CN102768204A - 三味骨伤制剂中重金属的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种三味骨伤制剂中重金属的分析方法，该分析方法包括以下步骤：将三味骨伤制剂内容物加入到人工胃液中得到混悬液；将混悬液在恒温水浴中振荡1h，振荡频率为135~165r/min，然后在3500~4500r/min转速下离心5min，得到上清液；对上清液分别进行砷、汞、镉、铅、铜含量的检测。解决了三味骨伤制剂中重金属含量难以控制，安全性不高等问题。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测领域，特别地，涉及一种三味骨伤制剂中重金属的分析方法。
背景技术
三味骨伤制剂处方为马钱子粉100重量份，自然铜75重量份，广西血竭20重量份，其主要用于治疗跌打损伤和骨折，具有活血化瘀、行气止痛、续经接骨的疗效。目前公布的三味骨伤胶囊制法为将处方量的煅自然铜和血竭混合粉碎成细粉，与处方量的马钱子粉配研，过筛，混匀，制成颗粒，在35-40℃下鼓风干燥3小时，装胶囊得到规格为0.2g/粒的硬胶囊。三味骨伤制剂处方中含有37.5%的自然铜，由于含矿物质的量较大，需要对重金属的含量进行精确的检测以控制其安全性。《中国药典》中规定了的重金属检测法，但该检测方法只能粗略的估计重金属是否在规定的范围内，并且只采用了铅标准溶液作为比较，并没有对铅、镉、砷、汞、铜的含量单独进行考察，不能确定铅、镉、砷、汞、铜的含量，无法保证三味骨伤胶囊的临床使用安全性。同时现有的重金属含量检测方法重现性低，准确性差，导致检测结果不能正确反映三味骨伤胶囊中重金属的真实含量。为确保三味骨伤制剂的临床使用安全性，需要对三味骨伤制剂中重金属进行定量检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种三味骨伤制剂中重金属的分析方法，解决现有技术中三味骨伤制剂中重金属含量无法控制，检测准确性差，重现性低的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种三味骨伤制剂中重金属的分析方法，包括以下步骤：
将三味骨伤制剂内容物加入到人工胃液中得到混悬液；
将混悬液在恒温水浴中进行振荡，振荡频率为135~165r/min，然后在3500~4500r/min转速下离心，得到上清液；
对上清液分别进行砷、汞、镉、铅、铜含量的检测。
进一步地，砷的含量检测包括以下步骤：
1）建立砷标准曲线；
2）配制砷空白溶液和砷供试品溶液；
3）采用原子荧光分光光度法测定砷供试品吸收度，并根据砷标准曲线计算砷供试品中酸可溶性砷的含量。
进一步地，原子荧光分光光度法中原子化器温度为820～850℃，氩气流速为350~450mL/min，屏蔽气为750~850mL/min。
进一步地，汞的含量检测包括以下步骤：
1）建立汞标准曲线；
2）配制汞空白溶液和汞供试品溶液；
3）采用原子荧光分光光度法测定汞供试品吸收度，并根据汞标准曲线计算汞供试品中酸可溶性汞的含量。
进一步地，原子荧光分光光度法中原子化器温度为250~350℃，氩气流速为350~400mL/min，屏蔽气为750~850mL/min。
进一步地，镉的含量检测包括以下步骤：
1）建立镉标准曲线；
2）配制镉空白溶液和镉供试品溶液；
3）采用石墨原子分光光度法测定镉供试品吸收度，并根据镉标准曲线计算镉供试品中酸可溶性镉的含量。
进一步地，石墨原子分光光度法分为干燥步骤、灰化步骤和原子化步骤；干燥步骤为在110~120℃的温度下干燥25s；灰化步骤为在400~500℃的温度下灰化20s；原子化步骤为在1850~1950℃的温度下原子化5s。
进一步地，铜的含量检测包括以下步骤：
1）建立铜标准曲线；
2）配制铜空白溶液和铜供试品溶液；
3）采用火焰原子分光光度法测定铜供试品吸收度，并根据铜标准曲线计算铜供试品中酸可溶性铜的含量。
进一步地，铅的含量测定包括以下步骤：
1）建立铅标准曲线；
2）配制铅空白溶液和铅供试品溶液；
3）采用石墨原子分光光度法测定铅供试品吸收度，并根据铅标准曲线计算铅供试品中酸可溶性铅的含量。
进一步地，石墨原子分光光度法分为干燥步骤、灰化步骤和原子化步骤；干燥步骤为在115~125℃的温度下干燥30s；灰化步骤为在750~850℃的温度下灰化20s；原子化步骤为在1650~1800℃的温度下原子化5s。
本发明具有以下有益效果：
本发明将三味骨伤制剂在胃酸中进行溶解，并分别对三味骨伤制剂中溶于胃酸的铅、镉、砷、汞、铜等重金属含量进行定量检测，使人体实际吸收的各种重金属控制在WHO规定的限度范围内，保证了重金属检测的准确性和三味骨伤制剂的安全性。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照实施例，对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下结合说明书对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
