CN102757946B

CN102757946B - 稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102757946B
Application number: CN201110108639.8A
Authority: CN
Inventors: 王子健; 杨丽华; 査金苗
Original assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Current assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2031-04-28
Also published as: CN102757946A

Abstract

本发明公开了一种稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase及其编码基因和应用。本发明提供的稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na⁺/K⁺-ATPase活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白质的编码基因，并设计了基于所述基因的特异引物对。在含有肾上腺激素干扰物的水环境中养殖，稀有鮈鲫的稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的表达量发生了变化，且具有剂量-效应关系，从而所述特异引物对可应用于辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素干扰物。本发明的方法具有简便、快捷、准确的优点。

Description

稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于分子生物学及环境生物学领域，涉及一种稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase及其编码基因和应用，以及基于所述编码基因的引物对及其在辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物中的应用。

背景技术

Na⁺/K⁺-ATPase又称钠泵，它能催化ATP水解供能，驱动Na⁺和K⁺于细胞膜两侧的对向运输，维持着细胞膜两侧的膜电位、调节细胞渗透压，为营养物质的吸收提供动力，并在神经和肌肉细胞的冲动传导等方面起着重要作用。鱼类终生生活在水环境中，其体液与外界往往是不等渗的，因此必须进行渗透压调节，以维持生命所需的水盐平衡。Na⁺/K⁺-ATPase是评价鱼类渗透压调节功能的一个重要指标。鱼类Na⁺/K⁺-ATPase的基本结构包括一个α亚基和一个β亚基，通过这两个亚单位异构型的变化调控Na⁺/K⁺-ATPase的生物活性。目前已经证实α和β亚基由不同基因编码，其中α亚基分子量较大(约110kD)，含有功能酶的酶促反应结构域，而β亚基分子量较小(约55kD)，其作用目前不十分明确，现有的研究表明，它可能是维持钠钾泵稳定性及正确膜定位的必要组成部分。

硬骨鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPI)不仅在调控对环境胁迫的应激反应中占主导地位，而且在渗透压调节方面也有至关重要的作用。近年来随着对环境中内分泌干扰物研究的不断扩展和深入，越来越多的研究表明，除已受到广泛关注的生殖系统和甲状腺系统外，鱼类肾上腺系统也是内分泌干扰物的重要作用靶之一。皮质醇是鱼类应激反应的重要指标之一，同时也是硬骨鱼类体内最重要的肾上腺皮质激素，具有调节鱼体内碳水化合物的新陈代谢和离子平衡的功能。有研究表明当血液皮质醇水平的变化时，鱼体内Na⁺/K⁺-ATPase活性及离子浓度均会发生变化[Waring，C.P.和Moore，A.，The effect of atrazine on Atlantic salmon(Salmo salar)smolts in fresh waterand after sea water transfer.Aquat Toxicol，66：93-104(2004)]。因此，有必要对鱼类肾上腺调节的分子机制进行深入研究，并寻找合适的肾上腺激素干扰物的检测方法。

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)属担尼亚科，鮈鲫属，是中国特有的稀有鱼类，分布于四川省汉源县、石棉县、双流县、都江堰市和彭县等地。我国学者对其生物学背景进行了大量研究，发现其不仅具有性成熟周期短，繁殖季节长，连续产卵，温度适应范围广，二氧化碳和溶解氧耐受力高等作为实验鱼类的优良特征，而且在水生化学品毒性测试上有极高的敏感性[Zhong，X.，Xu，Y.，Liang，Y.，Liao，T.，Wang，J.；Zha，J.，Wang，Z.，Wang，N.，Ingersoll，C.Histological alternation and vitellogenin induction in adult rare minnow(Gobiocypris rarus)after exposureto ethynylestradiol and nonylphenol.Chemosphere 66：488-95(2007)]。但在分子生物学和毒理学方面，尤其关于肾上腺系统应激机制方面，仍需要大量的工作。因此，鉴定和检测稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因及其所编码的蛋白，并将其应用于环境内分泌干扰物作用机制研究中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来自稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na⁺/K⁺-ATPase活性的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2自5’末端第1至93位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有Na⁺/K⁺-ATPase活性的蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有Na⁺/K⁺-ATPase活性的蛋白的DNA分子。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

