序列通过引用以其整体结合到本文中。。就实施本发明的目的而言，cdc25c包括与SEQ ID NO：19至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列或由其组成。

虽然本发明的一方面涉及阻断经活化的Chk2对抗cdc25c的减量调节活性，但其同样地涉及阻断Chk2对抗其一种或多种其它蛋白质靶标的活性。例如，其它Chk2蛋白质靶标为E2F-1、p53、cdc25a、BRCA-1、PML、Che-1、Hdmx、Trf2、FoxM1、pRB或mdm2。此外，例如，本发明涉及阻断Chk1不仅对抗cdc25c，而且对抗p53、cdc25a、cdc25b、Rad51、聚-A-结合蛋白质、aurora-B、卷毛样激酶-1(tousled-like kinase-1)、wee-1或BLM的减量调节的活性。

所包括的以下实例系阐述本发明的某些实施方案。

实施例

进行研究以证实短肽可用于预防或减少皮肤中由于暴露至诱变物或刺激物而引起的毒性。基于先前已知咖啡因对DNA损伤修复途径的抑制作用及此抑制作用在表皮中的抗癌作用，分析某些相关的肽在类似的抑制DNA损伤修复途径上的能力。因此，测试肽阻断DNA损伤修复途径的Chk2(检查点激酶2)-cdc25c(细胞分裂周期25同源物C蛋白质)支线(arm)的能力。

被DNA损伤感知蛋白质活化的Chk2通过磷酸化作用而诱导细胞周期阻滞，并从而抑制cdc25c，其为涉及增量调节周期素依赖性激酶活性的磷酸酶，从而引起有丝分裂。这些蛋白质在DNA损伤修复途径中的相互作用及其与以下所论述的试剂的相互作用系概述于以下示意图中：

所开发的肽使用以下方法抑制cdc25c的Chk2失活作用。所有的肽均使用标准Fmoc化学，于ADVANCED CHEMTECH(LOUISVILLE，KY)APEX 396MULTIPLE PEPTIDE SYNTHESIZER上合成。在裂解之后，使用反相C-18柱，经由HPLC纯化肽，及随后通过质谱分析法分析。使用LC/MS/MS系统(ABI API2000)确认一级序列，及完成制备性纯化。此特定实例中所用的所有肽(SEQ IDNO：2-6及8-10)均已于羧基末端酰胺化(-CONH₂)。

SEQ ID NO：2-6及8-10对于cdc25c的Chk2磷酸化作用的抑制性活性根据制造商说明书，使用购自CALBIOCHEM/EMDBIOSCIENCES(SAN DIEGO，CA)的K-LISA^TM检查点活性试剂盒测量。用于这些测试的经活化人Chk2酶获自SIGMA(ST.LOUIS，MO)。一般的激酶抑制剂，星形孢菌素(10μM最终浓度)用作抑制Chk2活性的阳性对照。个别测试的肽(SEQ ID NO：2-6，8-10)与Chk2，在50μg/ml的最终浓度下培养。简言之，K-LISA^TM分析法利用一种能够使第三个丝氨酸经Chk2磷酸化(亦可经Chk1蛋白质磷酸化)的生物素化肽底物(KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR，SEQ IDNO：12)。此底物可作为cdc25c的替代物，因为SEQ ID NO：12包含经Chk2的丝氨酸磷酸化所靶向的序列。

该具有或不具有添加试剂(星形孢菌素或SEQ ID NO：2-6，8-10中之一)的含Chk2的生物素化底物肽及样品在ATP的存在下，于链霉抗生物素涂覆的96-孔板的孔中孵育。该孵育可使得在单个步骤中底物被Chk2磷酸化，及底物捕获。孵育之后，使用抗磷酸丝氨酸第一抗体、与辣根过氧物酶(HRP)缀合的第二抗体及用于显色的TMB(四甲基联苯胺)底物(该第一及第二抗体，及TMB于K-LISA^TM试剂盒中提供)检测磷酸化的底物。通过添加该试剂盒中所提供的终止溶液(Stop solution)来提高分析敏感度。读取各孔在双重波长450/540nm处的吸光度，而测定相对Chk2活性。

SEQ ID NO：2、3、5、6、8及10均抑制Chk2对抗底物肽(图2)的活性。例如，SEQ ID NO：10使Chk2磷酸化作用活性减少约48％，其接近由星形孢菌素表现的抑制活性(约69％)。SEQ ID NO：5、6及8具有类似的抑制Chk2的能力。总体而言，这些数据显示，某些肽可降低Chk2趋向其底物(即cdc25c)的活性，其进一步表明降低细胞周期阻滞水平的能力，所述细胞周期阻滞可在细胞暴露至DNA-损伤试剂时启动。

本文所公开及要求保护的所有组合物或方法不需过度试验即可根据本公开内容进行和执行。虽然本发明的组合物及方法已以某些实施方案的形式阐述，但本领域技术人员清楚的是，可在不偏离本发明的概念、精神及范围下对所述组合物及/或方法及文中所述的步骤或方法步骤中的顺序做出改变。更特别地，将清楚明了的是，化学及生理学上皆相关的某些试剂可替代文中所述的试剂，但仍可达到相同或相似的结果。对于本领域技术人员清楚明了的的所有这些类似的替代及改变仍认为在本发明的范围内。

本申请所指出的所有专利及公开均通过引用以其整体结合到本文中。

Claims

1.用于制备可用于降低活化的细胞周期检查点激酶活性的药物的肽，其中所述肽序列为SEQ ID NO:10。

2.权利要求1的肽，其中所述检查点激酶为检查点激酶-2(Chk2)。

3.用于制备可用于处理哺乳动物皮肤以降低紫外光暴露相关毒性的药物的肽，其中所述肽序列为SEQ ID NO:10。

4.权利要求1-3中任一项的肽，其中所述肽为游离酸或在其羧基端被酰胺化。

5.一种组合物，其包含权利要求1-4中任一项的肽及药学上可接受载体。

6.权利要求5的组合物，其中所述组合物呈液体、乳膏、糊剂或粉末的形式。

7.权利要求5的组合物，其中所述组合物呈喷雾剂、乳液、洗液、软膏或泡沫的形式。

8.权利要求1-4中任一项的肽在制备用于处理由UV光暴露损伤的皮肤或保持健康皮肤的药物中的用途。

9.权利要求1-4中任一项的肽在制备用于处理由UV光暴露损伤的皮肤或保持健康皮肤的美容产品中的用途。

10.权利要求5、6或7的组合物在制备用于皮肤护理治疗的药物或美容品中的用途。

11.权利要求5、6或7的组合物在制备用于保持健康皮肤特征的药物或美容品中的用途。

12.权利要求11的用途，其中所述健康皮肤特征包括保持皮肤色调、弹性、含水性、着色、紧实度和光滑度。

13.权利要求5、6或7的组合物在制备用于治疗皮肤光老化的作用的药物或美容品中的用途。

14.权利要求13的用途，其中所述治疗的皮肤光老化的作用包括皱纹、色斑和/或色素沉着过度、皮肤粗糙或皮革状、皮肤下垂或松垂、变黄、干燥及皮肤赘生物。

15.权利要求1-4中任一项的肽在制备用于处理皮肤以降低活化的细胞周期检查点激酶活性的药物或美容品中的用途。

16.权利要求1-4中任一项的肽在制备用于处理哺乳动物皮肤以降低紫外光暴露相关毒性的药物或美容品中的用途。