三味骨伤制剂的处方中马钱子粉为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子的炮制加工品，购自同仁堂饮片厂；自然铜为硫化物类矿物族黄铁矿，主要成分为二硫化铁。广西血竭为百合科植物剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提制得到的树脂。
本发明提供了一种三味骨伤制剂中重金属的分析方法，将三味骨伤制剂内容物加入到人工胃液检测人工胃液中砷、汞、镉、铅、铜等重金属含量。三味骨伤胶囊处方中含有37.5%的自然铜，由于含矿物质的量较大，按照《中国药典》中的重金属检测法检测，重金属含量远远超过了《中国药典》规定的重金属含量限度。重金属含量若超标，将在体内与蛋白质和酶发生相互作用，使蛋白质和酶失去活性；或者累积在器官中，造成急性或者慢性中毒。为了保证三味骨伤胶囊的安全性，本发明将三味骨伤制剂内容物溶解于人工胃液中，检测人体实际吸收重金属的含量。从检测结果中得到溶于人工胃液的重金属含量为0.07~0.14ppm，完全低于《中国药典》规定的重金属含量限度。由此可知三味骨伤胶囊中的大部分重金属并不溶解于胃液中，不能被人体吸收，因此对人体不构成威胁。现有技术中对重金属含量的检测都只考察药物中含有的总重金属含量，并没有对人体实际吸收的重金属含量进行考察；这样的检测方法过于死板，由于三味骨伤制剂的处方中含有矿物质，为了满足现有技术中对重金属含量的限制，不得不降低矿物质的含量，导致三味骨伤制剂的药效降低。本发明将三味骨伤制剂进行胃酸溶解后，不但能准确检测出人体实际吸收的重金属含量，保证临床应用的安全性；而且放宽了对三味骨伤制剂处方中自然铜含量的限制，保证了三味骨伤制剂的药效，从而使三味骨伤制剂的质量检测方法更具适用性。人工胃液按照《中国药典》2005年版一部附录ⅫA制备。
上述重金属的测定方法为：将三味骨伤制剂内容物加入到人工胃液中得到混悬液，将混悬液在37℃恒温水浴中振荡1小时，振荡频率为135~165r/min，然后在3500~4500r/min转速下离心5min，得到上清液作为重金属供试品；将重金属供试品分别进行砷、汞、镉、铅、铜等重金属含量的检测。将三味骨伤制剂内容物溶于人工胃液中，模拟胃的消化环境，以振荡频率为135~165r/min进行震荡提取1小时后，三味骨伤制剂中的酸可溶性重金属能完全提取出来，若继续加大震荡频率或提取时间，酸可溶性重金属含量不再上升。然后将提取液在4000r/min转速下离心5min，离心操作可以将酸可溶性重金属与不溶于人工胃液的重金属完全分离出来，使离心后的上清液中酸可溶性重金属的含量能真实反映出人体实际吸收的重金 属含量，保证了三味骨伤胶囊的人体用药安全性。若振荡频率过低，则重金属提取不完全，无法保证检测得到的重金属含量的准确性。
按照《中国药典》中重金属的检测方法，只能粗略的估计重金属是否在规定的范围内，并且只采用了铅标准溶液作为比较，不能准确的反映三味骨伤胶囊中砷、汞、铜、镉等重金属的含量，可能存在安全隐患。为了更加严格的控制三味骨伤胶囊中重金属的含量，保证重金属含量检测的准确性，本发明将重金属中的镉、铅和铜采用原子分光光度法进行定量检测，精密度高、准确度强；重金属中砷、汞若采用原子分光光度法检测，吸光值太低，仪器误差大，重现性不好，测定结果的准确性较差，本发明采用原子荧光光谱法测定酸可溶性砷和汞的含量，原子荧光光谱法的灵敏度要比用原子吸收分光光谱法测定高几百倍，精密度更好，检测更准确。
以下砷、汞、铅、镉、铜单元素标准品由国家标准物质研究中心提供。
酸可溶性砷的含量测定方法按照原子荧光光谱法检测，具体步骤为：
1）建立砷标准曲线；
2）配制砷空白溶液和砷供试品溶液；
3）采用原子荧光分光光度法测定砷供试品吸收度，并根据砷标准曲线计算砷供试品中酸可溶性砷的含量。
砷标准曲线的制备方法为：将50v/v%浓度为1.8mol/L的硫酸溶液，10v/v%浓度为50g/L硫脲，与40v/v%的水混合成稀释液，分别量取砷单元素标准品用稀释液稀释得到浓度为0ng/mL的砷溶液A、1ng/mL的砷溶液B、3ng/mL的砷溶液C、5ng/mL的砷溶液D、7ng/mL的砷溶液E、10ng/mL的砷溶液F。分别吸取1mL砷溶液A~F注入原子化器中，调整光电倍增管电压为400V，砷空心阴极灯电流为35mA，原子化器温度为820～850℃，高度为8mm，氩气流速为350~450mL/min，屏蔽气为750~850mL/min，以1wt%盐酸溶液作为载流液，1wt%硼氢化钠和0.3wt%氢氧化钠的混合溶液作为还原剂测定砷溶液A~F的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制砷标准曲线。