本发明还保护一种辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物的方法，包括如下步骤：

(1)分别在水环境甲和水环境乙中养殖稀有鮈鲫；所述水环境甲为不含有肾上腺激素和肾上腺激素干扰物的水环境；所述水环境乙为待检测水环境；

(2)分别提取步骤(1)的两种水环境中的稀有鮈鲫的总RNA，反转录为cDNA；

(3)分别检测步骤(2)的两种cDNA中所述基因或其片段的含量，如果两者具有显著差异待测水环境中疑似含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物，如果两者没有显著差异待测水环境中疑似不含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物。

如果采用所述水环境乙养殖的稀有鮈鲫的cDNA中所述基因(或其片段)的含量低于采用所述水环境乙甲养殖的稀有鮈鲫的cDNA中所述基因(或其片段)的含量，所述待测水环境中疑似含有肾上腺激素。

如果采用所述水环境乙养殖的稀有鮈鲫的cDNA中所述基因(或其片段)的含量高于采用所述水环境甲养殖的稀有鮈鲫的cDNA中所述基因(或其片段)的含量，所述待测水环境中疑似含有肾上腺激素干扰物。

检测步骤(2)的两种cDNA中所述基因或其片段的含量的方法具体可为荧光定量PCR。所述荧光定量PCR所用的引物具体可为序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。所述肾上腺激素具体可为皮质醇。所述肾上腺激素干扰物具体可为五氯酚。

所述基因、所述引物对可用于辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物。所述肾上腺激素具体可为皮质醇。所述肾上腺激素干扰物具体可为五氯酚。

养殖所述稀有鮈鲫的时间优选为21天。

步骤(1)中被养殖的所述稀有鮈鲫优选为10月龄的稀有鮈鲫。

提取所述总RNA的组织优选为稀有鮈鲫的肾脏组织。

本发明通过运用RT-PCR技术，检测了稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在不同阶段胚胎和幼鱼以及成鱼各组织中的表达，结果表明：稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在受精后1小时即有大量表达，并持续至各个生命阶段，且成鱼各组织中均有较高的表达水平，说明稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在鱼类整个生命周期都有重要作用。

基于稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因，本发明设计了特异引物对。应用特异引物对，采用实时荧光PCR，发现在含有肾上腺激素干扰物的水环境中养殖，稀有鮈鲫的稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的表达量发生了变化，且具有剂量-效应关系，从而所述特异引物对可应用于辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素干扰物。本发明的方法具有简便、快捷、准确的优点。

附图说明

图1为鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase与其他物种相应基因的进化关系。

图2为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在胚胎、幼鱼等不同生命阶段的表达。

图3为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在雌鱼和雄鱼不同器官中的表达。

图4为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase和β-actin基因的荧光定量PCR的标准曲线和溶解曲线。

图5为稀有鮈鲫暴露在不同浓度的皮质醇后肾脏中稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因表达的变化；*表示与对照组有显著差异，P＜0.05。

图6为稀有鮈鲫暴露在不同浓度的五氯酚后肾脏中稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因表达的变化；*表示与对照组有显著差异，P＜0.05。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)：公众可以从中国科学院生态环境研究中心获得；参考文献：Zhong，X.，Xu，Y.，Liang，Y.，Liao，T.，Wang，J.；Zha，J.，Wang，Z.，Wang，N.，Ingersoll，C.Histological alternation and vitellogenin inductionin adult rare minnow(Gobiocypris rarus)after exposure to ethynylestradioland nonylphenol.Chemosphere 66：488-95(2007)。

实施例1、稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase基因的克隆

一、总RNA的提取及cDNA第一链的合成

从孵化后10月龄的稀有鮈鲫成熟个体分离脑组织，迅速放入液氮，研磨成粉末；转移至干净Ep管，使用Trizol试剂(Gibco BRL，Life Technologies，Gaithersburg，MA，美国)提取总RNA；得到的总RNA经DNase I(promega，USA)处理以去除DNA污染。所得总RNA的紫外光吸收测定值A260/A280大于1.8；0.8％甲醛变性胶电泳证实无降解。采用M-MLV反转录酶(promega，USA)合成cDNA第一链。

