CN102757926B

CN102757926B - 一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基

Info

Publication number: CN102757926B
Application number: CN 201210278484
Authority: CN
Inventors: 张灵玲; 许雷; 关雄; 张永嵘
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2032-08-07
Also published as: CN102757926A

Abstract

本发明涉及一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基，由LB、吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯组成，所述吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯的含量分别为：0.2ml-1.6ml、0.2ml-1.2ml、0.2g-1.2g和0.8ml-1.6ml；LB配方为胰蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、氯化钠10.0g，水至1.0L，pH7.0-7.2。吐温20和吐温80作为水包油（O/W）型乳化剂，棕榈酸异丙酯作为油包水（W/O）型乳化剂，能使各种物质在溶液中均匀分散，同时可增强苏云金芽胞杆菌细胞膜通透性；聚乙二醇6000具有良好的水溶性和分散性，可促进菌体充分利用培养基质，同时也能改变细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运。本发明培养基使菌株的紫外辐射耐受能力得到显著提高，从而使田间应用性提高。

Description

一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基

技术领域

本发明涉及一种微生物培养基，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基，属于生物农药技术领域。

背景技术

随着化学农药副作用的日益显著，采用微生物农药途径综合治理病虫害越来越受到人们的重视。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其主要特性在于生长形成芽胞的过程中在胞囊内同时伴随形成杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），该晶体蛋白作为毒杀昆虫的主要活性物质。由于Bt杀虫剂对鳞翅目、双翅目、膜翅目等多种昆虫及动植物寄生线虫有较强的毒杀作用，且具有对人和家畜无毒、不污染环境、不易产生抗药性等优点，因而在全球农、林、卫生害虫防治中被广泛应用。

无论是野生菌株还是工程菌株，微生物农药制剂在田间应用中都易受环境中多种因素而影响其杀虫效果和持效期，其中紫外线辐射是主要的制约因素。紫外线能使生物细胞中活性氧自由基增加，从而导致细胞膜和DNA损伤，迅速钝化微生物。目前提高微生物菌株抵御紫外辐射能力的方法主要有两种方法：一种是通过剂型研究或添加助剂的方法，利用包裹等制剂形式或者通过添加紫外吸收剂和保护剂，以减少紫外线对菌体的直接辐射。但部分紫外保护剂与微生物相容性较差，对生长或孢子萌发有抑制作用，且稳定性差，在日光下易蒸发和分解，易被雨水冲洗掉或被植物叶面吸收而失去保护作用；同时紫外吸收剂大部分为有机化学物质，有些染料和荧光剂甚至是可疑致癌物，对人畜和环境都有一定的负作用。另一种方法是基因调控手段，通过诱导菌体自身表达黑色素或者通过转导黑色素基因，让菌体在生长过程中产生黑色素而提高菌体的抗紫外辐射能力，但存在表达不稳定和成本高等缺点。SOD是一种具有防御氧化损失的金属酶类，它与过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POX)构成生物体内重要的酶促反应防御体系，使超氧阴离子自由基发生歧化反应，保护生物细胞免受超氧自由基的毒害。表面活性剂能改变细胞膜通透性，加快物质传递运输，影响微生物的代谢循环。因此，通过表面活性剂提高胞内酶系活力水平，如SOD、POD和CAT酶，开发能提高Bt抵御紫外辐射能力的乳化培养基，对提高Bt制剂的田间应用效果具有显著的意义，同时避免了成本高，不稳定等负面影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苏云金杆菌乳化发酵培养基，用于提高产品中菌株的紫外辐射抵御能力。

本发明目的通过以下方法实现：

本发明的一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基，其特征在于由LB、吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯组成，所述吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯的含量分别为：0.2 -1.6 ml、0.2 -1.2 ml、0.2 -1.2 g和 0.8-1.6 ml；吐温20、吐温80和棕榈酸异丙酯为液体，聚乙二醇6000、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠为固体，均为化学纯。所述LB为 Luria-Bertani培养基，配方为胰蛋白胨 10.0 g、酵母粉 5.0 g、氯化钠 10.0 g，水至1.0 L，pH 7.0-7.2。

将上述苏云金芽胞杆菌液态发酵培养基灭菌后接入苏云金芽胞杆菌营养期细胞，接种量1.0%-2.0%（v/v），培养温度28-30℃，转速120-150 rpm，发酵时间10 -15 h，即可发酵成苏云金芽胞杆菌液态悬浮剂。

本发明的技术原理及其优点是：吐温20和吐温80作为水包油（O/W）型乳化剂，棕榈酸异丙酯作为油包水（W/O）型乳化剂，能使各种物质在溶液中均匀分散，同时可增强苏云金芽胞杆菌细胞膜通透性，影响菌体胞内物质浓度和活性；聚乙二醇6000具有良好的水溶性和分散性，可促进菌体充分利用培养基质，同时也能改变细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运。由本发明的培养基发酵制成的产品在形态和使用上与常规培养基发酵的制剂无明显差异，但产品中菌株的紫外辐射耐受能力得到显著提高，从而使田间应用性提高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

本发明的一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基由LB、吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯组成，各原料配比试验结果如表１所示。

根据单组分对苏云金芽胞杆菌发酵的影响，本发明测定7组试验产品的含菌量和紫外辐射后菌体存活率。

表1 苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基及发酵效果

注：发酵菌株为苏云金芽胞杆菌8010，商业菌株，由市场购得；营养期菌种接种量为1.0%（V/V），培养温度30℃，转速120 rpm，发酵时间12 h；菌体量的测定方法为：在波长600 nm下测定菌体水悬浮液的光密度值；存活率测定方法为：各组菌体水悬浮液于紫外辐射仪中照射，强度为5.0 J/cm²，然后加入MTT溶液，终浓度1.0 mg/ml，45℃反应0.5 h，离心去上清，加入异丙醇，反应1 h后取上清，于波长560 nm下测定吸光值，与各组未辐射组比较并计算存活率(存活率=辐射组吸光值/未辐射组吸光值×100%)。

如表1所示，7组试验中各组发酵产品的含菌量水平基本一致；与0号组（对照组）相比，其余各组在紫外辐射后产品菌株的存活率均显著提高（p<0.05），其中5号组产品的菌株存活率最高。

实施例1：一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基

一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基由LB、吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯组成，所述吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯的含量分别为1.2 ml、1.2 ml、0.4 g和1.6 ml。

本发明的苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基的使用方法：

1、摇瓶发酵：往本发明的苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基中接入苏云金芽胞杆菌营养期细胞，接种量1%（V/V），发酵温度30℃，转速120 rpm，发酵时间12 h。

2、发酵罐发酵：按10%的接种量（V/V）将苏云金芽胞杆菌营养期菌体接种到装有本发明苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基的发酵罐中，发酵条件为：罐温30℃，罐压0.05 MPa，通气量1:1.0（V/V/min），搅拌速度120 rpm，发酵时间12 h。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基，其特征在于由LB、吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯组成，所述LB的含量为1 L；吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯的含量分别为：0.2 ml-1.6 ml、0.2 ml-1.2 ml、0.2 g-1.2 g和 0.8 ml-1.6 ml；LB为 Luria-Bertani培养基，配方为胰蛋白胨 10.0 g、酵母粉 5.0 g、氯化钠 10.0 g，水至1.0 L，pH 7.0-7.2。

2.根据权利要求1所述的一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基，其特征在于所述吐温20、吐温80、聚乙二醇6000和棕榈酸异丙酯的含量分别为1.2 ml、1.2 ml、0.4 g和1.6 ml。