砷空白溶液的制备：量取20v/v%的人工胃液，加入50v/v%浓度为1.8mol/L的硫酸溶液，加10v/v%浓度为50g/L的硫脲，与20v/v%水摇匀，得到砷空白溶液。
砷供试品溶液的制备：量取20v/v%三味骨伤制剂的上清液，加入50v/v%浓度为1.8mol/L的硫酸溶液，加10v/v%浓度为50g/L硫脲，与20v/v%水摇匀，得到砷供试品溶液。
本发明采用原子荧光分光光度计的检测酸可溶性砷的含量，专属性强，准确性高，重现性好，检测方法稳定可靠。砷供试品溶液制备中，将供试品用硫酸溶液分解，加入硫脲，硫脲作为预还原剂能将五价砷（As5+）还原成三价砷（As3+），同时抑制了镍、钴、铜等金属离子的干扰，保证了检测结果稳定。硫脲的浓度越高，则荧光强度越大，本发明选择浓度为50g/L硫脲，砷的荧光强度能保持基本稳定。
酸可溶性汞的含量测定方法按照原子荧光光谱法检测，具有步骤为：
1）建立汞标准曲线。
2）配制汞空白溶液和汞供试品溶液。
3）按照原子荧光分光光度法测定汞供试品溶液的吸收度，并根据汞标准曲线计算汞供试溶液中酸可溶性汞的含量。
汞标准曲线的制备方法为：分别将汞单元素标准品用浓度为1.6mol/L的硝酸溶液稀释得到浓度为0ng/mL的汞溶液A、0.4ng/mL的汞溶液B、0.8ng/mL的汞溶液C、1.2ng/mL的汞溶液D、1.6ng/mL的汞溶液E、2ng/mL的汞溶液F。分别精密吸取1mL汞溶液A~F注入原子化器，调整光电倍增管电压为240V，汞空心阴极灯电流为30mA，原子化器温度为250~350℃，高度为8mm，氩气流速为350~400mL/min，屏蔽气为750~850mL/min，以1wt%盐酸溶液作为载流液，0.5wt%硼氢化钠和0.1wt%氢氧化钠的混合溶液作为还原剂测定汞溶液A~F的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制汞标准曲线。
汞空白溶液的制备方法为：量取20v/v%的人工胃液与80v/v%浓度为1.6mol/L的硝酸溶液混匀得到汞空白溶液。
汞供试品溶液的制备方法为：量取20v/v%的三味骨伤制剂的上清液与80v/v%浓度为1.6mol/L的硝酸溶液混匀得到汞供试品溶液。
在汞供试品溶液制备中，将供试品用硝酸溶液分解，用0.5%硼氢化钠和0.1%氢氧化钠的溶液作为还原剂，将共价态汞还原成金属汞，用惰性气体氩气载入石英原子化器中原子化，在汞空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，检测砷原子的荧光度。荧光度的大小反映了酸可溶性供试液中汞含量的大小。按照本发明的原子荧光分光光度法进行酸可溶性汞的含量检测，专属性强，准确度高，灵敏度高，迅速，能正确反映三味骨伤胶囊中酸可溶性汞的含量，重现性好，检测方法稳定可靠。
酸可溶性镉的含量测定方法按照石墨原子分光光度法检测，具有步骤为：
1）建立镉标准曲线。
2）配制镉空白溶液和镉供试品溶液。
3）按照石墨原子分光光度法测定镉供试品溶液的吸收度，并根据镉标准曲线计算镉供试品中酸可溶性镉的含量。
镉标准曲线的制备方法为：分别取镉单元素标准品用0.2wt%的硝酸溶液制成浓度为0ng/mL的镉溶液A、1ng/mL的镉溶液B、5ng/mL的镉溶液C、7ng/mL的镉溶液D、10ng/mL的镉溶液E，调整原子分光光度计灯电流为5mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为228.8nm，分别将铜溶液A~E在110~120℃的温度下干燥25s，在400~500℃的温度下灰化20s，在1850~1950℃的温度下原子化5s，以1wt%磷酸二氢铵与0.2wt%硝酸镁的混合溶液为基体改进剂检测镉溶液A~E的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制镉标准曲线。
镉空白溶液的制备方法为：以人工胃液作镉空白溶液。
镉供试品溶液的制备方法为：三味骨伤制剂的上清液为镉的供试品溶液。
本发明采用石墨原子分光光度法检测酸可溶性镉的含量，精密度高，准确性强，检测结果可信度高。在原子分光光度计中，调整灯电流为5mA，狭缝宽度为0.5nm，保证检测干扰小，准确度更高。镉元素在228.8nm的波长处有最大吸收，因此检测波长设置为228.8nm。干燥温度为110~120℃，将镉溶液A～E干燥的目的是去除水分，防止镉溶液在灰化时爆沸点溢出，导致样品损失，测量结果不准确；灰化温度为400~500℃，镉原子能灰化完全，并且不会导致金属原子损失。原子化温度为1850~1950℃，能将镉元素充分原子化，原子化温度太低则不能使金属原子化。
酸可溶性铅的含量测定方法按照石墨原子分光光度法检测，具有步骤为：
1）建立铅标准曲线。