二、PCR扩增和筛选重组菌

利用Primer Premier 5设计兼并引物，由北京奥科生物技术有限公司合成。

上游引物：5’-GC(C/T)CTG(C/T)TGAA(G/A)TGTAT(T/C)(G/C)A-3’；

下游引物：5’-TggT(g/T)gAgTTgAA(T/G)gg(g/T)AT-3’。

PCR反应扩增目标基因。PCR产物经纯化后连接到pMD 18-T质粒(大连宝生物公司)上，转入感受态大肠杆菌。转化菌涂布于涂有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖)和IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上培养，37℃培养过夜。随机挑取若干白色菌落，接种于2ml含氨苄青霉素(Amp)的液体培养基，37℃振荡培养过夜。用菌落PCR方法检测质粒的插入片段，引物为通用引物SP6和T7，PCR反应条件为：94℃预变性6min，94℃40s，55℃50s，72℃80s，35个循环，72℃延伸8min，4℃保存。PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳确定其插入片段大小。

三、测序

筛选出有差异的阳性克隆委托北京诺赛公司进行测序，得到94bp的序列。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺ATPase，其编码基因如序列表的序列2所示。

采用Clustal X软件将序列表的序列1所示的稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase和Genbank公布的氨基酸序列进行了比对，采用MEGA3软件Identity Matrix计算相同序列的比例。基于氨基酸序列比对文件，采用邻接法(Neighbor joining method，NJ)分析系统发生关系，构建NJ树。图1显示了所克隆的稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase基因片段与其他物种相应基因的进化关系。

实施例2、稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在不同组织、不同生命阶段的表达

一、根据实施例1中所得序列设计特异性引物

上游引物：5’-gCCCTgCTgAAgTgTATgA-3’；

下游引物：5’-TggTggAgTTgAATgggAT-3’。

二、稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在不同生命阶段的表达

1、样品的采集

取受精后2小时、6小时、12小时、24小时、72小时的稀有鮈鲫胚胎及孵化后1天、3天、7天、14天、21天的稀有鮈鲫幼鱼，立即液氮冻存，分别作为待测样本。

2、稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在不同生命阶段的表达

(1)分别提取各个待测样本的总RNA，反转录为cDNA。

(2)以步骤(1)的cDNA为模板，用步骤一设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，35个循环。

将β-actin基因作为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的内参基因，检测内参基因的引物：5’-CAGGGCGTGATGGTGGGGAT-3’；下游引物：5’-GGTTGGCTTTGGGGTTGAG-3’。

取6μL PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统扫描记录图像。结果见图2。图2中，1-6分别为受精后2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、72小时的胚胎，7-11分别为孵化后1天、3天、7天、14天、21天的幼鱼。

三、稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在不同组织的表达

1、样品的采集

取孵化后10月龄的稀有鮈鲫成熟个体(雌鱼或雄鱼)，分离脑、肝脏、性腺、肾脏、鳃、肠、心脏、脾脏组织，立即液氮冻存，分别作为待测样本。

2、稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因在不同组织的表达

方法同步骤二的2。

结果见图3。图3中，1-8分别为雌鱼的脑、肝脏、性腺、肾脏、鳃、肠、心脏、脾脏组织，9-16分别为雄鱼的脑、肝脏、性腺、肾脏、鳃、肠、心脏、脾脏组织。

实施例3、实时定量PCR方法分析基因表达差异

皮质醇(Hydrocortisone)购自上海生化试剂公司。五氯酚(Pentachlorophenol，PCP)购自Chem Service(West chester，PA，美国)。二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)购自Sigma公司(St.Louis，MO，美国)。

实验采用稀有鮈鲫已驯化养殖7年以上，其养殖和暴露水质条件为：经活性碳过滤并曝气的自来水，pH 7.2-7.6，硬度44.0-61.0mg·L^-1(以CaCO₃计)，溶氧不低于7mg·L^-1，水温25±2℃，光照条件为16∶8h(昼∶夜)。饲养期每天投喂小颗粒商品饵料和新孵化的丰年虫(或线虫)早晚各一次，并及时清除多余饵料和排泄物。