2）配制铅空白溶液和铅供试品溶液。
3）按照石墨原子分光光度法测定铅供试品溶液的吸收度，并根据铅标准曲线计算酸供试品中酸可溶性铅的含量。
铅线性曲线的制备方法为：分别量取铅单元素标准品用2wt%硝酸溶液制成浓度为0ng/mL的铅溶液A、10ng/mL的铅溶液B、20ng/mL的铅溶液C、30ng/mL的铅溶液D、40ng/mL的铅溶液E、50ng/mL的铅溶液F；调整原子分光光度计灯电流为10mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为283.3nm，分别将铅溶液A~F在115~125℃的温度下干燥30s，在750~850℃的温度下灰化20s，在1650~1800℃的温度下原子化5s，以1wt%磷酸二氢铵和0.2wt%硝酸镁的混合溶液为基体改进剂检测溶液A~F的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制铅标准曲线；
铅空白溶液的制备方法为：以人工胃液作为铅空白溶液。
铅供试品溶液的制备方法为：三味骨伤制剂的上清液为铅的供试品溶液。
本发明采用石墨原子分光光度法检测酸可溶性铅的含量，精密度高，准确性强，检测结果可信度高。本发明调整石墨原子分光光度计的灯电流为10mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为283.3nm，使检测器干扰更少，准确性更高。干燥温度为115~125℃，将铅溶液A~F去除水分，防止铅溶液在灰化时爆沸点溢出，导致样品损失，测量结果不准确；当灰化温度为750~800℃时，铅原子能灰化完全，并且不会导致金属原子损失；当温度达到1650~1800℃时，能将铅元素完全原子化，以便检测器检测，保证测量的准确性。
酸可溶性铜的含量测定方法按照火焰原子分光光度法检测，具有步骤为：
1）建立铜标准曲线。
2）配制铜空白溶液和铜供试品溶液。
3）按照火焰原子分光光度法测定铜供试品溶液的吸收度，并根据铜标准曲线计算铜供试品中酸可溶性铜的含量。
铜标准曲线的制备：分别精密量取铜单元素标准品加2wt%的硝酸溶液稀释，得到浓度分别为0.050μg/mL铜溶液A，0.200μg/mL铜溶液B，0.400μg/mL铜溶液C，0.600μg/mL的铜溶液D，0.800μg/mL的铜溶液E。调整原子分光光度计乙炔流量为1.1L/min，助燃器高度为7.0mm,，狭缝宽度为0.5nm，波长为324.7nm，分别将上述铜溶液A~E在火焰中燃烧，检测铜溶液A~E的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制铜标准曲线。
铜空白溶液的制备方法为：以人工胃液作为铜空白溶液。
铜供试品溶液的制备方法为：重三味骨伤制剂的上清液为铜的供试品溶液。
本发明采用火焰原子分光光度法检测酸可溶性铜的含量，精密度高，准确性强，检测结果可信度高。原子分光光度计中乙炔流量影响火焰的温度，当乙炔流量为1.1L/min，火焰温度能将铜溶液中的铜充分燃烧；助燃器高度影响检测的准确性，当助燃气高度为7.0mm时，线性良好，不影响检测结构；狭缝宽度影响光谱通带与检测器接收辐射的能量，如果狭缝宽度不合适，干扰线进入光谱通带内，吸光度值明显减小，影响检测结果；当狭缝宽度为0.5nm时，能使吸收线和邻近的干扰线分开，保证检测准确性。铜元素在324.7nm波长处有最大吸收，所以将原子分光光度计的波长调整为324.7nm。
三味骨伤制剂为片剂、胶囊、口服液等常用剂型。
根据上述砷、汞、铜、铅、镉等重金属含量的检测方法检测得到三味骨伤制剂中重金属的含量限度为：铅不得过百万分之二十；镉不得过千万分之一；砷不得过百万分之十；汞不得过千万分之五；铜不得过百万分之二十。根据上述重金属含量的限度计算，按照三味骨伤制剂的每天最大摄入量，计算三味骨伤制剂中重金属的含量，计算结果为三味骨伤制剂中砷、汞、铜、铅、镉的含量均低于WHO规定的每人每天摄入的最大含量，证明本发明的三味骨伤制剂中对重金属含量限度的控制是安全的。
实施例
以下实施例中所用的仪器和材料均为市售。以下三味骨伤制剂以三味骨伤胶囊为代表进行酸可溶性重金属检测，其余三味骨伤片、三味骨伤口服液等制剂中重金属的检测均按照三味骨伤胶囊中酸可溶性重金属的检测方法检测。
实施例1~6酸可溶性重金属的提取
将三味骨伤胶囊（由湖南方盛制药提供，批号：071101）的内容物0.3g加入到50mL人工胃液中得到混悬液，将混悬液在37℃恒温水浴中振荡提取1h，震荡频率为135~165r/min；然后在3500~4500r/min转速下离心5min，取上清液得分别进行砷、汞、镉、铅、铜等重金属含量的检测。
采用原子荧光分光光度法绘制砷标准曲线并测定上清液中砷的吸收度；砷标准曲线上砷的吸收度所对应的浓度即为三味骨伤胶囊中酸可溶性砷的浓度。砷含量=砷浓度÷三味骨伤胶囊浓度。
采用原子荧光分光光度法绘制汞标准去选并测定上清液中汞的吸收度；汞标准曲线上汞 的吸收度所对应的浓度即为三味骨伤胶囊中酸可溶性汞的浓度。汞含量=汞浓度÷三味骨伤胶囊浓度。
采用石墨原子分光光度法绘制镉标准曲线并测定上清液中镉的吸收度；镉标准曲线上镉的吸收度所对应的浓度即为三味骨伤胶囊中酸可溶性镉的浓度。镉含量=镉浓度÷三味骨伤胶囊浓度。
采用火焰原子分光光度法绘制铜标准曲线并测定上清液中铜的吸收度；铜标准曲线上铜的吸收度所对应的浓度即为三味骨伤胶囊中酸可溶性铜的浓度。铜含量=铜浓度÷三味骨伤胶囊浓度。
采用石墨原子分光光度法绘制铅标准曲线并测定上清液中铅的吸收度；铅标准曲线上铅的吸收度所对应的浓度即为三味骨伤胶囊中酸可溶性铅的浓度。铅含量=铅浓度÷三味骨伤胶囊浓度。
表1为实施例1~6，对比例1~4的重金属检测结果。
表1酸可溶性重金属的提取参数的考察结果表
从表1的实验结果可知，按照实施例1~6的提取方法，三味骨伤胶囊中的重金属提取的比较完全。实施例2中各重金属含量最高，为本发明提取方法中最优实施例。
实施例7酸可溶性砷的测定方法
砷标准曲线的制备方法为：将50v/v%浓度为1.8mol/L的硫酸溶液，10v/v%浓度为50g/L硫脲，与40v/v%的水混合成稀释液，分别量取砷单元素标准品用稀释液稀释得到浓度为0ng/mL的砷溶液A、1ng/mL的砷溶液B、3ng/mL的砷溶液C、5ng/mL的砷溶液D、7ng/mL的砷溶液E、10ng/mL的砷溶液F。分别吸取1mL砷溶液A~F注入原子化器中，调整光电倍增管电压为400V，砷空心阴极灯电流为35mA，原子化器温度为835℃，高度为8mm，氩气流速为400mL/min，屏蔽气为800mL/min，以1wt%盐酸溶液作为载流液，1wt%硼氢化钠和0.3wt%氢氧化钠的混合溶液作为还原剂测定砷溶液A~F的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度 为横坐标，绘制砷标准曲线。
砷空白溶液的制备：量取20v/v%的人工胃液，加入50v/v%浓度为1.8mol/L的硫酸溶液，加10v/v%浓度为50g/L的硫脲，与20v/v%水摇匀，得到酸可溶性砷空白溶液。
砷供试品溶液的制备：量取20v/v%三味骨伤制剂的上清液，加入50v/v%浓度为1.8mol/L的硫酸溶液，加10v/v%浓度为50g/L硫脲，与20v/v%水摇匀，得到酸可溶性砷供试品溶液。
吸收度的测定方法为：按照按照砷标准曲线的制备项下吸光度的测定方法测定砷供试品溶液的吸收度，并根据砷标准曲线计算砷供试品中酸可溶性砷的含量。
实施例8酸可溶性砷的测定方法
修改实施例7中光电倍增管电压为400V，砷空心阴极灯电流为35mA，原子化器温度为820℃，高度为8mm，氩气流速为350mL/min，屏蔽气为750mL/min，其余的检测方法按照实施例7的方法执行。
实施例9酸可溶性砷的测定方法
修改实施例7中光电倍增管电压为400V，砷空心阴极灯电流为35mA，原子化器温度为850℃，高度为8mm，氩气流速为450mL/min，屏蔽气为850mL/min，其余的检测方法按照实施例7的方法执行。
实施例10酸可溶性汞的测定方法
汞标准曲线的制备方法为：分别将汞单元素标准品用浓度为1.6mol/L的硝酸溶液稀释得到浓度为0ng/mL的汞溶液A、0.4ng/mL的汞溶液B、0.8ng/mL的汞溶液C、1.2ng/mL的汞溶液D、1.6ng/mL的汞溶液E、2ng/mL的汞溶液F。分别精密吸取1mL汞溶液A~F注入原子化器，调整光电倍增管电压为240V，汞空心阴极灯电流为30mA，原子化器温度为300℃，高度为8mm，氩气流速为375mL/min，屏蔽气为800mL/min，以1wt%盐酸溶液作为载流液，0.5wt%硼氢化钠和0.1wt%氢氧化钠的混合溶液作为还原剂测定汞溶液A～F的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制汞标准曲线。
汞空白溶液的制备方法为：量取20v/v%的人工胃液与80v/v%浓度为1.6mol/L的硝酸溶液混匀得到酸可溶性汞空白溶液。
汞供试品溶液的制备方法为：量取20v/v%的三味骨伤制剂的上清液与80v/v%浓度为1.6mol/L的硝酸溶液混匀得到酸可溶性汞供试品溶液。
吸收度的测定方法为：按照汞标准曲线的制备项下吸光度的测定方法测定汞供试品溶液的吸收度，并根据汞标准曲线计算汞供试品中酸可溶性汞的含量。
实施例11酸可溶性汞的测定方法
修改实施例10中光电倍增管电压为240V，汞空心阴极灯电流为30mA，原子化器温度为250℃，高度为8mm，氩气流速为350mL/min，屏蔽气为750mL/min，其余的检测方法按 照实施例10的方法执行。
实施例12酸可溶性汞的测定方法