一、分组处理

将孵化后10月龄稀有鮈鲫分为7组，每组30尾(性别比1∶1)，采用流水暴露系统养殖21天，水流速为4L/h，暴露母液流速1mL/min。

7组分别采用如下暴露母液：

第一组：由皮质醇、二甲基亚砜和水组成，皮质醇的浓度为5μg·L^-1，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)；

第二组：由皮质醇、二甲基亚砜和水组成，皮质醇的浓度为25μg·L^-1，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)；

第三组：由皮质醇、二甲基亚砜和水组成，皮质醇的浓度为125μg·L^-1，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)；

第四组：由五氯酚、二甲基亚砜和水组成，五氯酚的浓度为0.5μg·L^-1，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)；

第五组：由五氯酚、二甲基亚砜和水组成，五氯酚的浓度为5μg·L^-1，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)；

第六组：由五氯酚、二甲基亚砜和水组成，五氯酚的浓度为50μg·L^-1，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)；

第七组：由二甲基亚砜和水组成，二甲基亚砜的浓度为0.005％(体积百分含量)。

二、制作标准曲线

取第七组的雌鱼和雄鱼各3条，分别采集肾脏组织，混合后提取总RNA，将RNA反转录为cDNA作为标准品。将标准品梯度稀释得到一系列浓度的模板，用实施例2的步骤一设计的引物进行荧光定量PCR，作出标准曲线。将β-actin基因作为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的内参基因。

稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的标准曲线见图4A，溶解曲线见图4B。β-actin基因的标准曲线见图4C，溶解曲线见图4D。两个基因扩展效率相差±5％范围内，说明其扩增是有效扩增；溶解曲线为单一峰值说明产物无非特异性扩增。

三、各个处理组中稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的表达量比较

1、各组分别取3条雄鱼和3条雌鱼，作为重复样本，取每个样本肾脏组织，迅速液氮冻存，分别作为待测样本。

2、提取待测样本的RNA，反转录为cDNA。

3、以反转录的DNA作为模板，用实施例2的步骤一设计的引物进行荧光定量PCR。

反应体系(20μL)：RealMasterMix(2.5×，天根生化)9μL，100nM上游引物1μL，100nM下游引物1μL，1μL cDNA模板和8μL RNase-free H₂O(天根生化)。

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃复性40s，72℃延伸30s，40个循环；95℃变性1min，57℃复性30s，95℃延伸30s；10℃保存。

将β-actin基因作为稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的内参基因。

以第七组的雌鱼肾脏中稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的表达量作为1，计算各组雌鱼和雄鱼肾脏中稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因的相对表达量。

第一组、第二组、第三组和第七组的结果见图5。结果表明，外源性皮质醇的暴露可导致稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因表达受到抑制，说明稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因对肾上腺激素干扰具有较高的敏感性，且具有剂量-效应关系，可用来进行环境内分泌干扰物的早期预警指示。

第四组、第五组、第六组和第七组的结果见图6。结果表明，环境内分泌干扰物五氯酚的暴露导致稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase基因表达水平上调，且具有剂量-效应关系。

Claims

1.一种辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物的方法，包括如下步骤：

（1）分别在水环境甲和水环境乙中养殖稀有鮈鲫；所述水环境甲为不含有肾上腺激素和肾上腺激素干扰物的水环境；所述水环境乙为待检测水环境；

（2）分别提取步骤（1）的两种水环境中的稀有鮈鲫的总RNA，反转录为cDNA；

（3）分别检测步骤（2）的两种cDNA中序列表中序列2自5’末端第1至93位核苷酸所示的DNA分子或序列表中序列2所示的DNA分子的含量，如果两者具有显著差异待测水环境中疑似含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物，如果两者没有显著差异待测水环境中疑似不含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：检测步骤（2）的两种cDNA中序列表中序列2自5’末端第1至93位核苷酸所示的DNA分子或序列表中序列2所示的DNA分子的含量的方法为荧光定量PCR；所述荧光定量PCR所用的引物为由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；所述肾上腺激素为皮质醇；所述肾上腺激素干扰物为五氯酚。

3.如下a或b所述基因在辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物中的应用；

a、序列表中序列2自5’末端第1至93位核苷酸所示的DNA分子；

b、序列表中序列2所示的DNA分子。

4.由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对在辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物中的应用。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述肾上腺激素为皮质醇；所述肾上腺激素干扰物为五氯酚。