修改实施例10中光电倍增管电压为240V，汞空心阴极灯电流为30mA，原子化器温度为350℃，高度为8mm，氩气流速为400mL/min，屏蔽气为850mL/min，其余的检测方法按照实施例10的方法执行。
实施例13酸可溶性镉的测定方法
镉标准曲线的制备方法为：分别取镉单元素标准品用0.2wt%的硝酸溶液制成浓度为0ng/mL的镉溶液A、1ng/mL的镉溶液B、5ng/mL的镉溶液C、7ng/mL的镉溶液D、10ng/mL的镉溶液E，调整原子分光光度计灯电流为5mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为228.8nm，分别将铜溶液A~E在110℃的温度下干燥25s，在450℃的温度下灰化20s，在1900℃的温度下原子化5s，以1wt%磷酸二氢铵与0.2wt%硝酸镁的混合溶液为基体改进剂检测镉溶液A~E的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制镉标准曲线。
镉空白溶液的制备方法为：以人工胃液作为酸可溶性镉空白溶液。
镉供试品溶液的制备方法为：以三味骨伤制剂的上清液为镉的供试品溶液。
吸收度的测定方法为：按照镉标准曲线的制备项下吸光度的测定方法测定镉供试品溶液的吸收度，并根据镉标准曲线计算镉供试品中酸可溶性镉的含量。
实施例14酸可溶性镉的测定方法
修改实施例13中调整原子分光光度计灯电流为5mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为228.8nm，分别将上述镉溶液A~E在120℃的温度下干燥25s，在500℃的温度下灰化20s，在1950℃的温度下原子化5s，其余的检测方法按照实施例13的方法执行。
实施例15酸可溶性镉的测定方法
修改实施例13中调整原子分光光度计灯电流为5mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为228.8nm，分别将上述镉溶液A~E在115℃的温度下干燥25s，在400℃的温度下灰化20s，在1850℃的温度下原子化5s，其余的检测方法按照实施例13的方法执行。
实施例16酸可溶性铅的测定方法
铅线性曲线的制备方法为：分别量取铅单元素标准品用2wt%硝酸溶液制成浓度为0ng/mL的铅溶液A、10ng/mL的铅溶液B、20ng/mL的铅溶液C、30ng/mL的铅溶液D、40ng/mL的铅溶液E、50ng/mL的铅溶液F；调整原子分光光度计灯电流为10mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为283.3nm，分别将铅溶液A~F在120℃的温度下干燥30s，在800℃的温度下灰化20s，在1700℃的温度下原子化5s，以1wt%磷酸二氢铵和0.2wt%硝酸镁的混合溶液为基体改进剂检测溶液A~F的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制铅标准曲线；
铅空白溶液的制备方法为：以人工胃液作为酸可溶性铅空白溶液；
铅供试品溶液的制备方法为：以三味骨伤制剂的上清液为酸可溶性铅的供试品溶液。
吸收度的测定方法为：按照铅标准曲线的制备项下吸光度的测定方法测定铅供试品溶液的吸收度，并根据铅标准曲线计算铅供试品中酸可溶性铅的含量。
实施例17酸可溶性铅的测定方法
修改实施例16中调整原子分光光度计灯电流为10mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为283.3nm，分别将上述铅溶液A~F在125℃的温度下干燥30s，在750℃的温度下灰化20s，在1800℃的温度下原子化5s，其余的检测方法按照实施例16的方法执行。
实施例18酸可溶性铅的测定方法
修改实施例16中调整原子分光光度计灯电流为10mA，狭缝宽度为0.5nm，波长为283.3nm，分别将上述铅溶液A~F在115℃的温度下干燥30s，在850℃的温度下灰化20s，在1650℃的温度下原子化5s，其余的检测方法按照实施例16的方法执行。
实施例19酸可溶性铜的测定方
铜标准曲线的制备：分别精密量取铜单元素标准品加2wt%的硝酸溶液稀释，得到浓度分别为0.050μg/mL铜溶液A，0.200μg/mL铜溶液B，0.400μg/mL铜溶液C，0.600μg/mL的铜溶液D，0.800μg/mL的铜溶液E。调整原子分光光度计乙炔流量为1.1L/min，助燃器高度为7.0mm,，狭缝宽度为0.5nm，波长为324.7nm，分别将上述铜溶液A~E在火焰中燃烧，检测铜溶液A~E的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制铜标准曲线；
铜空白溶液的制备方法为：以人工胃液作为铜空白溶液；
铜供试品溶液的制备方法为：以三味骨伤制剂的上清液为铜的供试品溶液。
吸收度测定方法为：按照铜标准曲线的制备项下吸光度的测定方法测定铜供试品溶液的吸收度，并根据铜标准曲线计算铜供试品中酸可溶性铜的含量。
重金属检测方法回收率试验
以下回收率试验中的三味骨伤制剂为三味骨伤胶囊，由湖南方盛制药股份有限公司提供，批号为：071101。
酸可溶砷检测方法的回收率试验
取18份三味骨伤胶囊内容物，每份约0.1g，精密称定，精密加入砷标准溶液（5mg/L）0.5mL，再加人工胃液至50mL量瓶中，于37℃恒温水浴振荡提取1h，震荡频率为150r/min，离心（4000r/min）5min，取上清液按照实施例7~9的分析方法考察回收率。
表2砷的回收率试验
从表2可知，实施例7~9的检测方法稳定可靠，回收率高，精密度良好，重现性高。其中实施例7和实施例9的回收率最高，酸可溶性砷检测方法的最佳实施例。
酸可溶性汞检测方法的回收率试验
取十八份三味骨伤胶囊内容物，每份约0.1g，精密称定，精密加入标准汞溶液（1ug/mL）0.5mL，再加入人工胃液至50mL，于37℃恒温水浴振荡提取1h，震荡频率为150r/min，离心（4000r/min）5min，取上清液按照实施例10~12的分析方法考察回收率。
表3汞的回收率试验
从表3可知，实施例10~12的检测方法稳定可靠，回收率高，精密度良好，重现性高。其中实施例10的回收率最高，酸可溶性砷检测方法的最佳实施例。
酸可溶性镉检测方法的回收率试验
取六份三味骨伤胶囊内容物，每份约0.1g，精密称定，精密加入镉标准溶液（0.2mg/L）1.0mL，再加人工胃液至50mL量瓶中，于37℃恒温水浴振荡提取1h，震荡频率为150r/min，离心（4000r/min）5min，取上清液按照实施例13~15的分析方法考察回收率。
表4镉的回收率试验
从表4可知，实施例13~15的检测方法稳定可靠，回收率高，精密度良好，重现性高。其中实施例13和实施例15的回收率最高，酸可溶性砷检测方法的最佳实施例。
酸可溶性铅检测方法的回收率试验：
取六份三味骨伤胶囊内容物，每份约0.1g，精密称定，精密加入铅标准溶液（10ug/mL）0.5mL，再加人工胃液至50mL量瓶中，于37℃恒温水浴振荡提取1h，震荡频率为150r/min，离心（4000r/min）5min，取上清液按照实施例16~18的分析方法考察回收率。
表5铅的回收率试验
从表5可知，实施例16~18的检测方法稳定可靠，回收率高，精密度良好，重现性高。其中实施例16的回收率最高，酸可溶性砷检测方法的最佳实施例。
酸可溶铜检测方法的回收率试验
取六份三味骨伤胶囊内容物，每份约0.1g，精密称定，精密加入铜标准溶液（10mg/L）1.0mL，再加人工胃液至50mL量瓶中，于37℃恒温水浴振荡提取1h，震荡频率为150r/min，离心（4000r/min）5min，取上清液按照实施例19的分析方法考察回收率。
表6铜的回收率试验
从表6可知，实施例19的检测方法稳定可靠，精密度良好，重现性高。对三味骨伤胶囊中总重金属与酸可溶性重金属含量的比较
总金属供试液的制备方法为：分别取三味骨伤胶囊内容物0.3g，置消解管中，加入8.0mL硝酸得到溶液a。将装有溶液a的消解管加盖，静置过夜后，在5分钟内升温至125℃后保持1分钟，然后在3分钟内升温至160℃后保持5分钟，最后在5分钟内升温至200℃后保持20 分钟得到溶液a1；将溶液a1放冷，置电热板上，在120℃加热至溶液体积为1～2mL时转移至10mL具塞塑料离心管中，加水至刻度，摇匀，3000转/分离心10分钟得到溶液a2。取离心后的溶液a2的上清液得到总重金属供试溶液。
酸可溶性重金属供试液的制备方法：精密称取三味骨伤胶囊内容物0.1g，加入到50mL的人工胃液中，于37℃恒温水浴振荡提取1h，震荡频率为150r/min，然后在4000r/min转速下离心5min，取上清液得到酸可溶性重金属供试液a2。
总金属空白溶液的制备：按照总重金属供试液的制备方法得到总重金属空白溶液a，空白溶液a中不含三味骨伤胶囊内容物。精密量取2.0mL空白溶液a，置10mL量瓶中，加浓度为1.8mol/L的硫酸溶液5mL，浓度为50g/L的硫脲1mL，加水稀释至刻度，摇匀得到总重金属空白溶液。
酸可溶性重金属空白溶剂的制备：以人工胃液作为溶剂空白。
基准工作对照溶液的制备：取基准工作对照物0.3g按照总重金属供试液的制备方法制备得到对照液a；量取2.0mL对照液a，加浓度为1.8mol/L的硫酸溶液5mL，加浓度为50g/L的硫脲1mL，水2mL混匀，得到基准工作对照溶液。
分别按照实施例7~19的检测方法，检测表7中总重金属和酸可溶性重金属的含量。
表7三味骨伤胶囊中总重金属与酸可溶性重金属的比较
从表7的实验结果可知，按照实施例7~19方法检测得到中酸可溶性重金属的含量大大低于其所含的总重金属量，证明人体实际摄入的重金属大大低于三味骨伤胶囊中总重金属含量；通过实施例7~9方法检测得到的砷含量、实施例10~12方法检测得到的汞含量、实施例13~15方法检测得到的铅含量、实施例16~18方法检测得到的镉含量，偏差均小于2%，证明实施例7~19准确度高，精密度高。
根据测定结果暂定三味骨伤胶囊中酸可溶性重金属的含量上限为：铅不得过百万分之二 十；镉不得过千万分之一；砷不得过百万分之十；汞不得过千万分之五；铜不得过百万分之二十。总重金属含量上限为：铅不得过十万分之十五；镉不得过千万分之三；砷不得过万分之一；汞不得过千万分之五；铜不得过百万分之五十。
按照上述酸可溶性重金属含量上限计算每日每人最高摄入酸可溶性重金属的含量。
三味骨伤胶囊规格：每粒装0.2g；用法用量：口服，一次2粒，一日3次。一天最高摄入量为6粒，总药物量为1.2g。表8为酸溶性重金属和砷盐的每日每人最高摄入量表。
表8酸溶性重金属和砷盐的每日每人最高摄入量表
从试验结果可知，WHO限量标准为体重60kg成人每日最大摄入量(总重金属含量)分别为铅0.214mg；镉60μg；砷0.128mg；汞43μg，经按暂定三味骨伤胶囊中总重金属含量上限计算每日每人最高摄入量，结果表明人每日最高摄入总重金属总量和酸可溶性重金属总量均小于WHO规定的人每日最高摄入标准限量。因此服用本发明的三味骨伤胶囊是安全的。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种三味骨伤制剂中重金属的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
将三味骨伤制剂内容物加入到人工胃液中得到混悬液；
将所述混悬液在恒温水浴中进行振荡，振荡频率为135~165r/min，然后在3500~4500r/min转速下离心，得到上清液；
对所述上清液分别进行砷、汞、镉、铅、铜含量的检测。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述砷的含量检测包括以下步骤：
1）建立砷标准曲线；
2）配制砷空白溶液和砷供试品溶液；
3）采用原子荧光分光光度法测定所述砷供试品吸收度，并根据所述砷标准曲线计算所述砷供试品中酸可溶性砷的含量。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述原子荧光分光光度法中原子化器温度为820～850℃，氩气流速为350~450mL/min，屏蔽气为750~850mL/min。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述汞的含量检测包括以下步骤：
1）建立汞标准曲线；
2）配制汞空白溶液和汞供试品溶液；
3）采用原子荧光分光光度法测定所述汞供试品吸收度，并根据所述汞标准曲线计算所述汞供试品中酸可溶性汞的含量。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述原子荧光分光光度法中原子化器温度为250~350℃，氩气流速为350~400mL/min，屏蔽气为750~850mL/min。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述镉的含量检测包括以下步骤：
1）建立镉标准曲线；
2）配制镉空白溶液和镉供试品溶液；
3）采用石墨原子分光光度法测定所述镉供试品吸收度，并根据所述镉标准曲线计算
所述镉供试品中酸可溶性镉的含量。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述石墨原子分光光度法分为干燥步骤、灰化步骤和原子化步骤；所述干燥步骤为在110~120℃的温度下干燥25s；所述灰化步骤为在400~500℃的温度下灰化20s；所述原子化步骤为在1850~1950℃的温度下原子化5s。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述铜的含量检测包括以下步骤：
1）建立铜标准曲线；
2）配制铜空白溶液和铜供试品溶液；
3）采用火焰原子分光光度法测定所述铜供试品吸收度，并根据所述铜标准曲线计算所述铜供试品中酸可溶性铜的含量。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述铅的含量测定包括以下步骤：
1）建立铅标准曲线；
2）配制铅空白溶液和铅供试品溶液；
3）采用石墨原子分光光度法测定所述铅供试品吸收度，并根据所述铅标准曲线计算所述铅供试品中酸可溶性铅的含量。
10.根据权利要求9所述的分析方法，其特征在于，所述石墨原子分光光度法分为干燥步骤、灰化步骤和原子化步骤；所述干燥步骤为在115~125℃的温度下干燥30s；所述灰化步骤为在750~850℃的温度下灰化20s；所述原子化步骤为在1650~1800℃的温度下原子化5s。
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